随着我国食品行业整体水平的提高，酱油产量增长迅速，在2016年达到了1 000 万t，虽然产量大，但相较于日本酱油在国际市场的价格，中国酱油价格更低[1]。原因是日本酱油整体质量水平比中国高，并在长期的生产过程中形成了各个类型的酱油，如浓口酱油、淡口酱油、溜酱油、白酱油等，且各具特色[2]。由于酱油的风味主要来源于微生物和复合生物酶的协同作用所产生的可溶性小分子物质，因此在酱油生产过程中从原料到生产工艺，都会导致酱油风味的改变[3]。因此对比中日两国酱油风味差异，对提高中国酱油在国际市场竞争力具有重要意义。
酱油的风味由滋味和香味组成，滋味包括酸、甜、苦、咸、鲜5个方面。酸味主要来源于乳酸、乙酸等有机酸；甜味主要来源于原料中淀粉等大分子糖类物质的水解以及甜味游离氨基酸；苦味主要来自于蛋白质分子水解产生的苦味氨基酸和食盐中的MgSO4、MgCl2等；咸味主要来自于添加的食盐，鲜味主要来源于鲜味氨基酸和酱油中的鲜味肽，分子质量在1 000～5 000 Da的美拉德肽能够提升风味，提升酱油的鲜味、厚重感[4]。冯云子等[5]的研究表明，中日两国酱油在非挥发性成分以及感官特性上具有显著性差异，各种理化指标的差异是导致中式和日式酱油在鲜味、厚味和甜味上差异的物质基础。香味主要由挥发性风味物质贡献，从酱油中已经分离、鉴定出近300种风味化合物。它们主要来源于曲霉发酵、酵母菌发酵、乳酸菌发酵和美拉德反应。同时，酱油中香气组成也取决于酿造原料、生产工艺以及参与发酵的微生物等因素，并且环境温度、光照、压力及环境污染物也会影响酱油香气成分组成[6]。在中国酱油中起着关键作用且贡献较大的特征性风味成分主要是4-乙基愈创木酚、4-羟基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)呋喃、3-甲硫基丙醇等。3-甲基丁烷、3-羟基-4,5-二甲基-2(5H)-呋喃酮、2-甲基丁烷、3-甲硫基丙醛被认为是日本酱油中最重要的香气成分，3-乙基-1,2-环戊二酮和2’-氨基苯乙酮在日本酱油中也被鉴定出[7]。通过比较中国酱油与日本酱油滋味和香味上的差异，有利于提高中国酱油整体品质。
1 材料与方法
1.1 实验原料
分别在日本和中国超市购买4瓶日本酱油和3瓶中国酱油(7瓶酱油均是高盐稀态工艺，且都达到特级酱油等级)。
1.2 试剂
草酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、丙酸、酒石酸、苹果酸、富马酸、甲酸和乙酸(均为AR)，天津市瑞金特化学品有限公司；混合氨基酸标准液(2.5 mol/mL)，Wako公司。
1.3 仪器与设备
GCMS-QP 2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；KDN-O8B定氮仪，上海新家仪器有限公司；MULTISKAN GO酶标仪，赛默飞世尔科技公司；LC-20A型高效液相色谱仪，日本岛津公司；L-8900氨基酸分析仪，日本日立公司。
1.4 实验方法
1.4.1 常规理化指标检测
氨基酸态氮测定使用甲醛滴定法[8]；总酸、盐度的测定方法依据GB/T 5009.39—2003；还原糖的测定方法根据GB 5009.7—2016。
全氮测定：称0.2 g的CuSO4，3.0 g K2SO4和10 mL的浓H2SO4并加入10 mL 稀释10倍的样品液于消化管中，调节仪器温度至260 ℃保持75 min,再将温度调节至420 ℃保持135 min,直到反应体系冷却澄清，使用自动凯氏定氮仪蒸馏5 min，馏出液用0.10 mol/L的HCl标准液滴定，直至颜色由蓝变粉红视为滴定结束，同时做空白的对照。
1.4.2 游离氨基酸的测定
食品中氨基酸的测定参考GB 5009.124—2016。
1.4.3 有机酸的测定
采用高效液相色谱分析酱油中的有机酸组成。色谱柱:C18;流动相:质量分数0.1% H3PO4溶液,流速0.6 mL/min;检测波长210 nm;进样体积10 μL;柱温 30 ℃;外标峰面积定量。
1.4.4 挥发性风味物质的测定
酱油中风味物质的测定采用固相微萃取-气质联用(solid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometry,SPME-GC-MS)的方法[9]。
1.5 分析方法
利用SPSS 18.1和SIMCA软件对数据进行分析，利用Origin软件作图。
2 结果与分析
2.1 酱油理化指标测定结果
氨基酸态氮是评价酱油质量的重要指标之一。由表1可以看出，中国酱油氨基酸态氮含量显著高于日本酱油(P<0.05)。在日式发酵工艺中，淀粉质的原料比例要高于中式发酵，而淀粉酶能将淀粉质原料分解成单糖、双糖和五碳糖，因而增加了日本酱油中还原糖的含量[10-12]。盐度、pH、总酸、全氮和还原糖在两国酱油中没有显著差异。
表1 酱油常规理化指标
Table 1 General physical and chemical indexes of soy sauce
理化指标中国酱油日本酱油pH4.93±0.184.63±0.04总酸/[g·(100mL)-1]2.55±0.162.46±0.11氨基酸态氮/[g·(100mL)-1]1.08±0.03∗0.88±0.03∗全氮/[g·(100mL)-1]1.67±0.091.69±0.02还原糖/[g·(100mL)-1]5.60±0.785.74±1.32盐度/[g·(100mL)-1]14.50±0.2615.84±0.32
注：数据由均值±标准差;*表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.2 酱油中有机酸测定
有机酸也是评价酱油质量的指标之一，其种类和含量直接影响酱油的品质。有机酸能够调节酱油pH和抑制有害微生物生长，并且能对酱油口感起到缓冲作用。由表2可知，7瓶酱油中除草酸、富马酸、丙酸外，其他7种有机酸均有检出。乳酸和乙酸是主要的2种酸类物质，其含量之和能占到有机酸总量的35%以上[13]。乳酸能够使酱油口感滑润绵长，乙酸可以调和酱油中食盐的咸味，让其变得更爽口，并且乳酸与乙酸的比值越大，酱油的口感就越柔和[14-15]。表2可以看出，苹果酸和柠檬酸含量较高，两者同时存在时，可以使酱油口感更丰满协调，并且二者对酱油香味方面也有正面影响[16]。
表2 酱油中的有机酸测定结果 单位：g/100 mL
Table 2 The content of organic acids in soy sauce
有机酸样品1样品2样品3样品4样品5样品6样品7草酸NDNDNDNDNDNDND酒石酸0.0339NDND0.06580.09340.02050.0752甲酸0.05290.06920.05990.01110.02910.02490.0300苹果酸0.11830.13690.24800.03010.39530.03340.1111乳酸0.46500.13120.15330.55700.23960.31280.1688乙酸0.58300.45650.67890.32390.52960.76470.3534柠檬酸0.04630.04630.07770.05660.23140.35870.3000富马酸NDNDNDNDNDNDND琥珀酸0.12410.02480.02230.04290.07070.04230.0407丙酸NDNDNDNDNDNDND
注：样品1、2、3为中国酱油;样品4、5、6、7为日本酱油;ND表示未检测到
2.3 酱油中游离氨基酸测定
游离氨基酸对酱油的滋味起着决定性作用，其主要是由蛋白酶和肽酶水解原料产生的[17]。由图3可知，7瓶酱油中共检测出16种游离氨基酸，其中包含人体必需氨基酸6种。根据世界卫生组织规定，食物中人体必需氨基酸总量与总氨基酸的比值越接近40%越具有营养价值，中国酱油的比值为34.33%，日本酱油为33.55%。
中国与日本酱油中谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸的含量存在显著性差异(P<0.05)。谷氨酸是提供酱油鲜味的主要氨基酸，也是酱油样品中含量最多的氨基酸之一，在天然酿造酱油中的占比约为18%～25%，其在两国酱油中占比分别为25.34%和22.96%，因此可推断酱油样品中均未添加谷氨酸钠增鲜剂[18]，与配料表相一致。甘氨酸和赖氨酸是呈甜味的氨基酸，能够在一定程度上掩盖不被接受的苦味。精氨酸、组氨酸异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和缬氨酸属于苦味氨基酸，在两国酱油中苦味氨基酸总量占到总氨基酸的29.93%和35.28%，虽然含量相对较高，但高盐稀态酱油还是以鲜味和咸味为主，原因是酱油中的盐、还原糖以及有机酸遮盖了苦味的呈现，并且有些苦味氨基酸滋味阈值较高(如异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)[5]，而且通过味觉重建实验，蛋氨酸和缬氨酸也被证明对酱油的鲜味具有一定贡献[19]，因此苦味的呈现不明显。
表3 酱油中的游离氨基酸测定结果 单位：g/100 g
Table 3 The content of free amino acids in soy sauce
游离氨基酸中国酱油日本酱油天冬氨酸1.023±0.050.756±0.23谷氨酸2.069±0.11∗1.832±0.08∗丝氨酸0.467±0.020.444±0.02苏氨酸0.340±0.040.320±0.01甘氨酸0.388±0.02∗0.354±0.01∗丙氨酸0.404±0.040.447±0.16脯氨酸0.535±0.020.566±0.02蛋氨酸0.127±0.010.118±0.01异亮氨酸0.409±0.010.405±0.02亮氨酸0.720±0.010.694±0.03酪氨酸0.105±0.060.079±0.01苯丙氨酸0.365±0.010.363±0.01赖氨酸0.497±0.03∗0.444±0.02∗组氨酸0.184±0.010.187±0.01精氨酸0.061±0.01∗0.519±0.01∗缬氨酸0.471±0.010.451±0.02
2.4 酱油挥发性风味物质结果分析
由图1可知，日本酱油中醛、酸、酯、呋喃吡嗪和烃的种类多于中国酱油,其中,烃类物质明显多于中国酱油。烃是由原料中的不饱和脂肪酸在脂肪酶、脂肪氧化酶等作用下生成的，烃类物质虽然对酱油的风味影响很小，但其进一步分解成的小分子物质是酱油复杂风味的来源[20]。
图1 中日酱油挥发性风味物质种类
Fig.1 Types of volatile flavor compounds in Chinese and Japanese soy sauce
由图2可知，中国酱油(样品1、2、3)分布在第二、三象限，而日本酱油(样品4、5、6、7)分布在第一、四象限，表明中国酱油和日本酱油的挥发性风味物质存在明显差异。
图2 中日酱油风味物质PCA图
Fig.2 PCA diagrams of flavor compounds in Chinese and Japanese soy sayce
由图3可知，苯乙醇、乙醇、邻二甲苯、1,3-二乙基-苯是两国酱油样品的主要差异挥发性风味物质。在高盐稀态酱油中，乙醇主要是酵母菌代谢产生[21]，苯乙醇则是由苯丙氨酸降解产生[22]，邻二甲苯和1,3-二乙基-苯等芳香烃是由原料中的不饱和脂肪酸在脂肪酶、脂肪氧化酶等作用下生成。进一步对其进行200次假设验证，得到VIP(Var IDPrimary)预测值>1的差异挥发性风味物质共17个(表4)。中国酱油与日本酱油的差异挥发性风味物质是由原料、发酵菌种及工艺的差异造成的。
图3 中日酱油风味物质OPLS-DA图
Fig.3 OPLS-DA diagrams of flavor compounds in Chinaese and Japanses soy sance
表4 差异挥发性风味成分气味分类
Table 5 Odor classification of different volatile flavor components
物质名称文献描述气味VIP预测值文献中OAV值[23-24]文献中FD值[7,25-27]乙苯-1.6386--1-乙基-4-甲基-苯-1.0296--1,3-二乙基-苯-4.8103--1,2,3-三甲基-苯-1.3769--乙酸乙酯果香、酒香[9]1.822119-271-100,100亚油酸乙酯酯香[9]1.0199--丁酸丁酯果香1.1035--2-苯乙醇花香[23]2.624474-9,1-100,2001-丁醇果香、酒香[9]1.4505--2,3-丁二醇果香、洋葱香[9]1.5774--2-甲基-1-丁醇麦芽香[23]1.555112-27,39-3-甲基-1-丁醇1.7963314-8,25,1-150乙醇酒香[23]6.368114750,1-1502-甲基-1-丁醛麦芽香[9]1.03627701-6,8,100,1231,2,4-三甲基-苯-1.0840--邻二甲苯-3.7336--对二甲苯-1.8127--
注：-表示未在文献中找到相应描述
由表4可知，差异挥发性风味物质共17个，包括3种酯类、6种醇类、1种醛类和7种烃类。香气活性值(odor activity value, OAV)是评价香气化合物重要性的指标之一，OAV值>1则对样品香气组成有贡献，OAV值越大，该香气化合物贡献越大。很多文献也使用香味抽提物系数分析法(AEDA)方法来检测香气稀释因子(flavor dilution factor，FD)，从而鉴定酱油中关键致香化合物，FD值越大对香气贡献越大。在差异挥发性风味物质中乙酸乙酯、2-苯乙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、乙醇、2-甲基-1-丁醛在许多文献中被证实具有很高的OAV和FD值，可为酱油提供花香、果香、酒香和麦芽香等气味，因此这些物质是造成两国酱油香味差异的关键成分。
3 结论
通过对中日两国具有代表性的7瓶酱油样品的检测分析发现,中国酱油和日本酱油均都达到特级酱油标准，且中国酱油中氨基酸态氮明显高于日本酱油；两国酱油中的有机酸种类含量不尽相同，其中草酸、富马酸、丙酸在中日酱油中均未检出，酒石酸在2瓶中国酱油里也未检出；游离氨基酸中的谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸在中国与日本酱油中的含量存在显著性差异，以上奠定了滋味差异的物质基础；差异挥发性风味物质共17种，其中乙酸乙酯、2-苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、乙醇、2-甲基-1-丁醛和2-甲基-1-丁醇是造成两国酱油香味差异的关键成分。
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