酱油发酵是一个多种微生物共同参与的混菌发酵过程，在其酿造过程中微生物群落组成、演替和功能代谢对酱油品质有着重要的影响。因此，微生物是是酱油发酵的核心[1-2]，系统解析酱油发酵主要微生物对酱油风味的形成机理和品质的影响，有助于利用生物技术进行发酵过程优化控制，从而保证酱油产品品质的稳定和提高其食品安全性[3-4]。
参与酱油酿造的微生物种类繁多，主要包括曲霉、酵母菌、乳酸菌以及其他细菌。曲霉主要在制曲阶段和发酵初期发挥作用，决定原料发酵成熟的快慢以及成品的色泽。酵母菌对酱油风味的形成具有重要作用，主要包括鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、埃切假丝酵母(Candida etchellsii)、易变球拟酵母(Torulopsis versatilis)等[5]。鲁氏接合酵母用于酱油发酵前期，能将葡萄糖转化为乙醇，同时还能产生多种酯类、呋喃酮等风味物质[6]。乳酸菌是参与酱油发酵的主要细菌，在酱油生产过程中具有拮抗杂菌、提升风味和缩短发酵周期的作用[7-8]。
嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)是一类参与酱油发酵的耐盐乳酸菌[9]，其某些菌株具有胞内氨肽酶活性，可以用来提高鱼酱中谷氨酸的含量[10-11]。将嗜盐四联球菌和酵母菌结合作为发酵剂应用在发酵食品生产过程中，可使发酵食品中风味更加丰富[8, 12]。已有研究表明，在酱油发酵过程中添加酵母菌和嗜盐四联球菌可使酱油中挥发性物质总量增加2.2倍，其中酸、醇、酯、酚、吡嗪类物质含量显著增加[13]。此外，嗜盐四联球菌还对发酵食品安全有着有利的影响，可以减少酱油和发酵食品中危害物氨基甲酸乙酯及生物胺含量等[14]。
研究发现，乳酸菌和酵母菌在酱醪中通过物质代谢产生拮抗作用。例如，酵母菌进行乙醇发酵时会抑制乳酸菌的乳酸发酵，而乳酸菌的某些代谢物也会对酵母菌产生抑制作用。在酱油混菌发酵过程中，乳酸菌和酵母菌的添加时期及添加量对酱醪发酵有显著影响，这种影响还随菌种改变而不同[15]。目前虽然对酱油发酵过程中添加嗜盐四联球菌、酵母菌做了一定的研究，但嗜盐四联球菌和酵母菌在酱油发酵过程中的相互作用关系以及对酱油发酵体系中物质代谢的影响尚不明确。因此，本研究以高盐稀态酱油发酵过程为研究对象，通过嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母菌不同添加方式对体系中微生物生长和酱油发酵的影响进行评价，以期为酱油现代生产技术的提升提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
酱油曲精(米曲霉沪酿3.042)购自久味科技；嗜盐四联球菌R44和鲁氏接合酵母ZQ02为本实验室保藏菌株。
1.1.2 培养基
嗜盐四联球菌培养基〔MRS培养基(g/L)〕：蛋白胨10.0、牛肉粉5.0、酵母粉4.0、葡萄糖20.0、K2HPO4 2.0、乙酸钠5.0、柠檬酸三铵2.0、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.1、吐温-80 1.0。使用时添加100 g/L NaCl，调pH至7.0。
鲁氏接合酵母培养基〔YPD培养基(g/L)〕：葡萄糖20.0、酵母膏10.0、蛋白胨20.0。调pH至5.0。
孟加拉红固体培养基(g/L)：蛋白胨5.0、葡萄糖10.0、KH2PO4 1.0、MgSO4·7H2O 0.5、孟加拉红0.033、氯霉素0.1、琼脂20.0。
1.1.3 主要试剂和仪器
16种常见氨基酸混合标样、邻苯二甲醛试剂，美国 Agilent 公司；酵母膏、胰蛋白胨和 MRS 培养基，英国 Oxoid 公司；纳他霉素，青岛宝博生物科技有限公司；乙腈和甲醇(色谱纯)，中国上海默克化工技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
HH-B11·420 BS恒温培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；气相-高通量飞行时间质谱仪，美国力可公司；高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；酶标仪，美国赛默飞世尔科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株培养
嗜盐四联球菌的培养：从平板上挑取菌落到MRS培养基中，30 ℃静置培养60 h，按体积分数1%的接种量转接，培养至 OD600 达到1.2。
鲁氏接合酵母的培养：从平板上挑取菌落到YPD培养基中，30 ℃，220 r/min培养30 h，按体积分数1%的接种量转接，培养至 OD600 达到 4.0。
1.2.2 酱油发酵工艺
制曲工艺：将豆粕用1.2倍的水浸泡2 h，在121 ℃下灭菌 15 min，冷却至室温。按原料质量(混合后总质量)接入质量分数0.15%的米曲霉孢子粉，先把孢子粉与适量炒熟的小麦颗粒混合均匀，然后再和豆粕按体积比4∶6的比例充分拌匀。在生化培养箱中进行30 ℃培养，保持湿度，适时翻曲，制曲48 h，曲料表面长满黄绿色菌丝即为成曲。
发酵工艺：将成曲与含200 g/L NaCl的盐水以体积比1∶1.8的比例混合。将混合后的酱醪分装入2 L坛子中，30 ℃发酵75 d。发酵第1周每天搅拌1次，第2～6周每2 d搅拌1次，后期每周搅拌2次。
菌株的添加方式：当酱醪pH 5.2左右时(发酵15 d)添加107 CFU/g的鲁氏接合酵母(鲁氏接合酵母在酸性条件下生长)[16-7]。嗜盐四联球菌添加时间为15、25、35 d，添加量为106 CFU/g。本研究中酱油发酵过程菌株的添加方式如表1所示。
表1 酱油发酵过程菌株的添加
Table 1 Addition of strains during soy sauce fermentation
组别添加时间/dZ.rouxiiZQ02T.halophilusR44对照//T/第15天Z第15天/Z+T第15天第15天Z+T(25)第15天第25天Z+T(35)第15天第15天
注：/表示不添加；Z.rouxii ZQ02以107 CFU/g添加到酱醪中；T.halophilus R44以106 CFU/g添加到酱醪中；T表示在15 d添加T.halophilus R44；Z表示在15 d添加Z.rouxii ZQ02；Z+T表示在15 d添加Z.rouxii ZQ02和T.halophilus R44；Z+T(25)表示在15 d添加Z.rouxii ZQ02并在25 d添加T.halophilus R44；Z+T(35)表示在15 d添加Z.rouxii ZQ02并在35 d添加T.halophilus R44(下同)
1.2.3 嗜盐四联球菌和酵母菌数量的测定
嗜盐四联球菌和酵母菌数量测定均采用平板计数法。称取 1 g 酱醪倒入盛有灭菌玻璃珠和 99 mL 生理盐水的锥形瓶中混匀，梯度稀释后涂布到MRS(含纳他霉素，100 g/L NaCl)平板和孟加拉红琼脂(丙酸钠5 g/L，100 g/L NaCl)平板，30 ℃培养3～6 d后计数。嗜盐四联球菌为兼性厌氧菌，平板培养为4～6 d出现小菌落。因此，MRS平板计数时可以和酱醪中优势耐盐细菌(主要是Weissella、Staphylococcus)区分。本方法所计算的酵母数量包括添加的鲁氏接合酵母，以及酱醪中耐盐酵母(如球拟酵母，假丝酵母等)。后者与前者相比数量较少，可忽略不计。
1.2.4 酱醪样品理化指标的测定
在第15、20、25、30、35、40、45、60和75 天进行取样。取 100 g 酱醪于离心管中，12 000 r/min 离心 30 min，取上清液并用孔径为 0.22 μm的滤膜过滤进行理化指标测定。酱醪pH的测定采用精密 pH 计测定;总酸含量的测定采用酸度计法[18];氨基酸态氮含量的测定采用甲醛滴定法[19];还原糖含量的测定采用 3,5-二硝基水杨酸法[19]。
1.2.5 游离氨基酸的测定
游离氨基酸测定采用高效液相色谱法[20]。取 1 mL酱油样品，用质量分数5%的三氯乙酸稀释20倍后，常温下避光放置 30 min，用孔径为 0.22 μm 的水系滤膜过滤取滤液待测定。色谱条件：色谱柱 C18(250 mm×4.6 mm);检测波长 338 nm;柱温 40 ℃;流动相 A 相(1 L)：无水乙酸钠 5 g，四氢呋喃5 mL，三乙胺 200 μL，pH 7.2;流动相 B 相(1 L)：无水乙酸钠 5 g，超纯水200 mL，甲醇 400 mL，乙腈 400 mL，pH 7.2。
1.2.6 挥发性物质的测定
发酵结束时每个样品取3个平行样，过滤混匀后准确量取5 mL酱油样品，采用固相微萃取联合气质联用技术(solid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometer,SPME-GC-MS)对其中挥发性物质进行测定。样品处理方法为：添加 83.36 μg/L的 2-辛醇作为内标。固相微萃取方法、GC-MS分析方法以及数据处理参照文献[16]。
1.2.7 数据分析
使用 SPSS 19.0 对数据进行相关性分析，所有试验均重复3次。
2 结果和分析
2.1 发酵过程中嗜盐四联球菌和酵母菌数量的动态变化
在酱油发酵过程中嗜盐四联球菌的生长与物质代谢受环境因素(pH、营养物质)和体系中其他微生物(米曲霉、酵母、其他细菌)相互作用的影响。为了确定可以通过添加菌株起到在酱油发酵过程强化嗜盐四联球菌的作用，考察了添加时间和酵母菌干预对嗜盐四联球菌生长的影响。由图1可知，添加嗜盐四联球菌可以起到在酱油发酵过程中强化该菌的作用。单独添加嗜盐四联球菌，可使酱醪中该类菌数量增加1.9～3.0个数量级。在酵母活跃期内(25 d)添加嗜盐四联球菌，增殖较为缓慢，数量最多增加1.9个数量级；非酵母活跃期(15、35 d)时添加嗜盐四联球菌，数量可增加2.2个数量级(图1-a)。此外，单独添加嗜盐四联球菌或鲁氏接合酵母，酱醪中该类菌数量均高于添加混合菌。这说明嗜盐四联球菌和鲁氏接合酵母间存在一定的相互影响，可能是因为它们对营养物质的相互竞争，或受到对方特定代谢产物的抑制。乳酸菌产生的乙酸、苯乳酸、环肽等化合物都能对酵母生长产生抑制，而酵母代谢产生的乙醇、脂肪酸等同样不利于乳酸菌的生长[21-23]。未添加嗜盐四联球菌和酵母菌的酱醪中，也检测到了嗜盐四联球菌(7×104～9×105) CFU/g和酵母菌(2×103～3×104) CFU/g，这可能是酱醪体系中含有的嗜盐四联球菌、片球菌(Pediococcus)和酵母菌。
a-嗜盐四联球菌; b-酵母菌
图1 酱油发酵过程中嗜盐四联球菌和酵母菌数量的动态变化
Fig.1 Dynamic changes in cell numbers of T.halophilus and yeast during soy sauce fermentation.
2.2 嗜盐四联球菌对酱醪理化指标的影响
对酱油发酵过程中酱醪的 pH、总酸、还原糖和氨基酸态氮等理化指标分析表明，添加嗜盐四联球菌使酱醪pH略有下降，总酸含量少量增加，而氨基酸态氮含量显著增加(图2)。
发酵0～45 d酱醪中氨基酸态氮含量快速增加，添加嗜盐四联球菌的酱醪中氨基酸态氮含量高于对照；发酵45～75 d时添加嗜盐四联球菌的酱醪中氨基酸态氮含量增幅高于对照。在第15天添加鲁氏接合酵母，第25天添加嗜盐四联球菌的酱醪发酵75 d时氨基酸态氮含量为7.7 g/L，比对照高12.7%。
a-pH的动态变化; b-总酸的动态变化; c-还原糖的动态变化; d-氨基态氮的动态变化
图2 酱油发酵过程中理化指标变化
Fig.2 Detection of the physicochemical parameters of Moromi mash during soy sauce fermentation
2.3 嗜盐四联球菌对酱油游离氨基酸含量的影响
游离氨基酸对发酵食品尤其是以蛋白为主要发酵基质的大豆发酵食品独特滋味和香气的形成具有重要贡献[24]。游离氨基酸含量是衡量酱油品质的主要理化指标之一。通过分析比较上述发酵方式获得的酱油中游离氨基酸发现，添加嗜盐四联球菌或酵母菌的酱油氨基酸总量要高于对照。单独添加嗜盐四联球菌、15 d同时添加酵母菌和嗜盐四联球菌、先添加酵母菌并在25 d添加嗜盐四联球菌、先添加酵母菌并在35 d添加嗜盐四联球菌的酱油中总氨基酸含量分别提高了14.6%、21.1%、34.0%、23.9%(表2)。先添加鲁氏接合酵母并在25 d添加嗜盐四联球菌的酱油中Asp、Glu和Ala含量增幅最显著，分别提高了53.0%、26.0%和14.5%，其中Asp和Glu都是酱油鲜味的主要来源[25]。前期研究证实，嗜盐四联球菌R44可以合成寡肽酶和氨肽酶等蛋白酶，这一特性可能对酱油中氨基酸的含量增加起到了作用[26-28]。
表2 酱油中游离氨基酸的含量 单位：mg/mL
Table 2 Quantification of amino acids in different soy sauce samples
氨基酸对照TZZ+TZ+T(25)Z+T(35)Asp3.46±0.113.28±0.134.57±0.174.45±0.165.31±0.174.78±0.14Glu8.74±0.269.55±0.279.75±0.349.88±0.3511.05±0.3610.38±0.31Ser1.27±0.141.27±0.161.45±0.131.72±0.121.74±0.141.66±0.16His1.24±0.121.45±0.131.23±0.131.47±0.131.52±0.071.36±0.08Gly1.40±0.141.54±0.121.64±0.111.59±0.121.90±0.141.71±0.10Thr1.98±0.152.25±0.152.37±0.162.36±0.132.62±0.142.51±0.14Arg1.30±0.113.62±0.192.38±0.163.61±0.153.44±0.163.30±0.15Ala2.89±0.183.48±0.182.92±0.112.97±0.153.31±0.213.02±0.17Tyr1.10±0.121.30±0.131.31±0.091.33±0.111.57±0.121.40±0.10Cys0.12±0.020.09±0.020.09±0.010.09±0.010.07±0.010.06±0.01Val2.93±0.183.27±0.123.43±0.143.43±0.123.92±0.143.58±0.15Met0.94±0.081.02±0.031.02±0.041.04±0.061.09±0.041.05±0.04Phe2.93±0.132.94±0.123.20±0.133.15±0.123.43±0.123.17±0.10Ile2.67±0.112.86±0.133.13±0.133.11±0.123.41±0.133.15±0.13Leu4.55±0.194.94±0.165.23±0.215.29±0.235.85±0.185.45±0.19Lys3.74±0.184.25±0.184.34±0.214.47±0.205.07±0.214.56±0.23总量41.27±1.4247.31±1.9248.06±2.1649.99±2.2155.31±2.3551.14±2.18
为进一步分析嗜盐四联球菌对酱油中游离氨基酸的贡献，比较了强化嗜盐四联球菌对酱油中鲜味氨基酸(Asp、Glu)和甜味氨基酸(Asp、Thr、Ala和Ser)含量的影响。由图3可知，强化嗜盐四联球菌使酱油中鲜味氨基酸和甜味氨基酸含量显著增加。同提高游离氨基酸总量的强化菌株方式一样，鲜味和甜味氨基酸含量增加最多的也是第15天添加鲁氏接合酵母并在第25天添加嗜盐四联球菌；采用此种强化菌株的方式，酱油中鲜味氨基酸和甜味氨基酸含量分别增加到16.4 g/L和9.6 g/L，比对照提高了34.0%和27.0%。
a-鲜味氨基酸; b-甜味氨基酸
图3 不同酱油样品中鲜味和甜味氨基酸含量
Fig.3 Taste characteristics of amino acids in different soy sauce samples
注：*：P<0.05，**：P<0.01
2.4 嗜盐四联球菌对酱油中挥发性物质的影响
酱油中风味物质是在微生物作用下，原料中蛋白质、淀粉等大分子物质被水解生成的各种次级产物和小分子终产物的总和，主要包括醇类、醛酮类、酯类、酸类、酚类，杂环化合物等。其中醇类、醛类和酯类物质的种类最多，是酱油风味物质的重要组成[29]。通过 SPME-GC-MS分析方法研究了添加嗜盐四联球菌和酵母菌对酱油风味的影响。在6种发酵方式的酱油样品中共检测出118种挥发性物质，这些化合物包括17种醇、20种醛、15种酸、26种酯、14种酮类、4种烷烃、7种酚和15种杂环化合物(附件1)。各类酱油样品中挥发性物质种类总数差异不大，但组成存在明显差异。6种酱油样品中共同检测到的挥发性物质只有24种。
对酱油样品的挥发性物质含量分析发现，添加嗜盐四联球菌可使酱油样品挥发性物质含量增加1.5～2.4倍(表3)。单独添加嗜盐四联球菌或酵母菌、以及在不同时间添加两者的酱油中风味物质形成均优于同一时间添加嗜盐四联球菌和酵母菌或不添加菌株的对照；在添加鲁氏接合酵母后10 d或20 d添加嗜盐四联球菌可使酱油中风味物质总量显著增加。进一步分析发现，第25天添加嗜盐四联球菌酱油中酸类、酚类和杂合类物质含量较高；第35天添加嗜盐四联球菌酱油中醇类和酯类物质含量较高。酱油样品中挥发性物质出现较大差异和嗜盐四联球菌、鲁氏接合酵母的添加有着直接关系。
表3 酱油中主要挥发性物质的比较 单位：μg/L
Table 3 Comparison of the content of volatiles in soy sauce
挥发性物质对照TZZ+TZ+T(25)Z+T(35)醇类538.411395.711404.401213.091251.542060.26醛类66.08105.2553.4375.3682.63106.71酸类49.76152.4425.3129.66851.9137.38酯类9.2543.8371.4646.3511.2792.07酮类7.152.9429.2217.3245.7441.12烷烃类1.224.015.994.763.845.18酚类8.8719.838.5716.3416.809.68杂合类3.3915.245.124.4231.689.51总684.131739.251603.501407.302295.412361.91
为进一步比较嗜盐四联球菌添加方式对酱油风味的影响，将酱油中主要风味物质[30-34]进行了聚类分析。由图4可知，在酱油发酵过程中强化嗜盐四联球菌或其与鲁氏接合酵母可使酱油中主要风味物质(醇、酸、酯、酚、吡嗪等)含量显著增加，尤其是共同添加2种菌时，风味物质含量增加最多。
醇类主要是在酵母作用下生成的，嗜盐四联球菌也能产生乙醇和高级醇，并且嗜盐四联球菌在接入酵母菌20 d后添加会促进醇类的合成。单独添加嗜盐四联球菌，酱油中醇类总量比对照提高了1.9倍，其中乙醇、异戊醇、异丁醇、苯乙醇、3-甲硫基丙醇等物质的含量显著增加；在非酵母活跃期(35 d)添加嗜盐四联球菌，使醇类总量提高2.8倍(图4-a)。酸类物质主要由嗜盐四联球菌发酵产生，高浓度的有机酸类对于形成浓郁的酯香起着积极作用。单独添加嗜盐四联球菌可以使酱油中乙酸、异戊酸含量增加；在酵母活跃期(25 d)添加嗜盐四联球菌，二甲基丙二酸和戊酸分别比对照高36.9和15.8倍(图4-b)。只添加嗜盐四联球菌可使酱油中乙酸乙酯、乳酸乙酯、乳酸异戊酯等酯类含量显著增加，酯类总量比对照高3.7倍，这和添加嗜盐四联球菌发酵产生的大量乙酸、乳酸有关；在酵母活跃期(25 d)添加嗜盐四联球菌不利于酯类生成；在非酵母活跃期，尤其是发酵35 d添加嗜盐四联球菌有利于乙酸乙酯、苯乳酸酯、棕榈酸乙酯的合成，酯类总量比对照高8.9倍(图4-c)。酚类是构成酱油特征香气的重要成分，接种嗜盐四联球菌的酱油中酚类物质的含量相对较高，愈创木酚、4-乙基-愈创木酚和对乙基愈创木酚含量分别是对照的2.1、1.6和2.4倍(图4-d)。醛类物质的合成和嗜盐四联球菌有关，含有醛类物质合成的关键酶转氨酶，添加嗜盐四联球菌使酱油中主要醛类化合物(3-甲基丁醛、己醛、壬醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛等)含量显著增加(图4-e)。同时添加嗜盐四联球菌也有利于2-戊酮、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等物质含量的提高(图4-f)。有6种风味物质(3-甲硫基丙醇、异戊酸、乳酸异戊酯、DL-白氨酸乙酯、苯甲酸乙酯、4-乙基愈创木酚)在单独添加嗜盐四联球菌的酱油中可以检测到，而在对照组中没有检出。此外，酱油中的重要香气成分呋喃酮是酵母的一种代谢产物，嗜盐四联球菌的添加会显著促进呋喃酮的合成。第15天接入鲁氏接合酵母并在第35天接入嗜盐四联球菌的酱油中其含量是对照的7.4倍，是只添加鲁氏接合酵母的1.4倍。
a-醇类; b-酸类; c-酯类; d-酚类; e-醛类; f-其他
图4 酱油中主要风味物质聚类分析
Fig.4 Clustering analyses of major volatiles in soy sauce samples
3 结论
本研究通过在酱油发酵过程中添加嗜盐四联球菌，实现了嗜盐四联球菌的成功强化。酱油发酵过程中嗜盐四联球菌的生长和物质代谢与鲁氏接合酵母有一定的关联性。强化嗜盐四联球菌可以提高酱油中氨基态氮、游离氨基酸和风味物质的含量。发酵15 d添加酵母菌并在25 d添加嗜盐四联球菌可使氨基酸总量增加34.0%，其中鲜味氨基酸和甜味氨基酸分别增加了34.0%和27.0%。单独添加嗜盐四联球菌使挥发性物质总量提高了154.5%，包括异戊醇、苯乙醇、苯乙醛、糠醛、乳酸乙酯、对乙基愈创木酚等19种风味物质含量显著增加。嗜盐四联球菌与鲁氏接合酵母共同添加更有利于风味物质形成，醇类、酸类、酯类和酚类含量最高可以分别增加282.7%、1612.0%、895.4%和123.6%。在先添加鲁氏接合酵母时，嗜盐四联球菌添加时间在对各类风味物质含量增加的影响上不完全具有一致性：在25 d添加嗜盐四联球菌有利于酸类、酚类和杂合类物质含量的提高；在35 d添加嗜盐四联球菌有利于醇类和酯类物质含量的提高。本研究结果阐明了高盐稀态酱油发酵过程中嗜盐四联球菌在影响氨基酸和风味物质含量方面的功能，可为酱油发酵过程中强化功能菌株提供参考，对于开发提高酱油品质的生物技术具有重要意义。
[1] 耿予欢, 谢显华, 李国基.酱油发酵过程中细菌群落结构的动态变化[J].现代食品科技.2015, 31(8):83-87.
[2] 张书泰, 周斌, 童星,等.酱油酿造过程中微生物多样性分析方法研究进展[J].中国调味品.2019, 44(2):193-200.
[3] 邹阳. 高盐稀态酱油生产过程中生物胺的形成机制及发酵调控研究[D].广州:华南理工大学, 2012.
[4] YAN Y Z, QIAN Y L, JI L D, et al.Microbial composition during Chinese soy sauce koji-making based on culture dependent and independent methods[J].Food Microbiology.2013, 34(1):189-195.
[5] 谢显华. 酱油发酵过程微生物群落结构的动态研究[D].广州:华南理工大学, 2010.
[6] SONG Y R,JEONG D Y,BAIK S H.Monitoring of yeast communities and volatile flavor changes during traditional Korean soy sauce fermentation[J].Journal of Food Science,2015,80(9):2 005-2 014.
[7] 梁恒宇,邓立康,林海龙. 传统发酵大豆食品中乳酸菌的分布、功能和应用[J].食品科学,2013, 34(19):381-385.
[8] HARADA R, YUZUKI M, ITO K, et al.Fukusaki E.Influence of yeast and lactic acid bacterium on the constituent profile of soy sauce during fermentation[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2017, 123(2):203-208.
[9] OGASAWARA M, YAMADA Y, EGI M.Taste enhancer from the long-term ripening of miso (soybean paste)[J].Food Chemistry,2006, 99(4):736-741.
[10] UDOMSIL N, RODTONG S, TANASUPAWAT S, et al.Proteinase-producing halophilic lactic acid bacteria isolated from fish sauce fermentation and their ability to produce volatile compounds[J].International Journal of Food Microbiology,2010,141(3):186-194.
[11] NOSAKA S, MIYAZAWA M.Characterization of volatile components and odor-active compounds in the oil of edible mushroom Boletopsis leucomelas[J].Journal of Oleo Science,2014, 63(6):577-583.
[12] DEVANTHI P V P, LINFORTH R, ONYEAKA H, et al.Effects of co-inoculation and sequential inoculation of Tetragenococcus halophilus and Zygosaccharomyces rouxii on soy sauce fermentation[J].Food Chemistry,2018, 240:1-8.
[13] CUI R Y, ZHENG J, WU C D, et al.Effect of different halophilic microbial fermentation patterns on the volatile compound profiles and sensory properties of soy sauce moromi[J].European Food Research and Technology,2014, 239(2):321-331.
[14] KIM K H, LEE S H, CHUN B H, et al.Tetragenococcus halophilus MJ4 as a starter culture for repressing biogenic amine (cadaverine) formation during saeu-jeot (salted shrimp) fermentation[J].Food Microbiology,2019, 82:465-473.
[15] 松本伊左尾, 今井诚一, 吴世君,等.乳酸菌和酵母菌的添加时期及添加量对酱醪发酵的影响[J].中国调味品,1989(7):29-33.
[16] 张丽. 高盐稀态酱油发酵过程中添加酵母的研究[D].贵阳:贵州大学, 2019.
[17] 张继冉. 酱油中氨基甲酸乙酯的产生机制和消除策略研究[D].无锡:江南大学, 2016.
[18] ERINC H, TEKIN A, MUSA ÖZCAN M.Determination of fatty acid, tocopherol and phytosterol contents of the oils of various poppy (Papaver somniferum L.) seeds[J].Grasas Y Aceites,2009, 60(4):375-381.
[19] 刘晶晶. 风味酵母与米曲霉协同制曲酿造酱油的研究[D].武汉:湖北工业大学, 2015.
[20] 仇钰莹. 浓香型白酒中氨基甲酸乙酯形成途径解析[D].无锡:江南大学, 2016.
[21] BAYROCK D P, INGLEDEW W M.Inhibition of yeast by lactic acid bacteria in continuous culture:Nutrient depletion and/or acid toxicity?[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2004, 31(8):362-368.
[22] NODA F, HAYASHI K, MIZUNUMA T.Antagonism between osmophilic lactic acid bacteria and yeasts in brine fermentation of soy sauce[J].Appl Environ Microbiol, 1980, 40(3):452-457.
[23] DEVANTHI P V P, LINFORTH R, ONYEAKA H, et al.Effects of co-inoculation and sequential inoculation of Tetragenococcus halophilus and Zygosaccharomyces rouxii on soy sauce fermentation[J].Food Chemistry, 2018, 240:1-8.
[24] HERRANZ B, FERNANDEZ M, HIERRO E, et al.Use of Lactococcus lactis subsp.cremoris NCDO 763 and α-ketoglutarate to improve the sensory quality of dry fermented sausages[J].Meat Science, 2004, 66(1):151-163.
[25] ZHAO C J, SCHIEBER A, GANZLE M G.Formation of taste-active amino acids, amino acid derivatives and peptides in food fermentations-A review[J].Food Research International, 2016, 89:39-47.
[26] MINAMI H, SUZUKI H, KUMAGAI H.Salt-tolerant γ-glutamyltranspeptidase from Bacillus subtilis 168 with glutaminase activity[J].Enzyme and Microbial Technology,2003, 32(3-4):431-438.
[27] KIJIMA K, SUZUKI H.Improving the umami taste of soy sauce by the addition of bacterial γ-glutamyltranspeptidase as a glutaminase to the fermentation mixture[J].Enzyme and Microbial Technology, 2007, 41(1-2):80-84.
[28] 王博. 酱醪嗜盐四联球菌菌株特性比较及功能研究[D].无锡:江南大学, 2018.
[29] FENG Y Z, SU G W, ZHAO H F, et al.Characterisation of aroma profiles of commercial soy sauce by odour activity value and omission test[J].Food Chemistry, 2015, 167:220-228.
[30] 冯云子. 高盐稀态酱油关键香气物质的变化规律及形成机理的研究[D].广州:华南理工大学, 2015.
[31] KANEKO S, KUMAZAWA K J, NISHIMURA O.Studies on the key aroma compounds in raw (unheated) and heated Japanese soy sauce[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(14):3 396-3 402.
[32] FENG Y Z, CAI Y, SU G W, et al.Evaluation of aroma differences between high-salt liquid-state fermentation and low-salt solid-state fermentation soy sauces from China[J].Food Chemistry, 2014, 145:126-134.
[33] 赵谋明, 蔡宇, 冯云子.HS-SPME-GC-MS/O联用分析酱油中的香气活性化合物[J].现代食品科技, 2014, 30(11):204-212.
[34] LEE K E,LEE S M,CHOI Y H,et al.Comparative volatile profiles insoy sauce according to inoculated microorganisms[J].Bioscience, Biotechnology,and Biochemistry,2013,77(11):2 192-2 200.
附表1 酱油样品中挥发性物质的相对含量
Appendix Table 1 Relative content of Volatiles in soy sauce samples
物质保留时间/minCAS含量/(μg·L-1)对照TZZ+TZ+T(25)Z+T(35)醇类Ethanol4.42764-17-15100.36335.92776.41489.49104.981157.942-Butanol6.29578-92-2ND0.29NDNDNDNDIsobutanol8.05378-83-110.4132.6534.0133.6811.8346.362-Pentanol8.6516032-29-70.741.332.012.281.533.051-Butanol9.23771-36-30.230.999.045.931.5125.813-Methyl-1-butanol10.795123-51-3319.49791.99428.16466.55653.54546.203-Isopentenylalcohol11.685763-32-61.802.850.390.612.030.932-Heptanol13.362543-49-7NDNDND2.98NDND2-Undecanol13.3511653-30-15.26NDNDNDNDNDHexylalcohol14.079111-27-30.27ND0.600.52NDND2-Chloroethanol14.512107-07-30.621.240.610.461.030.563-Heptanol,5-methyl-14.85218720-65-5NDNDND0.20NDND3-Pentanol15.141584-02-1ND0.110.250.20ND0.523-Methylthiopropanol19.833505-10-2ND5.983.3511.03ND13.94Benzylalcohol21.624100-51-6ND1.24NDNDND0.63Benzeneethanol22.07860-12-898.42218.87148.19198.00471.62264.323-Hydroxy-2-methyl-4-pyrone22.508118-71-80.812.251.381.163.47NDSubtotal538.411395.711404.41213.091251.542060.26醛类(20)3-Methylbutyraldehyde3.99590-86-37.6912.238.6213.9721.8315.53Hexana7.4366-25-17.2519.32ND2.0111.8212.752-methyl-2-butenal7.698497-03-0ND0.45ND0.564.70NDHeptaldehyde9.968111-71-71.421.280.52ND0.79NDoctanal12.529124-13-05.814.382.514.184.506.341-Nonanal14.788124-19-68.9416.117.368.137.2614.94Furfural16.0298-01-12.154.983.143.863.235.55Benzaldehyde17.003100-52-710.5617.1115.8920.33ND22.86(Z)-6-Nonenal17.1832277-19-20.74NDNDNDNDNDUndecanal18.168112-44-70.10ND0.15NDNDNDPhenylacetaldehyde18.677122-78-15.3618.7410.0015.3922.0218.902-Methylbenzaldehyde18.79529-20-41.703.62ND3.35ND4.55gamma-Nonanolactone23.168104-61-0NDNDND1.162.32NDtrans,trans-2,4-Nonadienal19.4645910-87-2NDNDNDND0.280.35trans-2-Undecenal20.07353448-07-09.612.00NDNDND2.122,4-nonadienal20.21821662-15-70.210.55NDNDNDND2,4-Decadienal20.7692363-88-40.320.97NDND0.900.80Undecan-4-olide23.169104-67-6ND0.91NDNDNDND5-Hydroxymethylfurfural27.71367-47-0NDNDNDND1.29NDSubtotal66.08105.2553.4375.3682.63106.71酸类(15)Aceticacid15.77364-19-73.8518.8721.9421.3212.9232.21Valericacid18.984109-52-441.34NDNDND694.35NDPropionicacid17.16779-09-4NDND0.12ND2.22NDDimethylmalonicacid17.608595-46-03.71NDND7.64140.713.16Isovalericacid18.983503-74-2ND132.14NDNDNDND3,3-Dimethylacrylicacid20.533541-47-9NDNDNDND0.42NDHexanoicacid21.083142-62-1NDNDNDND0.310.84Phosphonicacid22.82433795-18-5NDND0.38NDNDND4-Hydroxybenzenesulfonicacid22.82898-67-90.28NDND0.49NDNDOctanoicacid23.324124-07-20.100.280.340.21ND0.58
续表1
物质保留时间/minCAS含量/(μg·L-1)对照TZZ+TZ+T(25)Z+T(35)Nonanoicacid24.356112-05-00.481.140.27ND0.650.59Decanoicacid25.334334-48-5NDND0.27NDNDNDPalmiticacid26.12357-10-3NDND0.82NDNDND2-Propenoicacid26.464614-60-8NDND0.73NDNDNDBenzoicacid26.90665-85-0NDND0.44ND0.33NDSubtotal49.76152.4425.3129.66851.9137.38酯类(24)Ethylacetate3.574141-78-61.0414.551.731.150.6975.5Methyl2-methylbutyrate5.819868-57-5ND0.29ND1.030.02NDIsobutylacetate5.898110-19-0NDND0.67NDND0.81Butylacetate5.903123-86-4NDNDND0.57NDEthyl2-methylpropanoate4.92797-62-10.10NDND0.37NDNDEthyl2-methylbutyrate6.8187452-79-10.96NDNDNDNDNDEthylcaproate11.23123-66-0NDND0.01ND1.87NDEthylisovalerate7.17108-64-51.17NDND0.63NDNDIsoamylacetate8.428123-92-20.930.933.202.800.483.98Isoamyl2-methylbutyrate12.27327625-35-0NDNDNDND0.17NDEthyllactate13.81497-64-30.899.144.184.01ND6.01octyl2-methylprop-2-enoate14.1882157-01-9NDND0.48NDNDNDIsopentyllactate17.71319329-89-6ND5.79NDNDNDNDEthyl2-hydroxyisocaproate16.91910348-47-7ND5.89NDNDNDNDalpha-methyl-gamma-butyrolactone17.9981679-47-60.18NDND1.985.47NDGamma-Valerolactone18.279108-29-20.621.16ND0.261.50NDMethylbenzoate18.44793-58-31.01ND0.25NDND1.59gamma-Butyrolactone18.5396-48-01.192.59NDNDNDNDEthylbenzoate19.04493-89-0ND1.867.53NDNDNDDiethylsuccinate19.099123-25-1NDND0.81NDND1.754-Hexanolide19.504695-06-70.340.670.340.351.070.45Ethylphenylacetate20.486101-97-30.291.011.492.04ND1.52gamma-Octanoiclactone23.17104-50-70.53NDNDNDNDNDEthylpalmitate25.199628-97-7NDND0.290.92ND0.46Diisobutylphthalate28.12784-69-5NDND0.51NDNDNDMethyllinolelaidate27.9172566-97-4NDNDND0.24NDNDSubtotal9.2543.8371.4646.3511.2792.07酮类(13)2-Butanone3.73678-93-3NDNDNDND4.33ND2-Pentanone5.126107-87-9ND1.211.860.373.601.803,4-Hexanedione4437-51-8NDNDND0.12ND0.133-Hydroxy-2-butanone12.464513-86-0ND0.611.48NDND2.734-Octen-3-one12.8314129-48-7NDND0.42NDND0.861-Octen-3-one12.8344312-99-61.57NDND0.85NDND4-methyloxolan-2-one18.3431679-49-80.410.85NDND1.39ND2,2,6-Trimethylcyclohexane-1,4-dione20.41520547-99-30.120.270.13ND0.40NDNDGeranylacetone21.2463796-70-1NDND0.14ND0.17NDMethylcyclopentenolone20.9780-71-7NDNDND0.09NDND3-Methylbut-2-enolide21.7016124-79-4NDNDNDND0.62NDMethylfuraneol23.74227538-09-64.73ND25.1915.8935.2335.62-Dodecanone24.0066175-49-10.32NDNDNDNDNDSubtotal7.152.9429.2217.3245.7441.12烷烃类(4)Octamethylcyclotetrasiloxane5.67556-67-2ND0.750.60.580.210.1Undecane7.6621120-21-4NDND1.40NDNDNDDecamethylcyclopentasiloxane9.473541-02-6ND0.290.330.330.430.51
续表2
物质保留时间/minCAS含量/(μg·L-1)对照TZZ+TZ+T(25)Z+T(35)Oxirane,2-methyl-2-phenyl-20.8422085-88-31.222.973.663.853.204.57Subtotal1.224.015.994.763.845.18酚类(7)Guaiacol21.31790-05-11.723.522.062.515.103.17Phenol22.831108-95-2ND0.75NDND1.09ND4-Ethyl-2-methoxyphenol23.1242785-89-92.554.143.006.066.003.072-Ethylphenol24.49690-00-6NDNDND0.67ND0.394-Ethylphenol24.499123-07-9ND0.440.41ND0.84ND4-Hydroxy-3-methoxystyrene24.7247786-61-04.3510.561.556.303.452.652,4-Di-tert-butylphenol25.67496-76-40.250.421.550.800.320.40Subtotal8.8719.838.5716.3416.89.68杂合类(15)2-Pentylfuran11.1033777-69-30.390.48NDND0.480.802-Methylpyrazine12.029109-08-00.501.070.58NDNDND2,6-Dimethylpyrazine13.509108-50-90.651.500.790.683.741.67Ethylpyrazine14.6913925-00-3NDNDNDND0.490.562-Ethyl-6-methylpyrazine14.69413925-03-60.280.490.831.102.582.022,3,5-Trimethylpyrazine15.04814667-55-10.500.840.850.802.49ND3-Ethyl-2-methyl-1,3-hexadien15.22661142-36-7NDNDNDND0.29ND3-(Methylthio)propionaldehyde-dimer-(B)15.8773268-49-3ND10.15NDND13.17NDPyrazine,2-ethyl-3,5-dimethyl-16.07213925-07-0NDNDNDND0.981.11Tetramethylpyrazine16.2881124-11-4NDND0.290.100.640.632-ethyl-3,5,6-trimethylpyrazine16.90717398-16-2NDNDNDNDND0.66Ethyl2-furylketone17.7783194-15-8NDND0.51NDNDND5,5-dimethyl-4-propan-2-ylidene-1H-pyrazole18.093106251-09-61.07ND1.271.372.652.062,3-Dihydrobenzofuran26.47496-16-2ND0.71ND0.370.22NDSubtotal3.3915.245.124.4231.689.51总计684.131741.251603.51407.32295.412361.91
注：ND表示未检出；T表示在15 d添加T.halophilus R44；Z表示在15 d添加Z.rouxii ZQ02；Z+T表示在15 d添加Z.rouxii ZQ02和T.halophilus R44；Z+T(25)表示在15 d添加Z.rouxii ZQ02并在25 d添加T.halophilus R44；Z+T(35)表示在15 d添加Z.rouxii ZQ02并在35 d添加T.halophilus R44