我国人口众多，肉类生产消费量大，牛肉产量位居世界第三，牛肉产量还在持续增长[1]。2019上半年，牛肉产量同比增长0.6%，牛肉交易量同比增加 4.9%，需求继续呈增长态势[2]。牛肉具有高蛋白质低脂肪、营养丰富且味道鲜美的特点[3]，在贮藏、运输和销售过程中，牛肉很易受到外部微生物的污染或自身酶的作用而导致腐败变质[4]。保鲜剂对冷却牛肉腐败变质的原因起到抑制作用，可延长冷却肉的货架期。目前，最常用的保鲜剂分为两类:天然保鲜剂和人工保鲜剂[5]。天然保鲜剂安全可靠，抑菌性强，有些还具有较强的抗氧化性，对于延长牛肉的贮藏期有较好的效果[6],它也符合倡导自然、安全和健康的现代生活理念，因此，关于天然物质在肉类保鲜中应用的研究越来越多，开发环保高效的天然保鲜剂具有广阔的应用前景[7-8]。
与其他防腐剂相比，聚赖氨酸具有广泛的抗菌谱、良好的稳定性和耐高温等优点[9]，能够在人体内分解为赖氨酸，无任何毒副作用，可作为赖氨酸的来源。刘骁等[10]研究发现经多聚赖氨酸处理的冷却猪肉能有效抑制微生物生长，且具有一定护色效果，延长冷却猪肉的货架期。FAN等[11]研究了猪肉中马齿苋提取物的冷藏保鲜效果，结果表明马齿苋提取物具有较强的抗氧化活性，能显著抑制微生物生长，延缓脂质氧化。木犀草素能够很好地清除自由基，为细胞氧化损伤提供保护作用[12]。DHEKRA等[13]将木犀草素作为一种天然防腐剂应用于4 ℃贮藏30 d的接种肉糜中结果表明，该组分对单核细胞增多性李斯特菌有明显的抑制作用，对冷藏过程中微生物的生长有一定的抑制作用。适宜的低温是保持生鲜食品(果蔬、鲜肉、海产品)新鲜的重要条件。采用几种天然抑菌抗氧化剂进行复合保鲜，既可发挥抗氧化抑菌效果，又可以减少单一保鲜剂的局限性[14]。冰温技术即在不出现冻结的条件下，温度越低，保鲜时间越长效果越好，食品贮藏在0 ℃以下冰点以上的不冻结状态，属于非冻结保存。目前，冷却肉主要在4 ℃条件下销售，由于生产卫生条件良莠不齐，货架期较短，一般只有4 d左右(4 ℃)，这势必会造成冷却肉销售的局限性[15]。冰温保鲜可以对生物细胞起到低温胁迫作用，避免细胞冻结，维持细胞的存活状态，同时低温能够抑制微生物代谢和多数酶的活性[16-18]。既能有效保持鲜肉的品质，又克服了冷冻鲜肉解冻后的质构劣变和汁液损失[19]，因此能够较好地保持生鲜产品品质。
本文试验以牛背最长肌为研究对象，采用了4 ℃冷藏、冰温保鲜及冰温保鲜与天然保鲜剂结合3种保鲜方式进行处理，测定牛肉贮藏0、4、8、12、16、20及24 d的硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)值、挥发性盐基氮含量(total volatile basic nitrogen，TVB-N)、色差值、菌落总数等指标的变化并结合感官评价，探究天然保鲜剂结合冰温保鲜与其他保鲜方式在牛肉保鲜效果上的差异，旨在为使用天然保鲜剂的冰温保鲜技术在延长牛肉货架期中提供理论和技术指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛肉：西门塔尔杂交牛样本采自甘肃省张掖市祁连牧歌股份有限公司，选取同一牧场、生长发育正常、健康无病、体重均匀、年龄2～4岁的西门塔尔杂交牛10头，禁食16～18 h，禁水2 h。屠后立即取牛胴体中部背最长肌肉样备用。
多聚赖氨酸、马齿苋提取物、木犀草素(均为食品级),河南万邦实业有限公司;三氯乙酸、乙二胺四乙酸二钠、2-硫代巴比妥酸、硼酸、甲基红、溴甲酚绿等，均为分析纯，购于天津市光复科技发展有限公司。
1.2 仪器与设备
可程式恒温恒湿试验箱,合肥安科环境试验设备有限公司；CR-10型色度计,柯尼美能达有限公司；SP-756P型紫外可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司；L93-3型温度记录仪,杭州路格科技有限公司；HWS12型电热恒温水浴锅,上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD型洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司
1.3 实验方法
1.3.1 天然保鲜液的制备
在无菌条件下，称取0.3 g多聚赖氨酸、0.75 g马齿苋提取物、0.03 g木犀草素混匀后，用无菌水充分溶解定容至100 mL后，装入无菌试剂瓶中待用。
1.3.2 牛肉冰点的测定
参照宋丽荣等的方法[20]，稍作修改，采用冻结法测定冰点。样品切割成10 cm×10 cm×10 cm大小，将L93-3型温度记录仪的探头插入牛肉块几何中心，置于-18 ℃冰箱中冷冻，记录0 ℃以下温度变化，并作牛肉的中心温度随时间变化曲线。
1.3.3 肉样的处理
开启紫外线灯30 min后，在无菌环境下用无菌刀将多余的脂肪和结缔组织去除，并去掉表层，分割成方形肉块，每块100 g左右。
1.3.4 试验设计
对照组用无菌水浸泡约5 min，处理组用无菌保鲜液浸泡约5 min，取出沥干2～5 min后用无菌保鲜袋分装贮藏，进行指标检测，具体处理方法如表1所示。
表1 样品处理方法
Table 1 Sample processing method
组别贮藏温度/℃处理方法冷藏组 4±0.1无菌水浸泡 冰温组 -1.5±0.1 无菌水浸泡 冰温保鲜剂组-1.5±0.1 无菌保鲜液浸泡
1.3.5 检测指标
1.3.5.1 硫代巴比妥酸值
按照国标GB 5009.181—2016[21]中的分光光度法进行测定：
肉样中丙二醛含量
(1)
式中：ρ,校准曲线中得到的试样溶液中丙二醛的质量浓度，μg/mL；V,试样溶液体积，mL；m,试样质量，g。
1.3.5.2 挥发性盐基氮的测定
按照GB5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》方法[22]，采用半微量定氮法进行测定，每个样品重复3次测定，取平均值。
1.3.5.3 L*值和a*值
采用色度计(D65光源, 口径8 mm)对牛肉切面进行L*值(亮度值)、a*值(红度值)的测定，测定前先用标准白板对色差仪进行校正，每个样品均重复3次，取平均值。
1.3.5.4 菌落总数
参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》[23]进行测定。结果以对数形式表示，lg CFU/g。
1.3.5.5 感官评价
参照杨斌等的方法[24]，稍作修改。每项指标均采用10分制，具体的评分标准见表2。
表2 感官评价表
Table 2 Sensory evaluation table of beef
项目9～10分7～8分4～6分1～3分气味(10分)具有鲜牛肉特有的香味,无任何异味具有鲜牛肉特有的香味,但不太强烈,无异味鲜牛肉特有的香味不浓郁,稍带异味鲜牛肉特有的气味消失,异味不能接受色泽(10分)肌肉颜色鲜红有光泽,色泽一致肌肉有光泽,颜色较鲜红肌肉色泽有些许发暗,但仍具有光泽肌肉色泽暗红发褐,无光泽组织状态(10分)肌纤维致密,有韧性,弹性好;肉样表面没有出水,不发黏肌纤维较致密,有韧性,弹性好;肉样表面稍有出水,不发黏肌纤维较致密,弹性较好;肉样表面 出水较多,不发黏肌纤维松散,韧性消失,弹性一般;肉样表面出水较多,发黏
1.4 数据分析
用 IBM SPSS Statistics 22.0 分析软件对数据进行方差分析，试验均重复3～5次，数据取平均值±标准偏差表示，采用单因素方差分析(ANOVA)和多重比较(Duncan法)，用Origin 8.5软件绘图，数据间的差异采用SPSS 19.0软件进行分析，显著水平为0.05。
2 结果与分析
2.1 牛肉冰点温度
牛肉放入-18 ℃冰箱后，其中心温度逐渐下降，当温度低于0 ℃，在某一时刻温度会出现回升的现象，稳定一段时间后再次下降，这一稳定阶段的温度为牛肉的冰点温度[25]。如图1所示，牛肉的中心温度在前20 min内快速下降，当牛肉中心温度达到-1.6 ℃时维持6 min后稍有回升，这是由于当温度降到冰点时，肉中的水并不立即冻结，待温度降到足以出现晶核后，才开始向固相转变，而且释放出冰的熔化潜热，使温度回升到冰点。这一现象称为过冷，回升前的温度称为过冷温度[26]。之后温度维持在-1.5 ℃，约16 min，之后开始下降，当温度降低至-1.6 ℃时，又维持4 min，之后温度快速下降。由此可得肉样的冰点温度约为-1.5 ℃。
图1 牛肉温度变化曲线图
Fig.1 Temperature change curves picture of the beef samples
2.2 牛肉贮藏期间硫代巴比妥酸值的变化
TBA值用于反馈脂肪氧化酸败水平，鲜肉TBA值：0.201～0.665 mg/kg，变质肉大于1.0 mg/kg。如图2所示，新鲜牛肉TBA值为0.14 mg/kg，在同一贮藏时间内，冷藏条件下肉样的脂肪氧化程度最高。在冷藏末期，肉样的TBA值达到0.701 mg/kg，己经失去食用价值，而此时冰温保鲜组的TBA值约为0.476 mg/kg。说明在冰温条件下贮藏对脂肪的氧化有较好的抑制作用，能够延长牛肉的保鲜期。冰温保鲜剂组的牛肉TBA值在贮藏过程中一直显著低于其他2组(P<0.05)，这表明，在冰温下贮藏牛肉时，保鲜剂对脂肪氧化有很好的抑制作用，且二者的叠加作用能更好地防止牛肉脂肪氧化。这与付丽等[6]的研究结果一致。
图2 贮藏期间牛肉TBA值的变化
Fig.2 Change in TBA of beef during storage
注：不同字母代表同一贮藏时间不同处理组之间差异显著(P<0.05)(下同)
2.3 牛肉贮藏期间挥发性盐基氮含量的变化
牛肉中TVB-N值是评定牛肉品质的重要理化指标。规定标准：一级鲜度≤15 mg/100g，二级鲜度≤25 mg/100g，变质肉>25 mg/100g。由图3可知，新鲜牛肉TVB-N值为4.21 mg/100g，TVB-N值在冷藏条件下上升最快。在第12天时冷藏组达到24.65 mg/100g，这与预期的结果相符，因为在此温度下一些微生物和酶还可以活动并将肉中的蛋白分解，从而引起腐败变质。而冰温条件下贮藏的2组样品，初始阶段TVB-N值变化缓慢，这可能是因为温度较低，微生物和蛋白分解酶的作用较弱，使得挥发性盐基氮的含量增加较缓慢[27]。在贮藏24 d时TVB-N值为24.57 mg/100g，未超过二级鲜度下限。因此，可认为冰温贮藏能够更好地保持牛肉的鲜度。冰温保鲜剂组的TVB-N值在贮藏期间一直显著低于冰温组和冷藏组(P<0.05)，这是因为保鲜剂中含有马齿苋提取物和木犀草素，是良好的抗氧化剂，有明显的抗氧化效果，这与ZHANG等[28]得到的结论一致。第24天时TVB-N值到达18.39 mg/100g。天然保鲜剂的添加可明显提高冰温保鲜的效果，这与本试验的研究结果相一致。
图3 贮藏期间牛肉TVB-N值的变化
Fig.3 Change in TVB-N of beef during storage
2.4 牛肉贮藏期间色差值的变化
由表2可知，随着贮藏时间的延长，不同处理组的L*值均呈现出先上升后下降的规律。贮藏初期L*值的上升，这是因为牛肉蛋白质的变性程度随着贮藏时间的延长而增加，保水性下降，导致肌肉内部水分渗出，肉样对光的反射能力加强[29]。随着贮藏期的延长，由于肌红蛋白与氧气接触生成的高铁肌红蛋白含量增加，肉样亮度下降。冰温保鲜剂组的L*值在整个贮藏期间均显著低于其余2组(P<0.05)，说明冰温保鲜剂组能较好维持牛肉肌肉组织的持水能力，在第16天，亮度达到最大值51.1；而冰温组在第16天亮度就达到最大值52.9，之后逐渐下降直到贮藏结束。冷藏组由于温度较高，蛋白质变性较快，肌节收缩，失水率增加，在第8天时亮度就达到最大，之后微生物大规模生长繁殖，促进了高铁肌红蛋白的生成，从而导致了肉色劣变加剧。
肌内脂肪与肌红蛋白氧化是a*值的变化的主要原因[30-31]。a*值的变化与肌红蛋白的含量和化学状态密切相关[32]。如表3所示，随着贮藏时间的延长，肉样的a*值呈先上升后下降的规律。冰温保鲜剂组肉样的a*值在贮藏前期显著低于其他2组(P<0.05)，在第12天时为10.2，仍为新鲜肉色。由于保鲜剂中含有具有抗氧化性的木犀草素和马齿苋提取物，存在一定的酚类物质，而酚类物质可络合Fe2+离子，从而抑制肉色的褐变[33]。冰温组肉样的a*值在贮藏第4天开始显著低于冷藏组(P<0.05)，在第12天达到最大值，原因可能是牛肉贮藏温度直接影响肉色，低温贮藏可以抑制氧合肌红蛋白的氧化速度，这说明冰温贮藏对于牛肉的保鲜及护色有较好的作用。这和付丽等[34]的结论一致。
表3 贮藏期间牛肉L*、a*值的变化
Table 3 Change in L*、a* value of beef during storage
注：“-”表示肉已腐败试验终止；不同字母则表示同一贮藏时间不同处理组之间差异显著(P<0.05)(下同)
贮藏时间/d保鲜剂+冰温(-1.5 ℃)冰温保鲜(-1.5 ℃)冷藏(4 ℃)L*a*L*a*L*a*039.1±0.22a8.4±0.18b38.0±0.23b9.5±0.20a37.9±0.18b9.5±0.23a441.7±0.19c8.8±0.15c46.2±0.13b11.4±0.13b48.1±0.19a11.9±0.13a846.2±0.05c9.8±0.17c49.1±0.16b13.4±0.17b52.9±0.16a14.7±0.17a1248.4±0.24c10.2±0.06b50.5±0.18b14.3±0.23a51.8±0.15a10.3±0.17b1651.1±0.1313.4±0.2152.9±0.2112.8±0.17--2050.7±0.1411.9±0.2152.3±0.1711.1±0.11--2450.5±0.219.5±0.2151.5±0.098.4±0.13--
2.5 牛肉贮藏期间菌落总数的变化
微生物生长情况是反映牛肉鲜度最重要的指标，评价标准为鲜肉<4 lgCFU/g，次鲜肉4～7 lgCFU/g，而变质肉>7 lgCFU/g。由图4可知，随着贮藏时间的延长，冷藏组的菌落总数一直高于冰温组和冰温保鲜剂组。在第12天后，冷藏组牛肉的菌落总数为6.85 lgCFU/g左右。冰温条件下细菌增长速度比冷藏组缓慢，在贮藏末期，菌落总数为6.19 lgCFU/g左右，超过国家规定的变质肉标准。冰温保鲜剂组的牛肉，菌落总数的增长速度显著低于其他2组，由于保鲜剂中多聚赖氨酸具有良好的抑菌特性，细菌增长缓慢，在贮藏末期菌落总数为5.91 lgCFU/g左右，仍未超过国家标准，这与JIA等[35]的研究结果相符。说明保鲜剂与冰温相互配合，具有良好的抗菌作用，能够大大延长牛肉的保鲜期。
图4 贮藏期间牛肉菌落总数的变化
Fig.4 Change in sensory index of different group beef during storage
2.6 牛肉贮藏期间感官指标的变化
表4显示了不同处理组牛肉在贮藏过程中感官评分的变化，不同处理组牛肉的感官特性随着贮藏时间的延长而逐渐恶化，冷藏组的感官评分下降最快，符合许立兴等[36]的研究结果。冰温保鲜剂组的各项感官得分均明显高于冰温组和冷藏组(P<0.05)，这表明，添加天然保鲜剂与冰温有良好的协同作用；另外，天然保鲜剂中多聚赖氨酸具有较好的抗菌作用，可以有效地抑制微生物的生长繁殖。马齿苋提取物和木犀草素是良好的抗氧化剂，可以抑制酶活，延缓牛肉感官特性的劣变。说明天然保鲜剂和冰温保鲜的协同作用能有效地延缓牛肉感官特性的劣变，延长牛肉保藏期。
表4 贮藏期间牛肉感官评价值的变化
Table 4 Change in sensory index of different group beef during storage
贮藏时间/d保鲜剂+冰温(-1.5 ℃)冰温保鲜(-1.5 ℃)冷藏(4 ℃)030.00±0.00a 30.00±0.00a 30.00±0.00a 428.2±0.16a26.6±0.21b20.6±0.24c824.7±0.22a21.7±0.12b13.0±0.19c1220.2±0.24a18.9±0.16b6.1±0.17c1616.1±0.2014.2±0.18 —2012.6±0.249.6±0.17—248.1±0.186.4±0.21—
3 结论
本试验在确定了肉样冰点为-1.5 ℃后，将木犀草素、马齿苋提取物和多聚赖氨酸3种物质配比复合的天然保鲜剂与冰温保鲜技术结合对牛肉进行保鲜效果的研究。冰温保鲜证实比冷藏保鲜效果更优，可使肉类的保质期延长至12 d。天然保鲜剂与冰温保鲜有良好的协同作用，对肉类的贮藏保鲜效果最佳，不仅不影响牛肉的感官特性，而且可以有效延缓品质劣变，将牛肉的货架期成功延长至第16天。在第16天时牛肉TBA值为0.53 mg/kg，TVB-N值为11.1 mg/100g，菌落总数对数值为3.93，感官评分为16.1分，各指标显著优于其他2组(P<0.05)。因此，天然保鲜剂与冰温技术相结合是一种安全有效、健康的牛肉保鲜技术，可以有效延缓牛肉运输、销售、贮藏期间品质，减少经济损失。
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