植物蛋白饮料(plant protein beverage)是指以富含蛋白的植物果实、种子或果仁等为原料制成的饮料，近年来以“天然、健康、绿色、营养”的理念成为饮料市场的新兴产品[1]。植物蛋白饮料种类繁多，根据配料表中的主要成分进行分类，包括豆奶(浆)、花生露(乳)和果仁露等，这些植物蛋白饮料含有丰富的营养成分，包含了人体所需的蛋白质、脂肪和微量元素等，具有独特的风味，因而备受消费者的喜爱。但是一些不法商贩由于经济利益的驱使，将低成本的植物原料掺入到产品中以次充好，比如在核桃乳中掺入价格远远低于核桃的大豆、花生等成分[2-3]，使其成本大大降低。这种制假、掺假的恶劣行为不仅会损害消费者的经济利益，还会对身体造成不同程度的损害。如果消费者对掺入的成分过敏，在不知情的情况下误食后可能会产生过敏反应，甚至危及生命[4-5]。因此，植物源性饮料掺假问题需要食品安全监管部门重点关注，通过有效预防植物蛋白饮料掺假，才能构建更加健康经济的食品安全环境。
目前，在检测植物蛋白饮料掺假问题的方法中，分子生物学方法是较为重要的手段[6]，其中包括酶联免疫技术[7]、DNA条形码技术[8]、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)和实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)[9]等。2017年7月，国家食品药品监督管理总局颁布了食品补充检验方法《植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定(BJS 201707)》，为监管植物蛋白饮料掺假的情况提供了重要技术保障[10]。
本研究试图建立3种植物成分的实时荧光PCR检测方法所需阳性质粒，用于核桃、花生和大豆成分的特异性检测，并验证其方法特异性和检验灵敏度，研究出一种准确、灵敏、高效的实时荧光PCR反应体系，解决植物蛋白饮料在日常监管工作中缺乏标准物质的难题，为植物蛋白饮料掺假检测提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
TaqManTM Universal Master Mix Ⅱ, with UNG，App ied Biosystems公司； PrimeSTAR®HS DNA Polymerase，TaKaRa公司；BioReady rTa,Bioer公司；Qiagen DNeasy mericon Food Kit,Qiagen公司；核桃、花生、大豆的引物和探针序列均引自补充检验方法《植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定(BJS 201707)》[10]，济南博尚生物技术有限公司(Biosune)合成，见表1。
表1 实时荧光PCR检测引物、探针
Table 1 Specific primers and probes sequences in RT-qPCR
名称引物序列(5’-3’)探针序列目的基因核桃F-CGCGCAGAGAAAGCAGAGR-GACTCATGTCTCGACCTAATGCTFAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCT-CTTCCC-TAMRAJugr2花生F-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAGR-CGCTGTGGTGCCCTAAGGFAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCA-ACAGTGCG-EclipseArab2大豆F-GCCCTCTACTCCACCCCCAR-GCCCATCTGCAAGCCTTTTTFAM-AGCTTCGCCGCTTCCT-TCAACTTCAC-TAMRALectin
1.2 主要仪器
7500 FAST实时荧光PCR仪,美国 ABI 公司；NanoDrop 2000c生物紫外可见分光光度计,美国 Thermo Fisher公司；高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司，生物安全柜,美国NuAire公司。
1.3 基因组DNA的提取
使用试剂盒Qiagen DNeasy mericon Food Kit 提取植物 DNA，使用 紫外可见分光光度计检测 DNA 的浓度及质量，将 DNA 稀释到 10～100 ng/μL，-20 ℃保存备用。
1.4 阳性质粒分子的构建
根据设计的PCR引物，选取核桃源性成分Jugr2基因、花生源性成分Ara b2基因和大豆源性成分Lectin基因特异性序列，对这3种植物的基因组分别进行PCR扩增，PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再用胶回收试剂盒进行纯化。将PCR纯化产物与pMD19-T载体进行连接，然后将连接产物加入感受态细胞中进行转化，构建相应阳性质粒分子，序列合成由济南博尚生物技术有限公司完成。
1.5 实时荧光PCR检测
荧光PCR反应体系： PCR反应预混液12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，探针(10 μmol/L)1 μL，DNA模板(10～100 ng/μL)2 μL，用灭菌去离子水补足至总体积25 μL。荧光PCR反应程序为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 15 min；40个循环(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)。
试验结果用软件ABI 7500 FAST Software v2.0.1进行分析，根据《植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定(BJS 201707)》[10]中结果判定与表述部分，当扩增循环数(cycle threshold,Ct)≤35.0时，判定被检样品为阳性。
2 结果与分析
2.1 阳性质粒分子构建
为构建核桃、花生和大豆的特异性检测标准分子，分别将核桃源性成分Jugr2基因、花生源性成分Arab2基因和大豆源性成分Lectin基因进行PCR扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，上样量为8 μL，每个样品设置2个平行。由图1可知，核桃Jugr2基因、花生Arab2、大豆Lectin基因长度分别为91、72和118 bp，将扩增片段克隆到pMD19-T载体上，从而得到3个标准质粒分子。
1, 2: 核桃Jugr2基因PCR扩增产物; M: DL500; 3, 4: 花生Arab2基因PCR扩增产物; 5, 6: 大豆Lectin基因PCR扩增产物
图1 核桃、花生和大豆PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of walnut, peanut and soybean amplified by PCR
2.2 阳性质粒分子的特异性
按照1.5的荧光PCR反应体系，荧光PCR反应模板分别为核桃、花生和大豆阳性质粒分子，同时做质量控制，以其对应的基因组DNA作为阳性对照，不含核桃、花生和大豆的DNA作为阴性对照，灭菌去离子水作为空白对照，进行阳性质粒分子特异性验证。
由图2的扩增曲线可知，植物基因组DNA、构建的阳性质粒分子均为阳性，核桃Jugr2基因及其阳性质粒分子的Ct值分别为21、13个循环；花生Ara b2基因及其阳性质粒分子的Ct值分别为23、14个循环；大豆Lectin基因及其阳性质粒分子的Ct值分别为20、13个循环。阴性对照无增幅说明基因组间无交叉污染，空白对照无增幅说明反应体系无污染，因此构建的3种质粒分子均具有良好的特异性，可以作为阳性对照使用。
2.3 阳性质粒分子的灵敏度
将核桃、花生和大豆质粒分别进行10倍梯度稀释，自质量浓度100 ng/μL稀释至10-6 ng/μL，使用稀释后的质粒作为模板进行荧光PCR扩增，每个稀释度设置3个平行，用于灵敏度的验证，结果见图3。
标准中规定当Ct值≤35时，判定结果为阳性，由图2可知，3种阳性质粒分子的检出限均可达到10-5 ng/μL，具有较高的检测灵敏度。还可发现，稀释度越高平台期越低，可能是由于质量浓度太低导致反应体系中形成大量引物二聚体，使引物很快消耗完，从而形成扩增曲线的平台期很低。
a-核桃;b-花生;c-大豆
图2 阳性质粒分子特异性检测图
Fig.2 Results of specificity of positive plasmid
a-核桃;b-花生;c-大豆
图3 阳性质粒分子灵敏度检测结果
Fig.3 Results of sensitivity of positive plasmid
2.4 标准曲线的绘制
将质粒DNA标准物质从质量浓度100 ng/μL稀释至10-2 ng/μL，使用稀释后的质粒作为模板进行荧光PCR扩增，每个稀释度设置3个平行，以质量浓度为横轴，Ct值为纵轴，建立标准曲线(图4)[11]。
以核桃、花生和大豆阳性质粒分子建立的标准曲线的扩增效率分别为93.299%、123.623%、132.975%，且相关线性系数R2均在0.99以上，实验结果表明3种阳性质粒分子均具有良好的线性关系，可以作为阳性标准物质用于样品的定量分析。
a-核桃;b-花生;c-大豆
图4 阳性质粒分子标准曲线
Fig.4 Standard curve of positive plasmid
2.5 三种品牌PCR预混液对荧光PCR反应结果的影响
将3个阳性质粒分子从质量浓度100 ng/μL稀释至10-6 ng/μL，用10倍稀释产物作为模板，选取Appied Biosystems、TaKaRa和Bioer三种品牌的PCR预混液对实时荧光PCR反应结果进行比较分析[12]，见图5～图7。
根据检测结果可知，所有目的基因都可以在40个循环内得到典型的S型动力学曲线，曲线指数期增长明显，扩增曲线平行性、重复性和PCR反应效率较好，相邻浓度扩增曲线之间Ct值都十分接近，保证了定量结果的准确性[13]。
由图5～图7可知，利用Appied Biosystems、TaKaRa和Bioer三种品牌的PCR预混液分别进行实时荧光PCR反应，核桃阳性质粒的反应灵敏度分别为10-5、10-4和10-3 ng/μL，花生阳性质粒的反应灵敏度分别为10-5、10-4和10-2 ng/μL，大豆阳性质粒的反应灵敏度分别为10-5、10-4和10-3 ng/μL。3种预混液的灵敏度略有不同，分析其原因可能是由于Appied Biosystems酶中含有尿嘧啶N糖基化酶(uracil N-glycosylase，UNG)[14]，能够将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶，以区分扩增产物和模板。在变性步骤前增加50 ℃保温，使前面的扩增产物对尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil-DNA glycocasylase,UDG)敏感，所以可处理以破坏残余产物，起到防止残留污染，防止非模板DNA的扩增，从而降低了假阳性率，保证其较高的灵敏度。
a-Appied Biosystem; b-TaKaRa; c-Bioer(下同)
图5 三种品牌PCR预混液实时荧光PCR反应效果比较(核桃)
Fig.5 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three commercial PCR premixed liquid (walnut)
图6 三种品牌PCR预混液实时荧光PCR反应效果比较(花生)
Fig.6 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three commercial PCR premixed liquid (peanut)
图7 3种品牌PCR预混液实时荧光PCR反应效果比较(大豆)
Fig.7 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three commercial PCR premixed liquid (soybean)
3 结论与讨论
在应用荧光PCR技术进行植物源性成分检测时，都需要阳性物质作为对照，确保实验结果的有效性[15]。标准物质可以作为阳性对照，还可以绘制标准曲线用于样品的定量分析，但考虑到目前我国用的标准物质大多购于国外，不仅价格昂贵，且品种少、货期长，不能满足日常检验的需求。为解决这一难题，本研究构建3种阳性质粒分子以代替基体标准物质，使其可不受原材料限制从而对植物源性成分进行检测[16]。由于Jugr2基因、Ara b2基因和Lectin基因分别是核桃、花生和大豆成分的内源基因，具有良好的稳定性，因此选取这3种基因进行质粒的构建，同时验证了其方法特异性和检验灵敏度。另外比较了不同品牌PCR预混液对反应效率的影响，研究发现3种品牌的PCR预混液均具有较高的灵敏度。本研究为荧光PCR反应液的选择提供了技术依据，且阳性对照不再依赖于核桃、花生和大豆材料的供应，解决了食品监管工作中缺乏阳性对照的难题，对于植物源性成分的鉴定具有重要意义和广阔的应用前景。
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