枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶发酵条件优化

卢超*,陈景鲜,王国霞,陈刚,李春阁,王会鱼

(郑州师范学院 生命科学学院,河南 郑州,450044)

摘 要 该文对枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶的发酵培养基和发酵条件进行了优化。通过单因素实验探究蔗糖、蛋白胨、吐温-80、MgSO4、初始pH、接种量、发酵时间和发酵温度这8个因子对枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶的影响。利用Plackett-Burman实验进行筛选,确定主要显著影响因子为蛋白胨、MgSO4和接种量。最陡爬坡实验确定下一步响应面实验的中心点为接种量13 mL/100mL、蛋白胨含量15 g/100mL,MgSO4含量0.4 g/100mL。最后通过Box-Behnken实验确定最佳发酵条件是蔗糖10 g/100mL、蛋白胨15.3 g/100mL、吐温-80 0.2 mL/100mL、初始pH 6.8、MgSO4 0.39 g/100mL、接种量13.4 mL/100mL、发酵温度32 ℃、发酵时间44 h,在此发酵条件下理论预测枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶酶活力为401.005 U/mL,实测值达到401.83 U/mL,比最初优化前133.42 U/mL提高了2.01倍。

关键词 枯草芽孢杆菌;中性蛋白酶;发酵;优化;响应面

蛋白酶根据其最适pH可分为酸性、中性和碱性3种,因此,中性蛋白酶是一类能够在pH=6.5~7.5的环境中催化蛋白质发生水解,产生游离氨基酸和多肽片段的酶的总称[1-3]。中性蛋白酶是很早就在工业生产中使用的蛋白酶类,广泛应用于食品、饲料、医药、洗涤、化妆品、纺织等行业[4-7]。中性蛋白酶的广泛使用是由于其作为天然生物酶制剂,具有催化条件温和,催化速率高,无工业污染等特点,与一般的化学添加剂相比,对人和动物更加安全可靠[8]。目前,生产中性蛋白酶的微生物主要包括细菌、霉菌、酵母和放线菌等[9]

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类需氧型的革兰氏阳性菌,在土壤、海洋、动物、植物中广泛存在[10]。同时,枯草芽孢杆菌具有易于存活、生长繁殖快,无致病性的特点,能够分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶等十几种酶[11-15]。因此,枯草芽孢杆菌在改善肠道菌群、调节免疫力、促进植物生长、改善脂类代谢等方面都有广泛应用[16-18]。本实验室前期分离出1株具有高产中性蛋白酶潜力的枯草芽孢杆菌L07,本实验主要对枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶的能力进行考察,以碳源、氮源、吐温-80、初始pH、MgSO4、种子液添加量、发酵温度、发酵时间为条件进行单因素实验分析,再通过Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和Box-Behnken实验响应面分析,最终确定枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶的最优发酵条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L07由本实验室前期筛选并保藏,实验所用试剂为市售分析纯。

种子培养基(g/100mL):NaCl 1、牛肉膏1、蛋白胨1,pH 7.0,高温高压灭菌后在30 ℃条件下振荡培养到A600=1.0为制备种子液;

基础发酵培养基(g/100mL):蔗糖5、蛋白胨5、MgSO40.1、吐温-80 0.1 mL/100mL、pH 6.8,高温高压灭菌后加入种子液3 mL/100mL,在30 ℃环境下振荡培养36 h。

1.2 实验方法

1.2.1 中性蛋白酶酶活力的测定

各组发酵结束后,4 ℃离心取上清,即得待测发酵粗酶液。参考GB/T 23527—2009,采用Folin-酚法进行蛋白酶酶活力的测定[19-21]。在pH 7.2、40 ℃的条件下1 mL粗酶液1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸定义为1个活力单位(U),以U/mL表示,如公式(1)所示:

中性蛋白酶活力(U/mL)=A×N×4/10

(1)

式中:A为由吸光度对应的酪氨酸微克数;4为反应总体积;10为反应时长;N为稀释倍数。

1.2.2 单因素实验分析

1.2.2.1 蔗糖、蛋白胨添加量对菌种产中性蛋白酶的影响

分别在编号1~7的7个新配置基础培养基中加入终质量浓度为8、10、12、14、16、18、20 g/100mL的蔗糖溶液,其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养,发酵结束后进行酶活力测定。

分别在编号1~7的7个新配置基础培养基中加入终质量浓度为6、9、12、15、18、21、24 g/100mL的蛋白胨,其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养,发酵结束后进行酶活力测定。

1.2.2.2 吐温-80、初始pH对菌种产中性蛋白酶的影响

分别在编号1~7的7个新配置基础培养基中加入终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL/100mL的吐温-80,其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养,发酵结束后进行酶活力测定。

分别将编号1~7的7个新配置基础培养基调整初始pH至6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8,其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养,发酵结束后进行酶活力测定。

1.2.2.3 MgSO4、种子液添加量对菌种产中性蛋白酶的影响

分别在编号1~7的7个新配置基础培养基中加入终质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/100mL的MgSO4,其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养,发酵结束后进行酶活力测定。

分别在编号1~7的7个新配置基础培养基中加入终浓度为3、5、7、9、11、13、15 mL/100mL的种子培养液,其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养,发酵结束后进行酶活力测定。

1.2.2.4 发酵温度、发酵时间对菌种产中性蛋白酶的影响

配制编号1~7的7个新配置基础培养基,分别置于30、32、34、36、38、40、42 ℃条件下进行培养,其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养,发酵结束后取培养液进行酶活力测定。

配制编号1~7的7个新配置基础培养基,分别培养40、44、48、52、56、60、64 h,其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养,发酵结束后取培养液进行酶活力测定。

1.2.3 Packett-Burman实验分析

根据单因素试验结果,采用Packett-Burman设计法,对蔗糖(A)、蛋白胨(B)、吐温-80(C)、初始pH(D)、MgSO4(E)、接种量(F)、发酵温度(G)、发酵时间(H)这8个影响菌种产中性蛋白酶的实验因素进行探究,从中确定出3个相对较显著的影响因子,以便进行下一步实验。这8个影响因子分别取高低2个水平,以发酵液的中性蛋白酶活力为单一响应值,Packett-Burman实验设计的因子和水平如表1所示。

1.2.4 最陡爬坡实验分析

根据上一步Packett-Burman实验结果筛选得出的3个显著因子,参考各个显著因子的正负效应值,确定最陡爬坡实验的适当步长。以最陡爬坡实验结果的最大响应值作为下一步Box-Behnken实验分析的中心点。

1.2.5 Box-Behnken实验分析

根据Packett-Burman实验筛选得出的3个显著因子,最陡爬坡实验得出3个显著因子的质量浓度范围,利用Design-Expert 8.0.5软件进行Box-Behnken实验设计和数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 蔗糖、蛋白胨添加量对菌种产中性蛋白酶的影响

碳源在微生物的生长过程中普遍发挥着重要的作用,而氮源添加量则对微生物合成蛋白质和产酶有重要影响。本实验选择蔗糖作为碳源、蛋白胨作为氮源,两者添加量对菌种产中性蛋白酶的影响如图1所示。由图1可知,当蔗糖的添加量从8 g/100mL上升到16 g/100mL时,枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现缓慢上升的趋势,而在培养基中蔗糖含量在16~20 g/100mL阶段时,出现了相对明显的下降。当蛋白胨的添加量从6 g/100mL上升到15 g/100mL时,枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现明显上升的趋势,而在培养基中蔗糖含量在15~24 g/100mL阶段时,出现了明显的下降。

图1 蔗糖和蛋白胨添加量对产酶的影响

Fig.1 Effects of sucrose and peptone on protease production

2.1.2 吐温-80、初始pH对菌种产中性蛋白酶的影响

吐温-80作为微生物发酵常见的表面活性剂,可能在调节细胞膜的通透性上有积极的作用。吐温-80、初始pH对菌种产中性蛋白酶的影响如图2所示。当吐温-80的添加量从0.1 mL/100mL上升到0.4 mL/100mL时,枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现缓慢上升的趋势,而随着吐温-80在培养基中含量增高,培养基中酶活力出现了相对明显的下降。而当培养基中的初始pH从6.6调整到7.8的过程中,枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现一个起伏的趋势。

图2 吐温-80和初始pH对产酶的影响

Fig.2 Effects of Tween-80 and initial pH on protease production

2.1.3 MgSO4、种子液添加量对菌种产中性蛋白酶的影响

无机盐可以调节微生物的生长过程中细胞膜的渗透压,而Mg2+作为许多蛋白酶的辅助因子,对维持酶的催化性有重要作用。由图3可知,当MgSO4的添加量从0.2 g/100mL上升到0.4 g/100mL时,枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现上升的趋势,而在培养基中MgSO4含量继续增加到1.4 g/100mL时,培养基中酶活力出现了相对明显的下降。当培养基中的种子液含量从3 mL/100mL上升到13 mL/100mL时,枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现持续上升的趋势,而在培养基中种子培养液继续增加到15 mL/100mL,酶活力下降。

图3 MgSO4和接种量对产酶的影响

Fig.3 Effects of MgSO4 and inoculation volume on protease production

2.1.4 发酵温度、发酵时间对菌种产中性蛋白酶的影响

发酵温度和发酵时间能够影响微生物的动态生长过程和代谢过程。由图4可知,当发酵温度从30 ℃上升到38 ℃的时候,枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现缓慢上升的趋势,发酵温度继续升到42 ℃的时候,酶活力出现了相对较快下降。当发酵时间从40 h持续增加到60 h期间,枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现持续上升的趋势,继续发酵到64 h时,发酵

图4 发酵温度和发酵时间对产酶的影响

Fig.4 Effects of fermentation time and temperature on protease production

液中酶活力下降。

2.2 Packett-Burman实验结果

根据单因素试验结果,利用Minitab 17软件进行Packett-Burman实验设计。Packett-Burman实验设计和实验结果如表1所示,Packett-Burman实验结果分析如表2所示。

表1 Plackett-Burman实验设计和结果

Table 1 Design and results of Plackett-Burman test

实验序号A/[g·(100mL)-1]B/[g·(100mL)-1]C/[mL·(100mL)-1]D(—)E/[g·(100mL)-1]F/[mL·(100mL)-1]G/℃H/h中性蛋白酶活力/(U·mL-1)116(+1)9(-1)0.4(+1)6.8(-1)0.4(-1)7(-1)38(+1)60(+1)131.684210(-1)15(+1)0.2(-1)7.4(+1)0.8(+1)7(-1)38(+1)44(-1)119.401316(+1)9(-1)0.4(+1)7.4(+1)0.8(+1)7(-1)38(+1)60(+1)121.846410(-1)9(-1)0.2(-1)7.4(+1)0.8(+1)13(+1)32(-1)60(+1)170.826510(-1)15(+1)0.4(+1)6.8(-1)0.8(+1)7(-1)32(-1)44(-1)107.659610(-1)9(-1)0.2(-1)6.8(-1)0.4(-1)7(-1)32(-1)44(-1)91.165710(-1)15(+1)0.4(+1)7.4(+1)0.4(-1)13(+1)38(+1)44(-1)230.485816(+1)15(+1)0.4(+1)6.8(-1)0.8(+1)13(+1)32(-1)60(+1)192.907916(+1)15(+1)0.2(-1)7.4(+1)0.4(-1)7(-1)32(-1)60(+1)170.4611016(+1)9(-1)0.2(-1)6.8(-1)0.8(+1)13(+1)38(+1)44(-1)132.2551116(+1)9(-1)0.4(+1)7.4(+1)0.4(-1)13(+1)32(-1)44(-1)186.4371210(-1)15(+1)0.2(-1)6.8(-1)0.4(-1)13(+1)38(+1)60(+1)266.137

对表1所列的Packett-Burman实验结果进行方差分析得到回归模型方程:Y=160.11-4.58 A+21.07 B+1.73 C+6.47 D-19.29 E+36.40 F+6.86 G+15.54 H。该模型R2=0.985 3,说明模型显著,拟合良好。根据表2所列的方差分析结果可知,8个影响因子的显著性排序为F(接种量)>B(蛋白胨)>E(MgSO4)>H(发酵时间)>G(发酵温度)>D(初始pH)>A(蔗糖)>C(吐温-80),且F(接种量)、B(蛋白胨)、E(MgSO4)3个因子的添加量在8个因子中最显著。因此确定接种量、蛋白胨、MgSO4这3个因子进行下一步的最陡爬坡实验。

表2 Plackett-Burman实验结果显著性分析

Table 2 Significance test of factors for Plackett-Burman test

项效应系数T值P值显著性排序常量160.1145.380.000A-9.16-4.58-1.300.2857B42.1421.075.970.0092C3.461.730.490.6578D12.946.471.830.1646E-38.58-19.29-5.470.0123F72.8036.4010.320.0021G13.736.861.940.1475H31.0815.544.400.0224

2.3 最陡爬坡实验分析

根据表1的Packett-Burman实验结果,在最陡爬坡实验中将4个不显著因子维持相对较低水平。对于Packett-Burman实验筛选得出的接种量、蛋白胨和MgSO43个最显著因子,参考这3个因子的效应值可知,接种量和蛋白胨含量对产酶的影响为正效应,MgSO4含量对产酶的影响为负效应。因此在最陡爬坡实验中需要逐步升高接种量和蛋白胨含量,降低MgSO4的含量。

最陡爬坡实验结果如表3所示,随着接种量、蛋白胨和MgSO4三个因子在发酵液中含量的变化,枯草芽孢杆菌L07产酶呈现先上升后下降的趋势。最陡爬坡实验中最优实验结果为第4组,即接种量为13 mL/100mL、蛋白胨质量浓度为15 g/100mL,MgSO4质量浓度为0.4 g/100mL,以此质量浓度为中心点进行下一步Box-Behnken实验分析。

表3 最陡爬坡实验设计和结果

Table 3 Design and results of steepest ascent experiment

实验序号接种量/[mL·(100mL)-1]蛋白胨/[g·(100mL)-1]MgSO4/[g·(100mL)-1]中性蛋白酶活力(U·mL-1)1791.0273.5429110.8322.13311130.6356.82413150.4398.52515170.2381.37617190.1360.27

2.4 Box-Behnken实验分析

根据前面Packett-Burman实验筛选得出的3个显著因子,最陡爬坡实验得出3个显著因子的浓度范围,利用Design-Expert 8.0.5软件进行Box-Behnken实验设计和数据分析,结果如表4、5所示。

表4 Box-Behnken实验设计和结果

Table 4 Design and results of Box-Behnken experiment

实验序号接种量/[mL·(100mL)-1]蛋白胨/[g·(100mL)-1]MgSO4/[g·(100mL)-1]中性蛋白酶活力/(U·mL-1)实验序号接种量/[mL·(100mL)-1]蛋白胨/[g·(100mL)-1]MgSO4/[g·(100mL)-1]中性蛋白酶活力/(U·mL-1)113(0)15(0)0.4(0)397.851011(-1)17(+1)0.4(0)364.79213(0)17(+1)0.2(-1)369.731113(0)15(0)0.4(0)399.55313(0)15(0)0.4(0)401.251211(-1)15(0)0.2(-1)357.84413(0)17(+1)0.6(+1)371.331313(0)15(0)0.4(0)398.38511(-1)15(0)0.6(+1)351.191413(0)15(0)0.4(0)396.94615(+1)17(+1)0.4(0)372.051513(0)13(-1)0.2(-1)358.87715(+1)13(-1)0.4(0)368.881613(0)13(-1)0.6(+1)352.16815(+1)15(0)0.6(+1)365.491711(-1)13(-1)0.4(0)350.95915(+1)15(0)0.2(-1)374.89

对表4的Box-Behnken实验结果进行分析可得回归模型方程:Y=398.79+7.07 A+5.88 B-2.64 C-2.67 AB-0.69 AC+2.08 BC-17.65 A2-16.98 B2-18.79 C2。模型和表5中A代表接种量,B代表蛋白胨,C代表MgSO4Y代表预测的中性蛋白酶活力。由表5的方差分析结果可知,该模型显著,失拟项不显著。模型的R2=0.990 2,校正后信噪比=24.035>4,以上数据表明该模型拟合程度较好,误差较小,在设计区间内能准确预测响应值(中性蛋白酶活力)的变化。

表5 回归模型的方差分析结果

Table 5 Analysis results of the regression model

方差来源平方和自由度均方F 值P 值方差来源平方和自由度均方F 值P 值模型5 262.869584.7678.72< 0.000 1A21 311.4111 311.41176.55< 0.000 1A399.61399.653.790.000 2B21 213.7311 213.73163.4< 0.000 1B276.61276.637.240.000 5C21 487.111 487.1200.2< 0.000 1C55.97155.977.530.028 7残差5277.43AB28.46128.463.830.091 2失拟项40.89313.634.910.079 1AC1.8911.890.250.629 4纯误差11.142.78BC17.26117.262.320.171 2合计5 314.8616

通过Design-Expert 8.0.5软件得到接种量、蛋白胨和MgSO4含量3个因子之间的模型响应曲面图如图5所示。由图5可知,当蛋白胨含量一定时,随着种子液含量升高,发酵液中性蛋白酶活力呈现先增高后降低的趋势,这可能是由于随着菌体的生长繁殖,培养基中的营养成分消耗在加速,同时溶氧供应不足从而影响了中性蛋白酶的合成。此外,大量菌体分泌代谢产物的迅速增多可能会导致反馈抑制。当接种量一定时,适当的Mg2+能够增加菌体细胞膜的通透性和渗透压,有利于中性蛋白酶的合成和释放,而当无机盐离子质量浓度过高时,可能会影响菌体的正常生长代谢。同时,蛋白胨为枯草芽孢杆菌L07的产酶提供了重要的氮源,而当蛋白胨在发酵液中超过一定质量浓度的时候,可能会影响发酵液的通透性和溶氧量,从而影响菌种的产酶。综上所述,根据建立的数学模型分析,3个影响因子在A=0.19、B=0.15、C=-0.065时,有最佳产酶响应值。换算为接种量在13.4 mL/100mL、蛋白胨含量在15.3 g/100mL、MgSO4含量在0.39 g/100mL条件下,此时枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶活力值预测将达到401.005 U/mL。

a-接种量和蛋白胨对中性蛋白酶活力的影响;b-接种量和MgSO4对中性蛋白酶活力的影响;c-蛋白胨和MgSO4对中性蛋白酶活力的影响图5 各因素对产酶影响的响应曲面图

Fig.5 Response surface for the factors on protease production

为了验证该模型的准确性和实用性,按照上述的预测发酵条件进行3次平行实验验证,结果测得枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶活力分别为402.13、401.25、401.83 U/mL。3次平行实验验证的平均值为401.74 U/mL,与理论预测值401.005 U/mL非常贴近,说明该模型有良好的准确性和实用性。

3 结论

本文通过单因素实验、Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和响应面Box-Behnken实验设计对枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶的发酵条件进行优化。得到最佳发酵条件为蔗糖10 g/100mL、蛋白胨15.3 g/100mL、吐温-80为0.2 mL/100mL、初始pH 6.8、MgSO4 0.39 g/100mL、接种量13.4 mL/100mL、发酵温度32 ℃、发酵时间44 h,在此发酵条件下理论预测枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶酶活力为401.005 U/mL,实测值达到401.83 U/mL,比最初优化前133.42 U/mL提高了2.01倍。

参考文献

[1] 宁跃龙,魏玉娟,赵尚,等.中性蛋白酶1398在羊毛洗毛工艺中的应用[J].毛纺科技,2019,47(4):26-29.

[2] 桂丽,孙谧,刘均忠,等.中性蛋白酶发酵液脱色工艺优化[J].食品与发酵工业,2016,42(8):92-96.

[3] 凌德娣,周亚楠,黄昕畑,等.中性蛋白酶提取植脂末油脂工艺的研究[J].中国油脂,2018,43(8):119-121.

[4] FONTENOT K R, EDWARDS J V, HALDANE D, et al. Designing cellulosic and nanocellulosic sensors for interface with a protease sequestrant wound-dressing prototype: Implications of material selection for dressing and protease sensor design[J]. Journal of Biomaterials Applications,2017,32(5):622-637.

[5] 朱瀛,赵改名,柳艳霞,等.中性蛋白酶水解鸡骨泥制备短肽工艺优化[J].农业工程学报,2016,32(12):309-314.

[6] 刘进杰,岳思涵,邹宁,等.中性蛋白酶水解螺旋藻制备抗氧化肽的工艺研究[J].食品工业,2018,39(11):27-31.

[7] BACON C W, HINTON D M, MITCHELL T R, et al. Characterization of endophytic strains of Bacillus mojavensis and their production of surfactin isomers[J]. Biological Control, 2012, 62(1):1-9.

[8] 余茜.米曲霉中性蛋白酶的分离纯化及Cu2+对其酶学性质的影响[D].雅安:四川农业大学,2018.

[9] 张晓燕,国立东,刘晓艳.枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的研究进展[J].中国酿造,2018,37(4):12-15.

[10] KAZUNOBU O, MASAHITO H, XIA Z, et al. A newly derived protein from Bacillus subtilis natto with both antithrombotic and fibrinolytic effects[J]. Journal of Pharmacological Sciences,2005,99(3):247-251.

[11] 李洪康,李由然,李赢,等.枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化[J].食品与发酵工业,2016,42(5):102-107.

[12] 王晓阁.枯草芽孢杆菌研究进展与展望[J].中山大学研究生学刊(自然科学·医学版),2012,33(3):14-23.

[13] WANG H,YANG L,PING Y H, et al. Engineering of a Bacillus amyloliquefaciens strain with high neutral protease producing capacity and optimization of its fermentation conditions[J]. PLoS One,2016,11(1):e0146 373.

[14] 张若兰,刘庆国,王敏,等.枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在酿酒酵母中的表达和应用[J].食品与发酵工业,2018,44(7):76-81.

[15] 于平,吴赟婷,杨柳贞,等.蜡样芽孢杆菌高产新型中性蛋白酶发酵条件的优化[J].中国食品学报,2020,20(1):109-117.

[16] 刘文龙,刘胜利,王兴吉,等.枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化[J].化学与生物工程,2019,36(1):47-52.

[17] 张咪,钱静亚.脉冲磁场诱变结合发酵条件优化提高中性蛋白酶产量的研究[J].包装与食品机械,2019,37(3):5-7;18.

[18] 蒋宝莹,裘娟萍,孙东昌.芽胞杆菌基因敲除技术及其在工农业应用中的研究进展[J].食品与发酵工业,2016,42(5):264-271.

[19] GB 23527 —2009蛋白酶制剂[S].北京:中国国家标准化管理委员会,2009.

[20] DAI L, LI J, YANG J, et al. Promiscuous glycosyltransferase from Bacillus subtilis 168 for the enzymatic synthesis of novel protopanaxatriol-type ginsenosides[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2018, 66(4):943-949.

[21] 吴俊.分光光度法测定中性蛋白酶活力的不确定度分析[J].现代食品科技,2011,27(8):1 049-1 051.

Optimization of fermentation conditions for the production of neutral protease by Bacillus subtilis L07

LU Chao*,CHEN Jingxian,WANG Guoxia,CHEN Gang,LI Chunge,WANG Huiyu

(School of Life Science, Zhengzhou Normal University, Zhengzhou 450044, China)

ABSTRACT The fermentation conditions of neutral protease production by Bacillus subtilis L07 were optimized in this study. The effects of sucrose, peptone, Tween-80, MgSO4, initial pH, inoculation amount, fermentation time and temperature on the neutral protease production were investigated by single factor experiments. Using Plackett-Burman experiment, the main significant factors were identified as peptone, magnesium sulfate and inoculation amount. The steepest ascent experiment determined the center point of the next response surface experiment was 13 mL/100mL of inoculation, 15 g/100mL of peptone, and 0.4 g/100mL of MgSO4. Finally, the optimal fermentation conditions were determined through Box-Behnken experiments: sucrose 10 g/100mL, peptone 15.3 g/100mL, Tween-80 0.2 mL/100mL, initial pH 6.8, MgSO4 0.39 g/100mL, inoculation volume 13.4 mL/100mL, and cultured for 44 h at 32 ℃. Under these fermentation conditions, the neutral protease activity was increased from 133.32 U/mL to 401.83 U/mL.

Key words Bacillus subtilis; neutral protease; fermentation; optimization; response surface

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023566

引用格式:卢超,陈景鲜,王国霞,等.枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶发酵条件优化[J].食品与发酵工业,2020,46(16):148-153.LU Chao,CHEN Jingxian,WANG Guoxia, et al. Optimization of fermentation conditions for the production of neutral protease by Bacillus subtilis L07[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(16):148-153.

第一作者:博士,讲师(本文通讯作者,E-mail:chaoluzznu@163.com)

基金项目:郑州师范学院本科教学改革项目(2019ZSJG006Z);郑州师范学院2019年度大学生创新实验计划项目(DCY2019003)

收稿日期:2020-02-10,改回日期:2020-03-29