松露(Truffle)属子囊菌门西洋块菌科西洋块菌属，是非常珍贵和稀有的食用菌[1-2]。松露营养丰富，富含蛋白质、多种氨基酸、维生素和矿物质等[3-4]。多糖是松露中最重要的成分之一，松露多糖有较高的抗氧化活性，可作为天然的抗氧化剂用于功能食品，松露多糖还有免疫调节活性、抗肿瘤活性和抗癌作用[5-6]。目前，国内关于松露的研究大都集中在对真松露和假松露从外形、气味、孢子形态进行鉴别以及对松露的挥发性物质的探索方面，对松露多糖的研究不多。本实验以四川会东松露为原料，优化松露多糖的提取工艺，过DEAE-52纤维素柱对多糖进行分级分离，利用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)法对其抗氧化性进行测定，并通过红外光谱对松露多糖的结构进行初步鉴定，旨在为松露多糖资源的综合利用提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
松露：四川会东县嘎吉乡，收集时间为2019年12月10日，经鉴定为中华块菌；各种单糖标准品，DEAE-Sepharose 52，Solarbio；NaCl、H2SO4、DPPH、苯酚,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
101-2AB恒温干燥箱,北京中兴伟业仪器有限公司；多模式微孔板检测仪(酶标仪),美国Bio-Tek；GC-MS-QP2010 SE,日本岛津。
1.3 方法
1.3.1 松露多糖的提取及测定
1.3.1.1 多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法测定粗多糖含量，参考文献[7]，葡萄糖标准曲线方程为y=6.828 6x-0.009，R2=0.999。
1.3.1.2 松露提取工艺优化
新鲜松露洗净，切片后，放置于60 ℃烘箱中烘干，打粉过40目筛，备用。称取松露干粉，按比例加入蒸馏水，在加热过程中不断搅拌，收集上清液；醇沉(乙醇体积分数为80%)，4 ℃过夜沉淀；离心收集沉淀，冷冻干燥后得松露粗多糖。
单因素试验：选取提取时间(0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h)、提取温度(60、70、80、90、100 ℃)和料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50， g∶mL)，探究松露多糖在不同条件下的提取率。
正交优化试验：以多糖提取量为参考，综合上述单因素试验结果，设计3因素3水平正交试验，见表1。
表1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests
水平因素A(提取时间)/hB(提取温度)/℃C(料液比)(g∶mL)11.5801∶3022.0901∶4032.51001∶50
1.3.2 脱蛋白方法和蛋白质含量得测定
蛋白质含量采取考马斯亮蓝的方法，具体操作步骤见参考文献[8]，标准曲线方程为y=0.166 8x+0.676 8，R2=0.998，x代表蛋白质量浓度(μg/mL)；Sevag法脱除蛋白，其中正丁醇-氯仿混合液体积比1∶4，重复5次，测蛋白质含量[9]。
1.3.3 松露多糖的分级分离
准确称取400 mg 松露多糖溶于6 mL去离子水中，过膜后加入纤维素层析柱(2.6 cm×50 cm)，用去离子水、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱。流速为 1 mL/min，5 min/管，各个浓度收集20管。在490 nm下测吸光度值，绘制曲线。由图2可以看出，松露多糖的洗脱峰有2个，出现在0.2 mol/L 和0.3 mol/L NaCl溶液洗脱液中，分别命名为TPS-A和 TPS-B，适当浓缩后装入3 000 kDa透析袋中透析，封好口后，置于4 ℃超纯水中透析48 h，除去氯化钠，6～8 h更换1次超纯水，冻干[12]。
1.3.4 松露粗多糖抗氧化性的测定
DPPH自由基(DPPH·)清除能力：对纯化后得到的TPS-A松露多糖参照参考文献[11]的方法进行测定，DPPH·清除率按公式(1)计算：
DPPH·清除率
(1)
式中:A0为无TPS-A多糖的混合液的吸光度；A为有TPS-A多糖混合液的吸光度；Ab为无DPPH样品的吸光度。
1.3.5 单糖组成的测定
取2 mg多糖，1 mL的2 mol/L三氟乙酸在120 ℃条件下水解90 min，旋转蒸发仪蒸干。残基加入2 mL双蒸水，100 mg硼氢化钠还原，加入冰醋酸中和，旋蒸，110 ℃烘箱烘干，然后加入1 mL乙酸酐乙酰化100 ℃反应1 h，冷却，然后加入3 mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4～5次，以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3 mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复5次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10 mL，分析采用Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品[13]。
GC-MS条件：RXI-5 SIL MS色谱柱30 mm×0.25 mm×0.25 mm；程序升温条件为：起始温度120 ℃，以3 ℃/min升温至250 ℃/min；保持5 min；进样口温度为250 ℃，检测器温度为250 ℃/min，载气为氦气，流速为1 mL/min。其中标准品顺序为：鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。
1.3.6 傅里叶红外光谱分析(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)
将多糖与KBr研磨均匀后，压片，在4 000～400 cm-1范围内进行扫描[14]。
1.3.7 TPS-A的扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)分析
将TPS-A与样品载物台紧密贴合，使其均匀分布于表面，随后喷金，用扫描电镜进行观察，具体操作步骤参考文献[15]。
1.4 数据处理
本实验应用Origin 2018和Excel 2010进行图形绘制和数据分析。
2 结果与分析
2.1 松露多糖提取工艺优化结果
2.1.1 单因素实验结果
由图1-a可知，多糖提取率随提取时间的延长而逐渐增加，至2 h时达到最大，超过2 h，多糖提取率降低，原因是随着加热时间的增加，不溶物及黏性物质等溶出，杂质和黏度增加，且有助于其他水溶性物质如色素、蛋白等溶出，从而影响了松露多糖的提取率[16]；由图1-b可知，在90 ℃时多糖提取率最大，多糖提取率为9.28%，超过90 ℃后，提取率降低，可能是温度高，水分蒸发，溶液变黏稠，多糖溶解难度增加；温度低，小分子之间的活动不剧烈，多糖得率下降[17]；由图1-c可以看出，多糖提取率在料液比为130(g∶mL)时达到最大，超过1∶30(g∶mL)后，多糖提取率下降。所以，选择料液比1∶30～1∶50(g∶mL)、加热时间1.0～2.0 h、提取温度80～100 ℃进行正交实验。
a-提取时间;b-提取温度;c-料液比图1 单因素试验结果
Fig.1 Results of one-factor-at-a-time experiments
2.1.2 正交实验结果
由表2可知，3个因素对松露粗多糖得率的影响大小排序为B>A>C，即提取温度对粗多糖得率的影响>提取时间>料液比。由k值得到最优水平为A3B1C2，最佳提取工艺组合为提取时间为2 h，提取温度为80℃，料液比为1∶40(g∶mL)。
表2 正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal tests
序号因素ABC多糖得率/%11118.4021228.5631337.5042128.5152238.2762318.4973139.7183217.6893328.80K18.158.878.19K28.428.178.62K38.738.268.49极差0.590.700.43主次顺序B>A>C
2.2 验证实验
最优提取条件A3B1C2并未在正交试验中出现，需要补充实验对比L9(33)中A3B1C3和A3B1C2的多糖提取率，实验结果为：A3B1C3为(9.83±0.04)%,A3B1C2为(9.74±0.06)%。根据提取率的高低，确定最优提取条件为A3B1C2，即提取时间为2 h，提取温度为80 ℃，料液比为1∶40(g∶mL)，松露粗多糖的提取率为9.83%，高于李明华等[18]对江苏等地金针菇中多糖的提取率(6.85%)和张丽娟等[19]对武夷山产长根菇多糖的提取率(5.85%)，低于丛媛媛等[20]对新疆阿魏菇中的多糖提取率(14.69%)；从提取方法来看，与孔庆龙[21]的松露多糖的得率接近(10.75%)，但孔庆龙[21]的提取时间长(3.7 h)，料液比大(1∶59，g∶mL)，延长了后续的浓缩、乙醇沉淀和冷冻干燥的实验周期，且增加了溶剂(乙醇、正丁醇和氯仿)的使用量；赖婷[10]研究发现提取次数的增加能提高松露多糖的得率，但同时延长了实验周期，赖婷将提取次数调整为3次，多糖提取率从5%增加到10%左右，但提取时间增加到6 h，是本文提取时间的3倍。综上所述，适当缩短提取时间将有助于缩短实验周期，减少能耗，降低生产成本，符合工业生产要求，同时料液比1∶40(g∶mL)，减少后续脱蛋白的正丁醇和氯仿的使用量，既能减少溶剂的浪费也能使工艺更简单易操作，故此工艺可行且环保。
2.3 多糖的分级结果
前期实验对NaCl浓度梯度的分离效果进行了预实验，适当的调整了浓度梯度，由图2可以看出，0、0.1～0.5 mol/L的NaCl对多糖的分离效果明显，松露多糖经DEAE-52纤维素柱层析分离后出现2个峰，分别为TPS-A、TPS-B，收集第41～53管为TPS-A，第75～83管为TPS-B，过柱后TPS-B含量较少，故后续仅对TPS-A进行研究，经检测TPS-A的总糖含量为75.26%，蛋白质含量占总质量的1.32%。
图2 多糖DEAE-52纤维素柱洗脱曲线
Fig.2 Elution profile of polysaccharides by DEAE-52cellulose column chromate graphy
2.4 松露多糖的抗氧化结果
由图3可知，TPS-A和VC对DPPH·清除率效果较好。低浓度(0.125 mg/mL)VC的DPPH·清除率也能保持在80%；松露多糖的DPPH·清除率随着多糖浓度的增加缓慢升高。TPS-A对DPPH·的IC50为0.98 mg/mL；和刘宇琪等[22]实验中灵芝多糖的清除率接近(IC50为1 mg/mL)，邓加聪等[23]通过超声水溶液提取牛肝菌多糖的DPPH·的IC50为1.03 mg/mL；DPPH·的IC50的多糖浓度越低，清除效率越好，因此，松露多糖TPS-A具有较高的抗氧化活性。
图3 松露多糖对DPPH·的清除作用
Fig.3 DPPH radical scavenging activity of the polysaccharides from Truffles
2.5 单糖的组成
由图4可知，TPS-A的组成主要为鼠李糖、甘露糖和葡萄糖，按照出峰时间的先后顺序分别对应图4-b中的1、5和6，所占比例分别为2%、3%和95%。松露多糖 TPS-A 的单糖组成与王小花[26]研究的松露多糖的单糖组成结果类似，葡萄糖含量占90%以上，另有少量甘露糖和半乳糖；孔庆龙[21]发现纯化后的松露多糖主要是由葡萄糖组成的多糖，这也证实松露多糖 TPS-A 中葡萄糖的含量较高检测准确。
图4 标准单糖、TPS-A水解衍生化产物的GC图
Fig.4 GC of mixed standard monosaccharides, TPS-A
2.6 松露多糖TPS-A 的FTIR扫描结果
由图5可知，松露多糖TPS-A在3 413.462 cm-1有较强的吸收峰，表明多糖分子间或分子内有O—H；在2 930.495 cm-1 有吸收峰，说明分子内有C—H；在1 644.381 cm-1处有吸收峰，是C
O不对称伸缩引起的振动[24]；在1 404 cm-1的吸收峰是糖类C—H变角振动引起的；在1 150～1 050 cm-1的峰是吡喃型糖苷环骨架C—O变角振动吸收峰，说明多糖中存在C—O—H和C—O—C结构；松露多糖中分别在800～600 cm-1处有吸收峰，可能含有β-D-葡萄吡喃糖吸收峰，其他结构需后续研究确证[25]。
图5 TPS-A的傅里叶红外光谱图
Fig.5 FTIR spectrum of TPS-A
2.7 TPS-A扫描电镜结果
图6-a、图6-b、图6-c分别为TPS-A在100、30、5 μm放大倍数下的电镜扫描图像，可知冷冻干燥和提取工艺并未对多糖的结构造成破坏。由图6-a可知，TPS-A主要由长杆状、圆形颗粒和大块的片状组成，其中长杆状的数量多且呈网状排列，在长杆状的周围零星分布着圆形颗粒，颗粒大小接近于长杆的横截面，片状结构体积大，但数量少，表面光滑；由图6-b可更清晰的观察到长杆状相互缠绕，并和圆形颗粒相互重叠，内部空间结构疏松，故多糖的吸水效果好；由图6-c中可以看出，圆形颗粒表面光滑，颗粒外形完整，数量多。
图6 TPS-A不同放大倍数扫描电镜图
Fig.6 SEM images of TPS-A
3 结论
本文对松露粗多糖的水提醇沉工艺进行了优化，通过正交实验优化松露多糖提取工艺为：提取时间2 h、料液比1∶40(g∶mL)和提取温度80 ℃，此条件下的多糖提取量为9.83%；后采用DEAE-52纤维素柱层析分离得到2个不同的组分，分别为TPS-A和TPS-B，其中TPS-B量少，后续仅对TPS-A进行结构鉴定和抗氧化实验。TPS-A对DPPH·的IC50值为0.98 mg/mL，同时测得松露多糖TPS-A是由甘露糖、葡萄糖和鼠李糖组成，且葡萄糖含量高达95%，经红外检测分析发现TPS-A是一种含有β糖苷键的吡喃型多糖。松露多糖在抗氧化活性方面表现优异，作为一种天然的食品成分，可用于医学美容、保健品和食品添加剂方面，这为四川会东松露多糖的综合开发提供思路。
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