高产L-乳酸副干酪乳杆菌对酸菜品质及安全性的影响

酸菜是我国北方传统的加工蔬菜,以白菜为原料,通过微生物发酵得到，不仅保留了白菜原有的营养成分如Vc、膳食纤维等[1],而且还含有乳酸菌等功能性微生物。但传统酸菜发酵慢、酸味弱，受环境情况响较大，产品质量不稳定，易积累亚硝酸盐[2-3]，发酵产物多为D-乳酸。由于人体只有代谢L-乳酸的L-乳酸脱氢酶，所以只能吸收L-乳酸，不能吸收D-乳酸，D-乳酸在人体内堆积对人体健康非常有害，带来了较大的食品安全问题。世界卫生组织提倡在食品及医药行业中使用L-乳酸取代D-乳酸，还明确规定，人体每天摄取D-乳酸的量限制在每1 kg体质量100 mg 以下[4]。

L-乳酸菌酸菜是由人工接种高产L-乳酸的副干酪乳杆菌发酵白菜获得,L-乳酸酸菜可以改善酸菜品质，首先其发酵产物是人体可以利用并对人体有益的L-乳酸，然后因为乳酸菌在代谢过程中可以生成有抑菌活性的多肽，能有效抑制杂菌生长、减少亚硝酸盐产生、缩短生产周期等[5]，成品酸菜中Vc含量高于传统发酵酸菜。高含量的VC在一定程度上也会降低亚硝酸盐的形成速度[6]，从而进一步提高酸菜品质。

本试验通过比较L-乳酸酸菜与传统酸菜发酵过程中感官评价、部分理化指标、微生物指标变化情况，得到改善酸菜品质和安全性的生产方法，为提升酸菜质量和改进生产工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳酸菌菌种：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，本实验室保藏。

白菜：超市购买。

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、琼脂、溴甲酚绿、柠檬酸铵、乙酸钠、MgSO4、MnSO4、K2HPO4、亚铁氰化钾、乙酸、盐酸萘乙二胺、硼砂、对氨基苯磺酸、浓HCl、乙酸锌，均为分析纯；D/L-乳酸检测试剂盒(D/L-Lactic Acid Assay Kit)，朝阳运丞商贸有限公司。

1.1.4 MRS培养基(g/L)

牛肉膏10，蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖10，乙酸钠5，柠檬酸三铵2，吐温80 1，K2HPO4 2，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·4H2O 0.05，pH自然。分装到500 mL三角瓶，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

把4 ℃保藏的副干酪乳杆菌菌种活化后接入MRS培养基中，放置培养箱中32 ℃培养24 h，转化2代，镜检无杂菌则可备用。

1.1.6 仪器与设备

恒温培养箱(SHP-150)，上海精宏设备有限公司；分光光度计(722 s)，上海精密仪器仪表有限公司；超净工作台(SA-900-1JZ)，上海一恒科技有限公司；电子天平(JA2103N)，上海精密科学仪器有限公司；小号缸、各种玻璃仪器等，朝阳运丞商贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵酸菜的制备

将白菜除烂叶后，用清水冲洗干净，把白菜摆放在小号缸中，每缸放10 kg,其中2个缸加10 L 20 g/L盐水即为传统酸菜,另外2个缸加10 L 20 g/L盐水和200 mL副干酪乳杆菌菌种即为L-乳酸酸菜，压实，封口,每种设2个平行样，取2个平行样的平均值。

1.2.2 对感官评价的影响[7]

10位专业人员通过观察发酵液、成品酸菜色泽、闻气味和脆度得出感官评价结果。

1.2.3 对理化指标的影响[8-10]

1.2.3.1 总酸测定[11-13]

按照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》执行。吸取酸菜汁10 mL于200 mL三角瓶中，加入25 mL蒸馏水，滴入酚酞指示剂2滴，用NaOH标准溶液滴定至粉红色，并能保持30 s不褪色为止，记录NaOH用量。

1.2.3.2 亚硝酸盐测定[14-17]

按照GB/T 5009.33—2010《盐酸萘乙二胺法》执行。将酸菜用研钵研碎，称取5.0 g试样，置于200 mL烧杯中，加入12.5 mL饱和硼砂液，搅拌均匀，用300 mL 70 ℃左右的水将试样洗入500 mL容量瓶中,于沸水浴中加热15 min，取出冷却至室温后，加入5 mL亚铁氰化钾溶液混匀，再加入5 mL乙酸锌溶液混匀以沉淀蛋白质，加水至刻度，混匀，放置0.5 h，除去上层脂肪，清液用滤纸过滤，弃初滤液30 mL，收集剩余滤液备用。吸取40 mL上述处理液于50 mL带塞比色管中，加入2 mL对氨基苯磺酸溶液混匀，避光静置5 min，再加入1 mL 2 g/L盐酸萘乙二胺溶液混匀，加水至刻度，静置15 min，用2 cm比色杯于538 nm波长处测吸光值，同时以等量的蒸馏水代替样品液，按同样的处理方法做空白对照实验。

1.2.3.3 Vc含量的测定[18]

按照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸2.6-二氯靛酚滴定法》执行。称取切碎的酸菜样品20.00 g放在研钵中，加少许质量浓度为20 g/L草酸溶液研碎，倒入200 mL容量瓶中，加质量浓度为20 g/L草酸溶液至刻度，用离心机离心沉淀后过滤备用。吸取10 mL滤液于烧杯中，用2.6-二氯靛酚钠盐溶液滴定至桃红色20 s不褪色，记下染料的用量。吸取质量浓度为20 g/L草酸溶液，用染料作空白滴定记下用量。

1.2.3.4 L-乳酸测定[19-20]

按照 D/L-乳酸检测试剂盒(D/L-Lactic Acid Assay Kit)步骤检测。酸菜汁离心，必要时进行稀释，使L-乳酸质量浓度为0.003～0.30 g/L之间；温育到25 ℃备用。

1.2.4 对微生物指标的影响[21-26]

菌落总数GB 4789.2—2016《食品微生物菌落总数的测定》执行；乳酸菌培养及计数按GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物检验乳酸菌检验》执行；霉菌和酵母菌计数按GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》执行；大肠菌群计数按GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠杆菌计数》执行。

2 结果与分析

2.1 感官评价影响

由表1可知，传统发酵酸菜汁浑浊，没有发酵酸菜的香味，是因为传统酸菜发酵初期酸度低，腐败细菌生长繁殖，使白菜组织蛋白质及含氮物质遭到破坏，使发酵液变浑浊，同时，初期有少量霉菌，霉菌分泌分解果胶的酶，使蔬菜组织变软，导致酸菜脆度变软。L-乳酸酸菜发酵液清澈，具有酸菜的香气，是因为L-乳酸酸菜中人工接种的副干酪乳杆菌在发酵初期就产生大量L-乳酸，不但能够抑制有害微生物的生长，而且由于总酸含量高，致使果胶含量增加，酸菜的脆性更好，赋予酸菜酸度适中、醇香爽脆的独特风味。所以相对于传统酸菜，接入副干酪乳杆菌的L-乳酸酸菜感官品质更好。

2.2 理化指标的影响

2.2.1 总酸的影响

由图1可知，在整个发酵过程中，2种酸菜的总酸都呈现先上升后微上升的趋势，这是由于后期大量的乳酸积累，从而进入过酸阶段，导致乳酸菌群受到了抑制，酸菜的总酸含量上升减慢。但L-乳酸酸菜的总酸含量上升的幅度要比传统酸菜快，L-乳酸酸菜在第11天就能达到成熟，酸度为1.2%(pH 3.5)，而传统酸菜在第20天达到成熟。此试验得出L-乳酸酸菜比传统酸菜提前9 d成熟，节约近一半的时间，大大缩短生产周期。

2.2.2 L-乳酸含量影响

由图1可知，L-乳酸酸菜中L-乳酸质量浓度随发酵时间延长而增加，后来由于大量的乳酸积累，进入过酸阶段，导致乳酸菌受到了抑制，15 d后酸度基本维持不变，L-乳酸质量浓度基本保持平稳。传统酸菜中基本检测不到L-乳酸，结果表明，接入副干酪乳杆菌可以使酸菜中含有大量对人体有益的L-乳酸，提高了酸菜的品质。

2.2.3 Vc含量影响

由图2可知，在整个发酵过程中，L-乳酸酸菜和传统酸菜中Vc含量都随发酵时间延长而降低。但L-乳酸酸菜中Vc的含量始终高于传统酸菜。有研究表明Vc能在一定程度上抑制或减少亚硝酸盐形成，所以Vc含量增高不但提高了L-乳酸酸菜的品质，也增加了L-乳酸酸菜的安全性。

2.2.4 亚硝酸盐影响

由图2可知，L-乳酸酸菜中亚硝酸盐含量在发酵全程均低于传统酸菜，而且含量一直很低，远远低于酱腌菜国标限值(GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》酱腌菜中亚硝酸盐含量20 mg/kg)，没有亚硝酸盐峰值出现。而传统酸菜在第6天达到峰值28.78 mg/kg，到第14天符合酱腌菜标准。这首先因为L-乳酸酸菜中乳酸菌数量高，产酸多，在一定程度上抑制有害菌及还原性细菌的生长繁殖，从而降低亚硝酸盐的含量；其次因为乳酸菌在代谢过程中可以产生有抑菌活性的多肽或多肽前体物质，也能高效抑制杂菌繁殖、降低亚硝酸盐含量。结果表明，传统酸菜在6～14 d时亚硝酸盐含量较高，而接入副干酪乳杆菌的L-乳酸酸菜不存在亚硝酸盐超标问题，能更好地控制亚硝酸盐含量，提高酸菜安全性。

2.3 微生物指标

2.3.1 总菌落影响

由图3可知，2种酸菜在发酵过程中总菌落数都随时间延长而下降；由于L-乳酸酸菜产酸快而多，总酸高，能更好地抑制杂菌的生长繁殖，总菌落数始终比传统酸菜少，安全性更高。

2.3.2 乳酸菌数量影响

由图3可知，在整个发酵过程中L-乳酸酸菜乳酸菌数量始终高于传统酸菜，在第12天达到最高，之后缓慢下降最后趋于不变；传统酸菜在测试的第21天乳酸菌数达到最高。L-乳酸酸菜由于接种副干酪乳杆菌的菌种优势，乳酸菌生长繁殖快。结果与总酸含量变化吻合。

2.3.3 霉菌数量影响

由图3可知，在整个发酵过程中传统酸菜中霉菌数量较多，随着发酵时间延长，大量乳酸的产生，抑制了部分霉菌的生长，在发酵结束时有少量霉菌存在；L-乳酸酸菜发酵在开始时霉菌就受到抑制，数量较低，到6 d后检测不到霉菌。说明L-乳酸酸菜能更好地抑制霉菌生长繁殖，提高酸菜的安全性。

2.3.4 酵母菌数量影响

由图3可知，在整个发酵过程中L-乳酸酸菜中酵母菌数量始终低于传统酸菜。在L-乳酸酸菜发酵过程中由于酸度大，有效抑制了酵母菌繁殖，尤其是发酵后期酵母菌数量大量减少。

2.3.5 大肠菌群影响

在整个发酵过程中，2种酸菜中均未检出大肠菌群。

3 结论

接入副干酪乳杆菌的L-乳酸酸菜颜色黄嫩，气味清新，口感清脆优于传统酸菜；含有对人体有益的L-乳酸，Vc含量高于传统酸菜，亚硝酸盐低于传统酸菜，而传统酸菜中检测不到L-乳酸；再者L-乳酸酸菜比传统酸菜发酵时间减少一半，缩短了生产周期；所以接入副干酪乳杆菌对酸菜的品质和安全性有很大的影响，大大提高了酸菜的品质和安全性。

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