甜橙油是重要的食品添加剂及化工原料，目前主要用作制备乳液的载体油，其乳液广泛应用于食品饮料、化妆品、日用品等行业[1-2]。甜橙油是一类复杂的有机化合物，包含200多种化学物质成分，主要成分为柠檬烯和芳樟醇，属于萜烯类[3]。这些小分子物质赋予天然香味，并且其多样化功能如抗菌性、抗氧化、抗炎性、抗癌以及抗乙酰胆碱酯酶的潜力使其在工业化生产上有更广泛的应用[4-5]。但是这些小分子物质易挥发，在食品的加工和贮藏过程中易受光、热、氧气影响产生不愉快的味道，并且大都是亲脂性的，所以在水体系的产品比如饮料中表现出较低的溶解度，而低溶解性限制了其在食品行业中的广泛应用[6-8]。因此，目前亟待找到能提高甜橙油在食品环境中的稳定性的方法，并在需要时控制其释放，这是芳香化合物和香料公司开发利用的一个转折点，而纳米乳化技术是提高其溶解度和风味保护的最基本的方法之一[9]。
纳米乳化技术是将水相与油相混合，利用高压均质或凝聚等方法制备成纳米乳液的技术[10]。其中，乳化剂的种类是影响纳米乳液稳定的最重要因素[10]，而天然乳化剂(如磷脂、蛋白质、多糖和皂苷类)逐步替代合成乳化剂已成为趋势。茶皂素是一种天然的非离子型表面活性剂，其表面活性参数为0.06%，具有良好的起泡能力和泡沫稳定性[11]，但作为乳化剂在食品工业中的应用还很有限，也未见其在甜橙油乳液制备中的应用。为形成更稳定的纳米乳液，在实际生产过程中，往往会油相中加入增重剂增加油相的密度，从而降低油相与水相之间的密度差。松香甘油酯是一种常用的增重剂，它是由精制木松香与非动物性来源的甘油通过酯化作用生成[12]。而松香甘油酯的添加量对乳液的稳定性表现出关键性的影响[13]。在前期实验过程中以茶皂素作为乳化剂制备甜橙油稳定性纳米乳液时，发现甜橙油和松香甘油酯在乳液中的含量对乳液平均粒径和稳定性影响显著。因此，本文采用超高压微射流技术制备甜橙油水包油纳米乳液，利用响应面分析探讨了甜橙油和松香甘油酯含量对乳液平均粒径、多分散指数(polydispersity index，PDI)、浊度、浊度损失率和D-柠檬烯氧化率的影响，以期为以小分子绿色乳化剂制备具有高稳定性的甜橙油纳米乳液产品的开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要实验材料
甜橙油，广州百花香料股份有限公司；松香甘油酯，武汉远成共创科技有限公司; 茶皂素，上海麦克林生化科技有限公司；二氯甲烷(HPLC级)，天津市科密欧化学试剂有限公司；环己酮(>99.5%，GC级)，上海麦克林生化科技有限公司；蒸馏水。
1.1.2 主要仪器设备
T25 Basic ULTRA-TURRAX高剪切混合器, 德国IKA-Werke公司；Nano DeBEE高压微射流机, 美国BEE公司；Nano ZS纳米激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；LA-950激光散射粒度分析仪，日本Horiba公司；GENESYS 10S紫外可见光分光光度计，美国Thermo Scientific公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技；PL203电子天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 水包油纳米乳液的制备及工艺优化
以甜橙油和松香甘油酯含量为2个因素，以平均粒径、PDI、浊度、浊度损失率和D-柠檬烯氧化率作为评价指标，利用响应面分析对水包油纳米乳液的制备工艺进行优化，以制备出高稳定性的甜橙油水包油纳米乳液。
经前期单因素实验得到，甜橙油含量(质量分数)为4%～8%、松香甘油酯含量(质量分数)为1%～2%对乳液的平均粒径、理化性质和稳定性等表现出显著的影响，因此以4%～8%和1%～2%分别作为甜橙油和松香甘油酯含量的优化范围，优化实验的因素水平如表1所示。
按照设定的不同比例将甜橙油和松香甘油酯在室温下搅拌2 h至混合均匀，即油相；同时将质量分数为2%茶皂素溶于蒸馏水搅拌至完全溶解，即水相。之后再将油相缓慢均匀加入水相中，同时在室温下用高剪切混合器在9 500 r/min的转速下混合3 min，混合均匀后得到粗乳液，之后高压微射流机调节压力为22 000 psi (1 psi=6.895 kPa)，均质2次，收集所得到的乳液于4 ℃密封冷藏。
表1 响应面实验因素水平表
Table 1 Response surface experiment design factor level table
水平因素甜橙油含量(X1)(质量分数)/%松香甘油酯含量(X2)(质量分数)/%-1.4143.170.79-14.001.0006.001.50+18.002.00+1.4148.822.20
1.2.2 平均粒径和粒径分布的测定
新鲜乳液制备好后，通过激光粒度仪测定平均粒径和粒径分布。最优乳液于4 ℃贮藏60 d，每5 d取1次样测定其平均粒径。测定方法：将激光粒度仪设置好测量参数条件，校正调零后，用胶头滴管吸取制备好的乳液，滴加到激光粒度仪的样品池中，超声30 s待红色条示数达80%时开始乳液粒径的测定，3次重复。
1.2.3 PDI的测定
新鲜乳液的PDI制备好后通过纳米激光粒度仪测定。最优乳液于4 ℃贮藏60 d，每5 d取1次样测定其PDI。测定方法∶乳液用50倍体积的蒸馏水稀释避免多次散射效应，设定仪器测定方法和程序后直接放入样品池测定，3次重复。
1.2.4 浊度和浊度损失率的测定
用分光光度计测定稀释乳液浊度，浊度用吸光度值表示。将新制备的乳液用100 g/L的蔗糖溶液稀释100倍，稀释后备于100 mL离心管中,4 ℃冰箱中放置30 d，每天取样。取1 mL乳液于比色皿中，在600 nm处测定其吸光度值。100 g/L的蔗糖溶液作为空白，3次重复测定。对于每一份乳液，吸光度值与储藏时间遵循一级反应[14]，反应方程如公式(1)所示：
lnA=lnA0-K1t
(1)
式中：A0，乳液贮藏第1天测定的吸光度值；A，乳液贮藏第t天测定的吸光度值；t，贮藏时间，d；K1，一级反应斜率即浊度损失率。K1越小表明乳液越稳定，货架期越长。当A=0.1A0时，乳液出现破乳，如分层等现象。浊度损失率是评价乳液在高度稀释的条件下混浊稳定性或乳液破乳速度的一个指标[14]。
1.2.5 D-柠檬烯的氧化率的测定
甜橙油乳液氧化稳定性的测定是以新鲜乳液4 ℃密封冷藏30 d后氧化柠檬烯的变化量为表征，即D-柠檬烯的氧化率，计算如公式(2)所示：
(2)
式中：D，D-柠檬烯氧化率；O1，乳液贮藏第1天测定的氧化柠檬烯生成量；O30，乳液贮藏第30天测定的氧化柠檬烯生成量；C1，乳液贮藏第1天测定的D-柠檬烯含量。
测定方法参照YANG等[15]的方法并稍作修改,取1 mL 乳液加入2 mL二氯甲烷，超声10 min，吸取下层液体，加入1 μL环己酮作为内标，过滤膜至进样小瓶，密封，进行下一步GC-MS分析。同时配制3个平行样测定。GC-MS设定升温程序为：初始温度为40 ℃，保持4 min，8 ℃/min升至220 ℃，保持5 min，之后以10 ℃/min升至240 ℃，保持0 min。样品进样量为1 μL，不分流。
1.3 数据统计与分析
利用Design-Expert (Version 8.0.6)对响应面实验进行线性回归和方差分析(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 响应面实验结果
2.1.1 二次回归模型与方差分析
采用响应面中心组合设计(central composite design,CCD)对甜橙油纳米乳液的制备条件进行优化，实验设计及结果见表2。采用CCD研究了甜橙油含量(X1)和松香甘油酯含量(X2)对乳液平均粒径(nm)(Y1)，PDI(Y2)，浊度(Y3)，浊度损失率(A/d)(Y4)，D-柠檬烯氧化率(%)(Y5)的影响。研究结果拟合得到二阶多项式方程的相关系数(R2)和修正相关系数
并对模型系数进行方差分析。软件分析结果得到二次多项式回归方程分别如下所示：
平均粒径=249.650+79.462X1-388.880X2-31.775X1X2-
PDI=0.169+0.032X1-0.106X2-0.024X1X2+0.002 
浊度
浊度损失率=0.025+0.007 409X1+0.016X2-0.003 6X1X2
D-柠檬烯氧化率
表2 响应面实验设计及结果
Table 2 Response surface experimental design and results
序列因素评价指标甜橙油含量/%松香甘油酯含量/%平均粒径/nmPDI浊度浊度损失率/(A·d-1)D-柠檬烯氧化率/%13.171.50115.40.1630.2100.005 40.3828.821.50236.20.3120.8800.018 81.8536.001.50171.10.2090.4030.010 01.0346.002.20115.10.1750.3640.007 21.0156.001.50137.00.1790.4750.006 61.1466.001.50177.50.2090.4320.014 01.2878.001.00314.20.3140.6950.019 91.6888.002.00205.60.2130.7320.007 31.4796.001.50211.80.2130.5040.009 51.19104.002.00162.00.1670.3840.007 90.76114.001.00144.00.1700.2810.006 11.03126.001.50182.50.2140.4670.011 31.21136.000.79398.50.3200.3870.015 31.76
由方差分析表(表3)可知，实验选取的甜橙油纳米乳液的平均粒径的二次回归模型显著(0.019 2)，PDI、浊度、浊度损失率和D-柠檬烯氧化率的二次回归模型极显著(0.001 5、0.000 2、0.000 3、0.000 7)、失拟项都不显著(0.057 7、0.097 1、0.132 1、0.901 7、0.102 1)，说明模型预测值与实际误差较小，即回归模型能够较好地预测各个相应的响应值。各个响应的R2值分别为：平均粒径0.807 0，PDI 0.910 2，浊度0.947 8，浊度损失率0.860 8，D-柠檬烯氧化率0.929 3。R2值都大于0.8，说明模型与实际拟合较好，二次回归方程可以较好的拟合甜橙油含量和松香甘油酯含量与乳液平均粒径、PDI、浊度、浊度损失率和D-柠檬烯氧化率之间的关系，所以这5个二次回归模型对甜橙油纳米乳液的这5个变量进行预测是可靠的。
表3 线性回归方差分析
Table 3 Analysis of variance and regression coefficients
方差来源平均粒径/nmPDI浊度浊度损失率D-柠檬烯氧化率模型 0.019 2*0.001 5**0.000 2** 0.000 3** 0.000 7**甜橙油含量(X1) 0.022 3*0.000 4** <0.000 1** 0.000 4**<0.000 1**松香甘油酯含量(X2)0.007 2**0.001 9**0.520 3 0.004 5** 0.006 5**X210.886 70.294 5 0.025 7*-0.580 7X220.067 60.130 00.284 7 -0.096 0X1X20.213 70.067 20.575 20.007 3**0.839 1失拟项0.057 70.097 10.132 10.901 70.102 1R20.807 00.910 20.947 80.860 60.929 3R2 Adj0.669 10.846 00.910 50.814 20.878 9
注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)
2.1.2 各因子对响应值的影响
图1-a描述了甜橙油和松香甘油酯含量的变化对乳液平均粒径的影响。乳液的平均粒径随着甜橙油含量的增加而增加。由于甜橙油的含量增加导致乳化剂不足以完全覆盖在所有的油滴表面，同时油滴之间相互碰撞的频率增加，使得无数的细小液滴聚集形成较大的液滴导致乳液粒径增加[16]。另外，甜橙油中主要成分柠檬烯相对于甘油三酯含有较高的水溶解度[17]，因此当甜橙油含量增加，奥氏熟化现象越容易产生从而导致乳液液滴聚集形成大液滴，乳液粒径变大。随着松香甘油酯含量的增加乳液的粒径显著降低。松香甘油酯通常用于饮料乳剂中作为增重剂避免重力分离导致乳液的不稳定[13]，并且由于其疏水性会降低奥氏熟化现象的发生几率[18]，从而避免了粒径的增加。随着松香甘油酯含量的增加，油相的密度与黏度也增加，液滴的流动性降低，因此液滴粒径的增加受到阻碍。
图1-b描述了甜橙油和松香甘油酯含量的变化与乳液PDI之间的关系。PDI是评价纳米乳液分散性的指标，其数值越小，说明分散性越好。提高甜橙油的含量乳液的PDI显著增加，粒子分散性变差。提高松香甘油酯含量的乳液PDI显著降低，粒子分散性变好。这是因为随着油含量的增加，乳液中油相与水相的密度差随之增加，乳液越容易出现分层，粒子分布越不均匀。同理，随着松香甘油酯含量的增加，乳液的流动性降低，阻止小液滴向大液滴聚集，并且降低了油相与水相的密度差，弱化了重力分离导致乳液分层的影响，所以粒子分散性越好。
图1-c, 图1-d描述了甜橙油和松香甘油酯含量的变化对乳液浊度和浊度损失率的影响。松香甘油酯含量变化对乳液浊度的影响不大，而甜橙油含量的增加导致浊度显著增加。这是因为油滴的增加加速了液滴的絮凝并改变了油相和水相的折射率，这与BUFFO等[14]的研究结论一致。另外，在松香甘油酯含量较低时，乳液浊度损失率随着甜橙油含量的增加而增加;而在松香甘油酯含量较高时，乳液浊度损失率随着甜橙油含量的增加而降低。且甜橙油在任何比例下，乳液浊度损失率随着松香甘油酯含量的增加而降低。一般情况下，饮料乳剂的浊度损失率越低,其混浊稳定性越高，相应地，消费者的感官评价也会更高[14]。
图1-e描述了甜橙油和松香甘油酯含量的变化对乳液氧化稳定性的影响。随着甜橙油含量的增加，乳液的D-柠檬烯氧化率显著增加；随着松香甘油酯含量的增加，乳液的D-柠檬烯氧化率显著降低，即氧化稳定性显著提高。事实上，油滴周围形成的表面活性剂层起着阻隔作用，减少油滴和氧化剂之间碰撞，从而降低柠檬烯的氧化速率[19-20]。但是由于橙油含量增加导致没有足够乳化剂覆盖住油滴,致使界面上油滴漂浮，小油滴聚集成大油滴,加速了与外界氧化剂的接触面积,从而导致更多的D-柠檬烯被氧化成氧化柠檬烯，乳液产生不愉快的风味。而松香甘油酯的添加提高了液滴的疏水性，减少了氧气的溶解，避免了柠檬烯的氧化，从而提高了稳定性。
2.1.3 回归模型的优化与验证
通过响应面实验结果可得到制备甜橙油纳米乳液的最优参数，即最小纳米粒径、最低PDI、最小浊度损失率和最低D-柠檬烯氧化率。根据优化结果分析，最优工艺条件为：甜橙油质量分数4.05%，松香甘油酯质量分数2.17%，优化预测值为平均粒径154.3 nm、PDI 0.171、浊度0.300、浊度损失率0.007 7 A/d、D-柠檬烯氧化率0.63%。在最佳条件下，进行3次平行实验，得到平均粒径(130.8±1.4)nm、PDI 0.178±0.010、浊度0.322±0.001、浊度损失率(0.007 2±0.002 3)A/d和D-柠檬烯氧化率(0.69±0.00)%。结果表明，预测值与实验值接近，表明回归模型是有效的。
为检验响应面模型的准确性和有效性，对优化条件点和另2个在范围内的条件点进行了实验验证，其参数条件、实验数据和百分比误差如表4所示，各个响应的预测值和实验实际值的百分比误差分别为15.2，-3.5，-7.2，12.9，-9.4(平均粒径，PDI，浊度，浊度损失率，D-柠檬烯氧化率)，实际值与预测值具有较好的拟合性，则此模型得到证实。
a-平均粒径; b-PDI c-浊度; d-浊度损失率; e-D-柠檬烯氧化率
图1 甜橙油含量和松香甘油酯含量对甜橙油纳米乳液性质的影响
Fig.1 Effect of sweet orange oil and ester gum content on the properties of sweet orange oil nanoemulsion
表4 响应面模型的验证
Table 4 Validation of the response surface model
序号甜橙油含量(质量分数)/%松香甘油酯含量(质量分数)/%(平均粒径)a(PDI)a(浊度)aOP误差/%OP误差/%OP误差/%15.001.00249.2±2.4235.1-5.90.230±0.0200.223-3.00.340±0.0010.318-6.927.002.00166.1±1.7160.1-3.70.200±0.0110.196-2.00.502±0.0030.55810.134.052.17130.8±1.4154.315.20.178±0.0100.171-3.50.322±0.0010.300-7.2序号甜橙油含量(质量分数)/%松香甘油酯含量(质量分数)/%(浊度损失率)a(D-柠檬烯氧化率)aOP误差/%OP误差/%15.001.000.010 2±0.006 00.009 6-5.71.34±0.021.25-7.027.002.000.010 3±0.006 60.008 1-15.11.43±0.011.30-10.234.052.170.007 2±0.002 30.007 712.90.69±0.000.63-9.4
注：O,实验值；P,预测值；误差/%=(P-O)/P×100；a表示预测值与实际值之间的差异不显著(P>0.05)
2.2 最优乳液的粒径分布和贮藏稳定性
图2和图3分别为最佳条件下制备的乳液的粒径分布图和乳液在4 ℃ 60 d贮藏条件下的平均粒径和PDI变化，结果表明，最优乳液在60 d后的平均粒径变化不明显，其平均粒径<140 nm，PDI<0.3，并且在4 ℃ 60 d贮藏后相比另外2份乳液悬浮较少，几乎无白色环的出现，表现出了较好的动力学稳定性(图4)。
图2 最优乳液粒径分布图
Fig.2 The droplet-size distribution curve for the emulsion
under optimal condition
图3 最优乳液(含4.05% 甜橙油和2.17% 松香
甘油酯)平均粒径和PDI变化(4 ℃贮藏60 d)
Fig.3 Changes in the mean droplet size and PDI for the
emulsion during 60 days of storage at 4 ℃
#1～#3分别对应表4序号1～3
a-贮藏前；b-贮藏后
图4 三份乳液在4 ℃ 60 d贮藏下的悬浮稳定性
Fig.4 Creaming stability of 3 kinds of emulsions during
60 days storage at 4 ℃
3 结论
通过响应面实验建立了茶皂素乳化制备甜橙油纳米乳液的回归模型，根据方差分析和响应曲面图，松香甘油酯含量对乳液平均粒径、PDI、浊度损失率和D-柠檬烯氧化率影响极显著(P<0.01)，甜橙油含量对乳液平均粒径影响显著(P<0.05)，对乳液PDI、浊度、浊度损失率和D-柠檬烯氧化率影响极显著(P<0.01)，其交互作用对乳液的浊度损失率影响极显著(P<0.01)。根据建立的多元回归模型在实验条件范围内进行预测，实验值于预测值吻合度较好。茶皂素乳化稳定甜橙油纳米乳液的优化条件为：甜橙油含量(质量分数)为4.05%，松香甘油酯含量(质量分数)为2.17%，在该条件下利用超高压微射流技术(均质压力为22 000 psi和均质2次)制备甜橙油纳米乳液的平均粒径为(130.8±1.4) nm，PDI 为0.178±0.010，浊度为0.322±0.001。该乳液经4 ℃ 30 d的贮藏后浊度损失率为(0.007 2±0.002 3)A/d和D-柠檬烯氧化率为(0.69±0.00)%，且其乳液粒径分布呈现良好的分散性，在4 ℃、60 d内的贮藏过程中表现出平均粒径<140 nm，PDI<0.3，呈现了较高的动力学稳定性。
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