黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是一类由黄曲霉与寄生曲霉的某些菌株产生的强毒性次级代谢产物[1-2]。目前已分离出的AFT有B1、B2、G1、G2等20多种，其中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)极易污染花生、玉米、大豆以及其他粮油产品，分布范围广，毒性和致癌能力强，与人类的健康密切相关[3]。摄入AFB1的剂量和时间决定了个体的毒性程度，并对罹患肝癌的风险具有累积效应[4]。毋庸置疑，对AFB1的快速高效检测是有效控制AFB1食品污染的关键。
目前检测AFB1最常用的方法是高效液相色谱法[5-7]和液相色谱-质谱法[8-10]，这些方法在食品样品中检测AFB1具有高准确性和可重复性，但耗时长、成本高，且预处理过程复杂，很难应用于AFB1污染的现场快速检测[11]。因此，迫切需要建立一种可靠的AFB1的快速定量检测方法，这对保障食品安全和人身健康至关重要。荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)是一种均相分析检测技术，具有灵敏度高，操作简单方便的优点，目前已被用于检测氯噻啉[12]，双酚A[13]，蛋白质[14-15]等物质。对于提高FRET的效率，供体和受体的选择尤为关键。相较于传统的有机染料以及半导体量子点等下转换荧光供体，上转换荧光纳米颗粒(up-conversion nanoparticles, UCNPs)因其优异的光化学特性备受研究者青睐，UCNPs在980 nm近红外光激发下，能发出一种短波长、反斯托克斯定律的荧光[16]，能避免待测样品的自发荧光所导致的背景干扰[17]，因此，UCNPs可在FRET体系中作为一种理想的能量供体。目前，基于UCNPs的FRET方法在食品安全尤其是真菌毒素检测中还鲜有报道。与此同时，金纳米颗粒(gold nanoparticles，AuNPs)的吸收峰与UCNPs的荧光发射光谱有很大程度的重合，可见光吸收范围宽，猝灭效率和消光系数较高[18]。因此，UCNPs与AuNPs可形成FRET体系。
本研究利用UCNPs和AuNPs，构建了一种基于FRET的免疫传感器用于AFB1检测。UCNPs和AuNPs通过AFB1抗原、抗体组装在一起时，发生FRET过程，导致UCNPs荧光猝灭。当AFB1存在时，会与AFB1抗原竞争抗体，抑制了FRET过程。反应体系的荧光强度与AFB1浓度在一定范围内呈正相关，基于此，该方法实现对AFB1的快速定量检测，具有操作简便、灵敏度高的特点。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
六水合氯化钇(YCl3·6H2O)、1-十八烯(1-ODE)、六水合氯化镱(YbCl3·6H2O)、油酸(oleic acid,OA)、六水合物氯化铒(ErCl3·6H2O)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(1-(3-dimethylaminopropy)-3-ethylcarbodiimide hydro chloride,EDC)、聚丙烯酸(acrylicacid acid polymers,PAA)、硫代羟基琥珀酰亚胺(suflo-NHS)、NaOH、氟化铵、柠檬酸三钠、氯金酸、十二水合磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、无水乙醇、无水甲醇、环己烷、三氯甲烷、浓HCl、硼酸、牛血清白蛋白(borine serum albumin,BSA)，国药集团化学试剂有限公司；AFB1标准品、交链孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether, AME)标准品、赭曲霉毒素A (ochratoxin A, OTA)标准品、杂色曲霉毒素(sterigmatocystin, ST)标准品、交链孢酚(alternaria, AOH)标准品，国家标准物质中心；AFB1抗原、AFB1抗体，生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 仪器与设备
F96PRO型荧光分光光度计，上海棱光技术有限公司；MDL-Ⅲ-980-2W型激光发射器，中国长春新产品光电技术有限公司；UV-1800型紫外可见光分光光度计，日本岛津公司；JEOLJEM-2100型透射电子显微镜，日本电子株式会社；Zetasizer nano型激光粒度散射仪，英国Malvern公司。
1.3 试验原理
基于抗原修饰的UCNPs与抗体修饰的AuNPs之间的荧光共振能量转移构建免疫检测平台。如图1所示，UCNPs和AuNPs分别和AFB1抗原、AFB1抗体偶联，实现功能化。当检测体系中不存在AFB1时，AFB1抗原和抗体的免疫结合拉近了UCNPs和AuNPs的距离(1～10 nm)，发生FRET过程，引起UCNPs荧光猝灭；当检测体系中存在AFB1时，AFB1与UCNPs-抗原竞争性地结合AuNPs-抗体，从而抑制了FRET过程。以980 nm激发光激发，体系的荧光信号值随着AFB1含量增加而增加。因此，可根据体系543 nm处荧光值与AFB1的质量浓度绘制标准曲线，实现对AFB1的定量分析。
图1 免疫传感器检测黄曲霉毒素B1原理图
Fig.1 Schematic diagram of the immunosensor for the detection of AFB1
1.4 试验方法
1.4.1 水溶性UCNPs的制备
油溶性UCNPs的制备：根据LI等[19]采用的高温热分解法制备油溶性UCNPs。
水溶性UCNPs的制备：OA-UCNPs在水中的分散性极差，需要对材料表面进行PAA修饰转换成水溶性UCNPs进行后续实验[13]。根据DAI等[20]报道的方法将OA-UCNPs转为PAA-UCNPs。
1.4.2 AuNPs的制备
根据文献[21]采用柠檬酸钠还原法制备AuNPs。
1.4.3 能量供体探针的制备
用AFB1抗原对UCNPs进行功能化修饰制备能量供体探针：取0.2 mg UCNPs和EDC(0.75 mg/mL)混合，然后加入sulfo-NHS(0.5 mg/mL)摇床2 h对材料进行活化。离心后用PBS缓冲液(0.01 mol/L，pH=7.4)复溶沉淀。加入含4 μg抗原的PBS缓冲液，摇床2 h后加入1 mL BSA质量分数为1%的PBS缓冲液封闭30 min。离心收集沉淀重悬于PBS缓冲液中，4 ℃避光储存备用。
1.4.4 能量受体探针的制备
用AFB1抗体对AuNPs进行功能化修饰制备能量受体探针：取1 mL AuNPs溶液加入6 μL K2CO3溶液(0.1 mol/L)，然后加入6 μg抗体，摇床1 h。加入50 μL 质量分数为10%的BSA溶液封闭2 h。9 000 r/min离心25 min，用BSA质量分数为1%的硼酸盐缓冲液(borate buffer，BB)溶液(2 mmol/L，pH=8.2)清洗1次，重悬于1 mL海藻糖质量分数为5%的BB溶液。
1.4.5 标准曲线的绘制
取100 μL不同质量浓度的AFB1标准溶液(0.05、0.1、0.5、1、5、10、20 ng/mL)，分别与450 μL UCNPs-抗原混合，室温下混匀。分别加入450 μL AuNPs-抗体，室温摇床混合2 h。荧光分光光度计测定体系在543 nm处的荧光强度。以荧光强度和AFB1质量浓度绘制标准曲线，并确定检测范围和最低检出限(3σ/S，其中σ为空白多次测量的标准偏差，S为方法的灵敏度，即校准曲线的斜率)。
1.4.6 特异性实验
分别配制质量浓度为20 ng/mL的AFB1、AME、OTA、ST、AOH标准品溶液。利用上述免疫检测方法测定荧光强度，通过比较评价该AFB1免疫传感器的特异性。
1.4.7 加标回收实验
对自来水、花生油样品进行加标回收实验。花生油经适当的前处理：取1 g花生油样于10 mL离心管中，加入4 mL甲醇-水溶液(体积比7∶3)，漩涡振荡混匀后再置于摇床中孵育20 min，6 000 r/min离心10 min，取上清液备用。将质量浓度为0.1、1、10 ng/mL AFB1标准溶液分别添加到提取液中，得到待测样品溶液。利用上述免疫传感器检测AFB1的质量浓度，计算回收率。
2 结果与分析
2.1 功能化AuNPs和功能化UCNPs的表征
材料的分散性会影响到纳米材料的功能化修饰和特异性竞争结合，若材料粒径过大会容易导致聚沉，无法满足检测要求[13]。如图2-a所示，功能化AuNPs呈球形，这种纳米材料的尺寸相对均匀、一致，平均粒径为17 nm；如图2-b所示，功能化UCNPs呈现正六边形，在水中的分散性良好，平均粒径为180 nm；如图2-c所示，当体系中不存在目标物时，功能化UCNPs和功能化AuNPs通过抗原-抗体特异性识别发生免疫结合形成AuNPs-UCNPs复合物，平均粒径为200 nm。AuNPs与UCNPs的距离(1～10 nm)满足形成FRET体系的条件。
a-功能化AuNPs;b-功能化UCNPs;c-AuNPs-UCNPs复合物图2 功能化AuNPs、功能化UCNPs、AuNPs-UCNPs复合物的透射电镜图
Fig.2 TEM images of functionized AuNPs, functionized UCNPs and AuNPs-UCNPs nanocomposites
动态光散射(dynamic light scattering，DLS)测得的结果是流体动力学直径，通常测得的粒子尺寸比透射电镜(transmission electron microscope，TEM)测得结果要略大，但仍可用来定性表征粒子的尺寸变化[22]。如图3所示，功能化AuNPs、功能化UCNPs、AuNPs-UCNPs复合材料的粒径分布均接近正态分布，表明这几种材料均呈现良好的分散性，平均水合粒径分别为80、210、295 nm，再次证明功能化AuNPs和功能化UCNPs通过免疫结合形成了AuNPs-UCNPs复合物。
2.2 UCNPs与AuNPs的能量转移
如图4所示，UCNPs在980 nm激发光照射下的荧光发射光谱在525，543和659 nm附近有3个吸收峰，分别对应掺杂Er3+离子2H11/2→4I15/2(绿光区)，4S3/2→4I15/2(绿光区)和4F9/2→4I15/2(红光区)的能级跃迁[14]。突出的绿色发射表明UCNPs可作为FRET体系中的能量供体。AuNPs在520 nm附近显示出强而宽的吸收带，因此AuNPs可作为潜在的能量受体或猝灭剂。此外，AuNPs的紫外-可见光吸收光谱与UCNPs的荧光发射光谱有较好的重叠，这使得UCNPs和AuNPs之间发生FRET过程成为可能。
a-功能化AuNPs;b-功能化UCNPs;c-AuNPs-UCNPs复合物图3 功能化AuNPs，功能化UCNPs，AuNPs-UCNPs复合物的水合粒径图
Fig.3 DLS images of functionized AuNPs, functionized UCNPs and AuNPs-UCNPs nanocomposites
1-UCNPs的荧光发射光谱;2-AuNPs的紫外-可见吸收光谱图4 UCNPs的荧光发射光谱与AuNPs的紫外-可见吸收光谱图
Fig.4 Fluorescence spectra of UCNPs and UV-vis absorption spectra of AuNPs
2.3 工作曲线与检出限
通过AFB1与UCNPs-抗原竞争性地结合AuNPs-抗体，抑制FRET过程，考察不同质量浓度AFB1对体系荧光强度的影响。由图5可知，随着AFB1质量浓度的增加，543 nm处的荧光强度逐渐提高，荧光强度与AFB1质量浓度呈正相关。荧光强度与AFB1质量浓度在0.05～20 ng/mL存在线性关系：y=2.084 ln(x) + 57.278(R2=0.990 9)，最低检出限为0.02 ng/mL(3σ/S)。如表1所示，与检测AFB1的其他方法作比较，发现该方法的检测限较低，检测范围较宽，优势明显。
表1 几种检测AFB1的方法比较
Table 1 Comparison of several detection methods of AFB1
方法检测范围/(ng·mL-1)检测限/(ng·mL-1)文献电化学方法0.1～1.10.05[23]高效液相色谱法5～1000.57[24]电化学方法2 000～7 000890[25]高效液相色谱法0.5～50.02[26]电化学方法0.125～160.12[17]荧光共振能量转移法0.05～200.02本研究
图5 不同AFB1质量浓度对应的荧光发射光谱图
Fig.5 Fluorescence spectra corresponding to different AFB1 concentrations
2.4 特异性分析
选用AME、OTA、ST、AOH作为常见的可能存在的共存毒素进行特异性测试和抗干扰能力检测[27-28]。如图6所示，当检测物为AFB1时，AFB1与特异性抗体高效结合，反应体系荧光响应值较高；当检测干扰毒素时，反应体系的荧光响应值不足AFB1信号值的1/30，说明这些干扰毒素不能起到恢复反应体系荧光强度的作用，该AFB1免疫检测方法特异性良好。抗体的特异性识别作用保证了该检测方法的特异性，该检测方法受环境影响较小。
图6 检测不同毒素时反应体系在543 nm处的荧光信号强度
Fig.6 The fluorescence intensity of reaction system at 543 nm when different toxins were detected
2.5 加标回收实验
为进一步检验该检测体系的可靠性与实用性，分别对油相(花生油)和水相(自来水)样品进行了加标回收试验。实验结果如表2所示，利用传感器检测花生油和自来水的加标回收率分别在107%～112%和106%～110%，这说明所建立的方法可用于真实复杂样品中AFB1的测定，准确可靠。
表2 样品中AFB1的加标回收实验(n=3)
Table 2 Recovery results of added standard AFB1 in samples
样品添加量/(ng·mL-1)检测值/(ng·mL-1)回收率/%RSD/%0.10.1121104.5自来水11.0211064.61010.4471084.10.10.1091124.0花生油11.0611074.41011.2131124.7
3 结论
本研究制备UCNPs能量供体探针和AuNPs能量受体探针，构建了一种基于FRET的免疫传感器用于检测AFB1。体系中的荧光强度信号值与AFB1质量浓度在0.05～20 ng/mL呈线性正相关：y=2.084 ln(x)+57.278(R2=0.990 9)，检测限为0.02 ng/mL。将该方法用于实际样品分析时可获得较好的回收率，可用于食品中AFB1的快速定量检测，为开发灵敏、快速、高选择性的食品安全生物传感器开辟了新的路径。
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