杏为蔷薇科杏属,起源于我国新疆[1]。新疆阿克苏库车县素有“中国杏乡”之称,其中,库车小白杏是地理标识产品之一。杏果含有丰富的维生素、糖类、柠檬酸、苹果酸等营养成分,性味甘酸、微温,故具有生津止渴,清热解毒的特点,有一定的保健和防癌作用,深受广大群众的喜爱[2]。然而,由于库车小白杏为典型的呼吸跃变型果实,且鲜果成熟期较为集中,采后易腐败变质,严重制约了其生产、销售和新疆特色林果业的发展[3-4]。一般认为,杏果的软腐变质除了与其生理生化过程相关外,主要由病原真菌引起,与其大量繁殖有关[5]。目前,杏果的相关研究主要集中在贮藏保鲜[6-7]和真菌侵染防治[8-9]等方面,常采用气调贮藏、低温贮藏、冰温贮藏、涂膜保鲜、化学保鲜剂处理等方法,以降低杏果的生理活性和抑制病原菌的生长[10],鲜有杏果采后细菌性病害的报道,暂未见库车小白杏病原细菌的相关研究。
本研究以采后自然软腐变质的库车小白杏为对象,通过传统可培养法对其潜在病原细菌进行分离、筛选,并对其16S rDNA序列和生理生化特性进行了分析。同时,验证并分析了主要潜在病原细菌的致病能力和药敏特性,为库车小白杏采后贮藏保鲜、软腐及病害的防治等相关研究提供了基础,为进一步从微生物角度阐明库车小白杏采后软腐变质的内在机理提供了科学依据。
库车小白杏,2019年6月采自新疆阿克苏市库车县乌恰镇的4个果园中。采用随机法采样,并根据转黄率将果实分为青熟期(着色面积<20%)、转色期(着色面积40%~60%)和完熟期(着色面积>80%)3种不同成熟度[1],选择果实自然成熟,无机械伤痕,无病变,且表皮有光泽,颜色、大小、硬度等表观一致的小白杏(2.0~2.5) cm×(2.5~3.0) cm,经发泡网包裹装筐后,12 h内运回实验研究室,2 ℃下进行贮藏试验。试验组于室温下贮藏,用于软腐病原细菌的分离。
药敏纸片(青霉素 10 IU/片、万古霉素 30 μg/片、环丙沙星5 μg/片、克林霉素15 μg/片、红霉素15 μg/片、氨苄西林10 μg/片、磺胺甲恶唑23.75 μg/片、氯霉素30 μg/片、利福平5 μg/片、链霉素10 μg/片、庆大霉素10 μg/片、阿米卡星30 μg/片、四环素30 μg/片、妥布霉素10 μg/片、卡那霉素30 μg/片、诺氟沙星10 μg/片),北京天坛生物制品股份有限公司。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextros agar,PDA):200 g马铃薯去皮切块后热水煮25~35 min,过滤后加入葡萄糖20 g,琼脂18 g,水1 000 mL,调节pH 7.0。
38号培养基:葡萄糖4 g,麦芽浸粉3 g,酵母粉4 g,NaCl 5 g,琼脂18 g,水1 000 mL,调节pH 7.2。
1.3.1 菌株的分离与纯化
小白杏样品置于自来水下冲洗干净,经酒精棉擦拭后,晾干,无菌条件下去皮,利用平板划线法、稀释涂布法(切取病健交界处组织10 g加入至90 mL灭菌的8.5 g/L生理盐水中,匀浆,并将组织悬液稀释,按10-1、10-2梯度稀释至10-3,取0.1 mL组织悬液均匀涂布于PDA和38号培养基上),对自然软腐杏果中的主要病原细菌进行分离、筛选。同时,设置3个重复,于28 ℃条件下进行培养,每间隔24 h观察其变化情况。
待菌落长出,根据菌落的形态、大小及颜色进行初步筛选,将不同形态的单菌落划线接种于新培养基上,再次进行培养,不断重复此操作,直至得到形态单一的菌落为止。纯化后的菌株接种至PDA培养基斜面上,于4 ℃下保存备用[11]。
1.3.2 菌株的分子鉴定
采用菌落克隆方法,利用细菌16S rDNA序列通用引物27 F和1492 R进行PCR扩增[12]。条件为95 ℃、5 min;95 ℃、1 min,55 ℃、1 min,72 ℃、2 min,30个循环;72 ℃、10 min。PCR产物经切胶纯化回收后,送往北京鼎国生物技术有限公司进行测序。
所测得的序列经人工校正后,上传EzTaxon 数据库(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/ identify)进行比对,并调取相关模式菌株序列,使用MEGA 5.0进行Clustal X多重比对,并使用Neighbor-Joining法构建系统发育树,自举值为1 000,初步确定菌株的生物学分类地位[13-14]。
1.3.3 菌株生理生化鉴定
革兰氏染色、接触酶、氧化酶、水解淀粉、D-葡萄糖产酸、利用甘油产生二羟基丙酮等生理生化反应参考《伯杰氏细菌鉴定手册》《常见细菌系统鉴定手册》,唯一碳源利用采用Biolog GNII板,并参照说明书进行操作[15-17]。
1.3.4 菌株致腐能力验证
青熟期、转色期、完熟期的库车小白杏(5个为1组)于无菌条件下,采用离体接种法对菌株的致病能力进行测定。使用酒精棉对库车小白杏进行表面消毒后,无菌水冲洗,晾干,用0.1 mL无菌针头从PDA平皿培养的新鲜菌落中挑取小量菌苔,将其穿刺接种于果肉中(接种深度距表皮2 mm),采用保鲜膜包裹伤口处,于室温25 ℃下进行贮藏。同时,分别设置未接种的自然对照组和接种无菌水的实验阴性对照组,以上实验组均设置3个重复。观察并记录库车小白杏的发病情况[18]。
1.3.5 致腐菌的再分离和比较
酒精棉对接种组中发生软腐杏果的表皮进行擦拭消毒,无菌条件下去皮,并采用划线培养法、稀释涂布法对病灶组织中的微生物进行分离、纯化及鉴定,并与接种菌株进行比较。
1.3.6 药物敏感试验
采用纸片扩散法[19],无菌条件下,取0.1 mL菌悬液涂布于培养基上,在距培养基中心2.5 cm处的4个垂直点分别放置药敏试纸,每个处理作3个平行和1个空白对照,于28 ℃下培养3~7 d,观察菌株XAAS-XY2与各药敏试纸之间是否存在透明抑菌圈,存在透明抑菌圈则为阳性,并测量透明抑菌圈直径,用以判断菌株对各类药物的敏感性。
由于库车小白杏采后存在后熟过程,较难贮藏。因而长途运输小白杏时,通常选择表皮黄色面积为20%~40%的青熟期杏果进行采摘(图1-a),此时果实具有一定硬度,口感较酸略涩。而货架期的杏果,一般于其转色期进行采摘(图1-b),此时表皮黄色面积为40%~60%,果实硬度略微下降,口感酸甜,自然放置约3 d后进入完熟期(图1-c),表皮黄色面积>90%,果实硬度降低,开始出现软化,口感香甜无酸涩;继续放置1~2 d后,表皮完全变黄,果肉完全软化,并呈现半透明状态,具有一定流动性和较高的甜度。
a-青熟期;b-转色期;c-完熟期
图1 不同成熟度的库车小白杏
Fig.1 Kuqa apricot with different maturity stages
库车小白杏极易在采摘、运输及贮藏等过程中发生机械损伤,导致杏果快速软腐变质。以青熟期的库车小白杏为例,室温条件下,采后第3~4天机械损伤部位开始出现浅棕色、轻微的水渍状斑点,1~2 d后,水渍状斑点迅速扩展(图2-a);继续放置1 d后,病斑扩展至全果且颜色显著加深,由浅棕色逐渐变成深褐色(图2-b、图2-c);继而杏果严重失水,并伴随严重的真菌侵染现象(图2-d)。
a-第4~6天;b~c-第5~7天;d-第8天
图2 不同腐败变质程度的库车小白杏
Fig.2 Kuqa apricot with different degree of decay
通过对软腐小白杏中潜在致病菌的分离、纯化、去重,实验获得了1株菌落较小(直径为1.0~1.5 mm)、圆形、略隆起、边缘整齐、黏稠、白色(图3-a所示)的细菌,命名为XAAS-XY2。该菌株为革兰阴性菌、杆状(图3-b)。经 PCR 扩增和16S rDNA序列测定及比对,并构建该菌株系统发育进化树(图4),确定菌株XAAS-XY2归属于葡糖杆菌属(Gluconobacter),其与已知模式菌株Gluconobacter frateurii NBRC 3264T和Gluconobacter japonicus NBRC 3271T序列相似性均为99.93%,与Gluconobacter thailandicus F149-1T序列相似性为99.77%,暂不能确定其具体分类。
a-菌落形态;b-菌体显微形态
图3 菌株XAAS-XY2的形态特征
Fig.3 Morphological characteristics of strain XAAS-XY2
对菌株XAAS-XY2生理生化特性进行分析,结果表明,氧化酶、水解淀粉、液化明胶、D-木糖产酸、麦芽糖产酸均呈阴性;接触酶、D-葡萄糖产酸利用甘油产生二羟基丙酮呈阳性;可利用阿拉伯糖醇、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖为其生长提供能量。其与Gluconobacter frateurii ATCC 49207T和Gluconobacter japonicus NBRC 3271T均存在一定差异(表1),具体分类学地位仍有待进一步系统分类。因此,该菌暂定名Gluconobacter sp. XAAS-XY2。
图4 菌株XAAS-XY2 16S rDNA序列
构建的系统进化树
Fig.4 Phylogenetic tree of strain XAAS-XY2
based on 16S rDNA sequences
表1 菌株XAAS-XY2生理生化鉴定指标
Table 1 Physiological and biochemical characteristics of
strain XAAS-XY2
鉴定项目G. Frateurii ATCC 49207TG. Japonicus NBRC 3271TXAAS-XY2革兰氏染色---氧化酶---接触酶+++水解淀粉---明胶---D-葡萄糖产酸+++D-木糖产酸-+-麦芽糖产酸w+-利用甘油产二羟基丙酮+++阿拉伯糖醇+++D-半乳糖--+α-D-葡萄糖 +++L-阿拉伯糖+++
注:+表示有活性;-表示无活性;w表示弱阳性
实验利用离体接种法,验证了菌株XAAS-XY2对采后青熟期、转色期、完熟期库车小白杏的致腐效果。结果表明,菌株XAAS-XY2对采后不同成熟度的库车小白杏均表现出了较强的致腐能力(图5、图6),但对完熟期的致腐能力最强,接种48 h时,致腐率为60%;接种96 h时,致腐率达100%。其次为转色期,接种48 h时,致腐率为40%;接种96 h时,致腐率达100%。其对青熟期的致病能力最弱,接种48 h 时,致腐率为20%;接种96 h时,致腐率达100%。而在自然对照组中,完熟期虽最快出现软腐症状,但与以上接种组相比,其在相同条件下放置48 h时,未出现任何病斑及软腐症状;放置96 h时,仅个别杏果出现轻微的浅棕色病斑,软腐率约为26.67%,由此可见,接种菌株XAAS-XY2的小白杏提前2 d出现了明显的软腐现象,且致腐率高达100%(图7)。
图5 在不同成熟期杏果上接种XAAS-XY2的致腐情况
Fig.5 Decay ratio of Kuqa apricot in different maturity
stages strain XAAS-XY2
a-青熟;b-转色;c-完熟
图6 接种XAAS-XY2 96 h时不同时期小白杏
软腐发病特征
Fig.6 Decay character of Kuqa apricots in different matturity
stage inoculated XAAS-XY2 after 96 h
图7 不同处理144 h时不同时期小白杏软腐发病特征
Fig.7 Decay of Kuqa apricot with treatments after
144 h in different maturity stages
为进一步证实菌株XAAS-XY2是引发小白杏采后软腐变质的主要病原细菌,实验分别对接种组中出现软腐的果肉、另一侧未接种但出现软腐的果肉、自然对照组中出现软腐的果肉,进行了主要微生物的分离、纯化与鉴定。结果如表2所示,菌株XAAS-XY2大量分布于上述3组样品中,且均为绝对优势菌群(图8)。
综上所述,实验证明了菌株XAAS-XY2是导致库车小白杏采后软腐变质的主要病原细菌。
表2 菌株XAAS-XY2分子鉴定
Table 2 Molecular identification of strain XAAS-XY2
菌株最近模式菌株相似性/%XAAS.XY2Gluconobacter frateurii NBRC 3264(T)99.87接种组病灶菌株Gluconobacter frateurii NBRC 3264(T)99.87
图8 接种组病灶组织划线菌落形态
Fig.8 Colony morphology of bacteria from decay
focus by streaking on PDA
实验测试了常用细菌抗生素对菌株XAAS-XY2的抑制作用,结果如表3所示。卡那霉素、四环素、妥布霉素、阿米卡星、链霉素、利福平、庆大霉素、诺氟沙星对菌株XAAS-XY2均表现出了较强的抑制作用。其中,卡那霉素、四环素、妥布霉素对其抑制作用最强(图9),抑菌直径均>30 mm;阿米卡星次之,抑菌直径约为23 mm;链霉素、利福平、庆大霉素、诺氟沙星对其抑制作用较弱,抑菌直径均<20 mm。而青霉素、万古霉素、环丙沙星、克林霉素、红霉素、氨苄西林、磺胺甲恶唑、氯霉素对其未表现出明显的抑制作用。
表3 常用抗生素对菌株XAAS-XY2的抑制作用
Table 3 Inhibitory effect of common antibiotics on
XAAS-XY2
序号名称抑菌直径/mm1空白对照 空白对照2青霉素 -3万古霉素 -4环丙沙星 -5克林霉素 -6红霉素 -7氨苄西林 -8磺胺甲恶唑-9氯霉素 -10利福平 1911链霉素 1912庆大霉素 1813阿米卡星 2314四环素 3515妥布霉素 3516卡那霉素 3717诺氟沙星 17
10-利福平;11-链霉素;12-庆大霉素;13-阿米卡星;
14-四环素;15-妥布霉素;16-卡那霉素;17-诺氟沙星
图9 抗生素对菌株XAAS-XY2的抑制情况
Fig.9 Inhibition of strain XAAS-XY2 by antibiotics
库车小白杏为呼吸跃变型果实,极易软腐变质。采后自然放置3~5 d后会出现浅棕色小斑点,后发展为深褐色病斑,中央稍凹陷,边缘水渍状,随后迅速扩展,继而全果软化、腐烂,甚至霉变。一般认为,库车小白杏的软腐变质由真菌引起,国内先后分离出白曲霉(Aspergillus niger)、粉红单端孢霉(Trichothecium roseum)、链格孢霉(Alternaria alternata)和天门冬拟茎点霉(Phomopsis asparagi)等病原真菌[20-21]。本研究前期通过Biolog Eco生态板法结合高通量测序法,首次从内生细菌的角度揭示了库车小白杏内生细菌群落结构随着成熟度的增加,存在明显的更替,主要菌群由蟑螂杆状体科未分类属演替为葡糖杆菌属和泛菌属,并成为绝对优势菌群;其他非优势菌群则显著下降[22]。
葡糖杆菌存在于含糖丰富的环境中[23],甚至出现在食醋[24]、酸奶[25]、红酒[26]、果汁、酒精饮料中[27-28],易导致植物、果实的腐烂,致使食醋返混,酸奶变色,红酒、果汁变质。但对人畜无致病性。目前,少量研究表明,葡糖杆菌常大量附着于瓜果的表面或果实内部。如张大为等[29]率先发现葡糖杆菌属、不动杆菌属微生物在腐烂、霉变的柑橘中大量存在;谭才邓等[30]从腐烂的水果中筛选出了醋酸高产菌-弗氏葡糖杆菌(Gluconobacter frateurii);朱艺恒等[31]发现自然腐败的南丰蜜橘中也存在产醋酸的葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.);姜蕾等[32]发现新疆酿酒葡萄表皮中白葡糖杆菌(Gluconobacter albidus)为优势菌属。近些年,随着高通量测序技术的快速发展,戴宝玲等[33]进一步证明了葡糖杆菌属是草莓表面的主要微生物,并推测其可能是导致草莓污染的重要病原菌;张源等[34]对自然发酵草莓酒中的细菌群落进行研究发现,葡糖杆菌属与柠檬酸菌属在草莓酒的后期陈酿过程中可能发挥了重要作用。
本研究从采后软腐变质的库车小白杏中分离获得了1株病原细菌XAAS-XY2,经鉴定确定其归属于葡糖杆菌属。并将其分别接种于青熟期、转色期、成熟期的库车小白杏中,均出现了明显的软腐现象。其中,对完熟期的致病能力最强,接种96 h致腐率高达100%,且与自然对照组相比,接种组提前2 d出现了软腐现象。同时,对接种组中软腐组织的微生物进行了再分离,证明了软腐杏果组织中的主要菌群为XAAS-XY2,进一步证实了XAAS-XY2是导致小白杏软腐变质的主要病原细菌。
另外,本研究发现卡那霉素、四环素、妥布霉素、阿米卡星、链霉素、利福平、庆大霉素、诺氟沙星对菌株XAAS-XY2均表现出了较强的抑制作用。然而,由于果实采摘期和储存期严禁相关化学药物的使用,特别是抗生素的滥用,因而上述抗生素不宜在该时期使用。然而,植物内生菌的定殖和演变受多种因素的影响。如崔凯[35]发现农药的使用能明显影响和改变内生细菌组成。吡虫啉、噻虫嗪和苯醚甲环唑使根部群落丰富度降低;毒死蜱使水稻根内生及根围土壤中细菌群落发生了变化,低浓度可使菌群多样性提高,高浓度则会抑制。因此,选用对菌株XAAS-XY2有抑制作用的相应抗生素,选择合适的小白杏树生长周期,通过使用不同药物或相关措施,改变内生菌的组成,阻断葡糖杆菌属病原细菌进入杏果实内,以减少其适应、定殖为内生菌的概率,为源头控制小白杏采后软腐的发生提供了新思路。
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