胶原蛋白是脊椎动物的主要结构蛋白，广泛分布于动物结缔组织、韧带、跟腱等，约占生物体自身总蛋白含量的30%，皮肤干重的3/4[1]。同时，参与细胞的增殖、分化与迁移，使骨、腱、软骨和皮肤具有一定机械强度[2]。因具有其他合成材料无法比拟的生物相容性、可生物降解性以及可大规模生产的可行性等优点，胶原蛋白广泛应用于健康食品、化妆品、生物材料和医药工业[3-5]。
目前，胶原蛋白的生产方法主要有：传统提取法、化学合成法、现代生物技术生产法[6-7]。传统提取法和化学合成法所获得的胶原蛋白活性较低，且带有安全隐患[8-9]。与动物来源的胶原蛋白相比，重组胶原蛋白具有更强的生物学活性、安全性、亲水性、可加工性和低免疫原性的特点[10-13]。已有多种通过基因工程技术生产重组人源性胶原蛋白的研究，涉及大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、转基因作物、转基因小鼠等不同表达体系。因哺乳动物细胞、昆虫细胞、转基因小鼠等表达体系成本高、周期长，难以满足产业化需求，相比之下酵母和大肠杆菌表达系统具有成本低、速度快、技术相对简单、可进行高密度发酵等优点，是工业化生产的首选方式。
本研究利用酵母分泌表达获得重组人Ⅲ型胶原蛋白发酵液，以盐析沉淀和阳离子柱层析结合的方法，纯化出高纯度的重组人Ⅲ型胶原蛋白。该纯化工艺简便、稳定可靠，为其后续开发生产奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
重组人Ⅲ型胶原蛋白发酵液，由本实验室生产；XK 16/20层析柱、Capto SP impress(Capto SP)、SP Sepharose High Performance(强阳离子交换层析柱, SP HP)填料，GE healthcare公司；Cellufine MAX S-h(MAX S-h)、JNC corporation、SP Beads 6 FF，常州天地人和；重组人Ⅲ型胶原蛋白兔多抗，武汉博士德生物工程有限公司；驴抗兔HRP标记二抗，北京博奥森公司；其余化学试剂，成都市科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
AKTA pure System层析系统，GE healthcare公司；高速冷冻离心机，湖南湘仪仪器有限公司；电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；pH计，METTLER TOLEDO公司；电泳仪，BIO-RAD公司。
1.3 试验方法
1.3.1 重组人Ⅲ型胶原蛋白发酵液盐析
取离心过滤后发酵液，缓慢加入饱和硫酸铵，使其硫酸铵饱和度分别为15%、20%、30%。于室温下放置10 min，5 000 r/min离心3min，分别收集上清液及沉淀，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)检测。
1.3.2 重组人Ⅲ型胶原蛋白阳离子交换层析缓冲条件筛选
配制pH为5.5的20 mmol/L柠檬酸盐缓冲液，pH为6.0和6.5的20 mmol/L磷酸缓冲液(phosphate buffer，PB)，pH为8.0的20 mmol/L Tris缓冲液，分别以SP Beads 6F填料进行层析纯化。收集各步骤样品，进行SDS-PAGE检测。
1.3.3 重组人Ⅲ型胶原蛋白阳离子交换层析填料筛选
以20 mmol/L PB(pH 6.0)缓冲液，分别用Capto SP impress、MAX S-h、SP Beads 6FF、SP HP填料进行柱层析。收集各步骤样品，进行SDS-PAGE检测。
1.3.4 重组人Ⅲ型胶原蛋白阳离子交换层析洗脱条件摸索及验证
以20 mmol/L PB(pH 6.0)平衡阳离子交换层析柱，上样再平衡后，以NaCl浓度梯度进行洗脱，分步收集洗脱样品，进行SDS-PAGE电泳检测。确定最佳洗脱条件后，以该条件进行至少2次验证实验。
2 结果与分析
2.1 重组人Ⅲ型胶原蛋白硫酸铵盐析结果
为降低层析上样时间，采用盐析法沉降重组人Ⅲ型胶原蛋白，再以超纯水复溶，从而起到浓缩的作用，并对样品进行初步纯化。如图1所示，当硫酸铵饱和度达到20%时，发酵液开始出现沉淀，但沉淀不完全；当饱和度达到30%时，上清中重组人Ⅲ型胶原蛋白几乎完全沉淀。因此，后续纯化对样品的初处理采用30%饱和度的硫酸铵以沉淀并浓缩重组人Ⅲ型胶原蛋白。
M-蛋白质分子质量标准；1-发酵液上清；2-15%饱和度硫酸铵盐析上清；3、 4-20%饱和度硫酸铵盐析上清；5、 6-30%饱和度硫酸铵盐析上清图1 重组人Ⅲ型胶原蛋白硫酸铵盐析电泳图
Fig.1 SDS-PAGE of ammonium sulfate salting out results of recombinant human type Ⅲ collagen
2.2 pH对重组人Ⅲ型胶原蛋白阳离子交换层析的影响
利用不同的缓冲体系，对重组人Ⅲ型胶原蛋白在pH为5.5、6.0、6.5、8.0时进行阳离子交换层析的捕获情况进行研究。层析填料：MAX SH;样品：发酵液以30%饱和度硫酸铵盐析，沉淀用超纯水复溶后，对相应pH缓冲液透析;洗脱条件：0～1 mol/L NaCl线性梯度洗脱，出峰后分步收集。层析结果如图2所示，在碱性条件下，重组人Ⅲ型胶原蛋白未被捕获，而在酸性条件时，可被阳离子交换柱捕获。其中，pH为6.0时，流穿中重组人Ⅲ型胶原蛋白量最少，重组人Ⅲ型胶原蛋白损失最小。因此，选用pH 6.0的缓冲条件进行重组人Ⅲ型胶原蛋白的纯化。
M-蛋白质分子质量标准；1-上样前样品；2-层析穿透；3～13-分步收集样品A-pH 5.5柠檬酸盐缓冲液阳离子柱层析结果；B-pH 6.0磷酸盐缓冲液阳离子柱层析结果；C-pH 6.5磷酸盐缓冲液阳离子柱层析结果；D-pH 8.0 Trise缓冲液阳离子柱层析结果;图2 pH对重组人Ⅲ型胶原蛋白阳离子交换层析的影响
Fig.2 Effect of pH on cation exchange chromatography of recombinant human type Ⅲ collagen
2.3 阳离子交换层析填料的筛选
在研究了重组人Ⅲ型胶原蛋白最适捕获缓冲体系后，在该体系下进行适宜的阳离子交换填料的筛选。结果如图3所示，在pH 6.0的缓冲体系中，重组人Ⅲ型胶原蛋白与4种阳离子交换填料都能结合。其中MAX S-h和SP HP填料的分辨率高，对重组人Ⅲ型胶原蛋白的分离效果好，但是MAX S-h载量低，因此采用SP HP填料进行后续研究。
M-蛋白质分子量标准；1-上样前样品；2-层析穿透；3～16-分步收集样品A-重组人Ⅲ型胶原蛋白MAX S-h柱纯化结果；B-重组人Ⅲ型胶原蛋白SP beads 6FF柱纯化结果；C-重组人Ⅲ型胶原蛋白Capto SP柱纯化结果；D-重组人Ⅲ型胶原蛋白SP HP柱纯化结果图3 不同阳离子交换层析填料对重组人Ⅲ型胶原蛋白的分离
Fig.3 Separation of recombinant human type Ⅲ collagen with different cation exchange chromatography
2.4 重组人Ⅲ型胶原蛋白阳离子交换层析洗脱条件优化
在pH为6.0缓冲条件下，以SP HP阳离子交换层析对重组人Ⅲ型胶原蛋白进行纯化，并对洗脱条件进行研究。上样后，以0～1 mol/L NaCl线性梯度洗脱。结果如图4所示，分析纯化图谱A和电泳图B、C，洗脱峰p1、p3、p4的NaCl浓度分别为52、150、250 mmol/L。250 mmol/L NaCl洗脱的p4，为高纯度重组人Ⅲ型胶原蛋白。
A-重组人Ⅲ型胶原蛋白SP HP纯化层析图；B、 C-重组人Ⅲ型胶原蛋白SP HP纯化电泳图图4 SP HP阳离子交换层析柱线性梯度洗脱结果
Fig.4 Results of linear gradient elution in SP HP cation exchange chromatography
注：泳道上的数字为分步收集样品编号
根据上述结果，采用52、150、250 mmol/L NaCl进行阶段梯度洗脱，结果如图5所示，重组人Ⅲ型胶原蛋白在250 mmol/L NaCl条件下被洗脱下来，而52、150 mmol/L NaCl洗脱品为重组人Ⅲ型胶原蛋白的降解物。
M-蛋白质分子量标准；1-上样前样品；2-层析穿透；3、 4-52 mmol/L NaCl洗脱样；5-150 mmol/L NaCl洗脱样；6-250 mmol/L NaCl 洗脱样；7-1 mol/L NaCl清洗层析柱图5 重组人Ⅲ型胶原蛋白阳离子交换层析阶段梯度洗脱结果
Fig.5 Results of step gradient elution of cation exchange chromatography of recombinant human type Ⅲ collagen
采用优化后的层析工艺对60 L发酵液进行重组人Ⅲ型胶原蛋白的纯化，产品纯度97.7%，总回收率68.8%，如表1所示。
表1 重组人Ⅲ型胶原蛋白纯化工艺各步骤回收率
Table 1 Recovery rate of each step of the purification process of recombinant human type Ⅲ collagen
注:—表示无
工艺步骤蛋白量/g纯度/%回收率/%发酵液 48.672.9—硫酸铵沉淀 38.085.391.5阳离子交换层析24.997.768.8
2.5 重组人Ⅲ型胶原蛋白的鉴定
将纯化的蛋白采用免疫印迹进行鉴别实验，方法参见《中国药典》[14]，证明其为重组人Ⅲ型胶原蛋白，结果如图6所示。
M-蛋白质分子量标准；1-重组人Ⅲ型胶原蛋白考马斯亮蓝染色；2-重组人Ⅲ型胶原蛋白免疫印迹图6 重组人Ⅲ型胶原蛋白免疫印迹检测及考马斯亮蓝染色对照
Fig.6 Immunoblotting and Coomassie brilliant blue staining of recombinant human type Ⅲ collagen
2.6 重组人Ⅲ型胶原蛋白的纯度分析
采用分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography，SEC-HPLC)对纯化的重组人Ⅲ型胶原蛋白进行纯度分析，其纯度为97.7%，结果如图7所示。
图7 重组人Ⅲ型胶原蛋白SEC-HPLC分析
Fig.7 SEC-HPLC Analysis of recombinant human type Ⅲ collagen
3 讨论与结论
重组人Ⅲ型胶原蛋白在医药、保健、营养等方面具有重要的应用价值，对其开发生产具有巨大的市场价值。早期的重组胶原蛋白，多采用大肠杆菌表达，分离纯化工艺复杂，热原难以控制。王晓军等[15]从大肠杆菌中经阴离子交换和分子筛(Sephadex G-100)柱层析分离重组胶原蛋白，最终产物纯度达98%，回收率为80.5%。毕赤酵母由于既有原核微生物的特点，又有真核生物的特性，可以对目的蛋白进行糖基化、二硫键形成等翻译后修饰，近年来在胶原蛋白的表达中越来越受到青睐。周爱梅等[10]采用巴氏毕赤酵母分泌表达重组人源胶原蛋白，采用40%饱和度硫酸铵沉淀和Sephadex G-100纯化得到电泳重组人源胶原蛋白。但上述工艺中，由于分子筛柱层析费时少、处理量小，不利于产业化应用。
本研究建立了一步层析法从毕赤酵母发酵液中纯化重组人Ⅲ型胶原蛋白：发酵液以30%饱和度硫酸铵盐析沉淀重组人Ⅲ型胶原蛋白，沉淀用超纯水复溶后，对20 mmol/L PB(pH 6.0)超滤、转换介质，上阳离子交换柱SP HP，以20 mmol/L PB(pH 6.0)-150 mmol/L NaCl洗脱杂蛋白及降解的重组人Ⅲ型胶原蛋白，以20 mmol/L PB(pH 6.0)-250 mmol/L NaCl洗脱重组人Ⅲ型胶原蛋白。该纯化工艺简便，离子交
换层析放大容易，因此更便于产业化。纯化的高纯度、全分子重组人Ⅲ型胶原蛋白，热原含量低，可用于医药领域，如医用海绵、薄膜、缝合线等。
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