紫苏籽(Perilla frutescens L. Britt.)是药食两用原料，是国家卫生部首批颁布的既是食品又是药品的60种物品之一，利用价值高，其提取物有护肝、止咳、抗氧化等功效[1-3]，在中国已有几千年使用历史。
紫苏籽因其油脂含量高且不饱和脂肪酸含量高，常被用于提取油脂，而紫苏籽提油后的紫苏籽粕中蛋白质含量接近40%且杂质少[4-5]，是良好的蛋白质来源。紫苏籽蛋白的高值化利用正在成为国内外食品和保健品领域的研究热点。目前紫苏籽蛋白的研究多围绕蛋白提取工艺、低聚肽的制备和分离等方面。紫苏籽低聚肽是从紫苏籽粕提取的蛋白经过酶解技术获得的小分子肽类物质，逐渐引起研究领域的关注。
对于紫苏籽低聚肽的功能，目前有一定的研究基础。童波等利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解紫苏粕制备高F值低聚肽[6]，但并未对其具体结构进行说明。YANG等从紫苏籽蛋白水解物中分离鉴定出了2个具有抗氧化活性的二肽结构，分别为Tyr-Leu和Phe-Tyr[7]。姜文鑫等以紫苏分离蛋白为原料，通过碱性蛋白酶(alcalase)水解制备了紫苏抗菌肽[8]。贺东亮从紫苏蛋白水解物中鉴定出了序列为 Ala-Ser-Pro-Gly-Leu-Trp-Ser的七肽，并验证其具有抗肿瘤活性[9]。KIM等从紫苏籽蛋白水解物中提取了1个具有抗氧化活性的十一肽，序列结构为Ile-Ser-Pro-Arg-Ile-Leu-Ser-Tyr-Asn-Leu-Arg[10]。
本研究以紫苏籽蛋白为原料，经酶解提纯，制得紫苏籽低聚肽。通过对蛋白及低聚肽含量、分子质量分布、氨基酸组成和特征肽段的分析，考察紫苏籽低聚肽的营养成分及特征性成分，为紫苏籽低聚肽的产品开发和市场应用提供一定的研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫苏籽蛋白,华狐生物科技(中国)有限公司提供。
低聚肽标准品甘氨酰精氨酸二肽(glycyl-arginine，GR)和丙氨酰精氨酸二肽(alanyl-arginine,AR)(纯度均≥99%)，苏州强耀生物科技有限公司；乙腈(色谱纯)，德国Merck公司；甲酸(色谱纯)，迪马科技；实验用超纯水(18.2 MΩ·cm)，由Milli-Q纯水系统制备。
1.2 仪器与设备
色谱仪Nexera X2与三重四极杆质谱仪联用系统(LCMS-8060，配有LabSolutions Ver. 5.91色谱工作站)，日本岛津公司；分析天平(XS205DU)，美国Mettler Toledo公司；旋涡混合仪(QL-901)，其林贝尔仪器制造有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 实验样品制备
在pH(7.5±0.2)、(52±2) ℃条件下用复合蛋白酶酶解紫苏籽蛋白4 h，经(115±5) ℃灭酶、离心、过滤、浓缩、喷雾干燥后制得紫苏低聚肽样品。
1.3.2 蛋白质及肽含量测定
总蛋白含量采用GB 5009.5—2010规定的方法测定[11]，蛋白质换算系数为6.25；参考GB/T 22729—2008测定酸溶蛋白和低聚肽含量[12]。
1.3.3 相对分子质量分布
参照GB/T 22729—2008中6.3，采用高效凝胶过滤色谱法进行测定[12]。
标准品制备：用流动将相配制1 mg/mL的样品溶液。
样品制备：用流动相配制1 mg/mL的样品溶液，经孔径0.2 μm 聚四氟乙烯过滤膜过滤后待测。
色谱条件：色谱柱：TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流动相为V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶54.9∶0.1，流速0.5 mL/min；进样体积10 μL；检测波长220 nm；柱温30 ℃。
数据处理：使用GPC软件处理色谱数据，以相对分子质量的对数(lgMW)对保留时间作图得到相对分子质量校正曲线及方程，将样品的色谱数据代入校正曲线方程计算样品中肽的相对分子质量及其分布范围。用峰面积归一化计算不同分子质量范围的峰面积相对百分比之和。
1.3.4 氨基酸组成
参考GB 5009.124—2016第一法，氨基酸自动仪进行分析[13]。
1.3.5 低聚肽结构的测定
低聚肽结构的测定利用超快速液相色谱串联三重四极杆质谱方法测定。
样品处理：用纯水将样品稀释100倍，离心处理后(10 000 r/min离心10 min)取上清液，用孔径为0.22 μm尼龙过滤膜过滤后，制得待测样品。
液相色谱条件：色谱柱：Inertsil ODS-3(5 μm，2.1 mm×250 mm)；流动相：A为0.1% 甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～15 min，B 0～50%；15～20 min，B 50%～100%；20～25 min，B 100%；25.1～35 min，B 0%；流速0.2 mL/min；进样体积10 μL；柱温40 ℃。质谱条件：离子化模式ESI, 正离子模式；离子喷雾电压+4.5 kV；雾化气流速氮气 3.0 L/min；加热气流速氮气 10 L/min；干燥气流速氮气10 L/min；DL温度250 ℃；加热模块温度400 ℃；离子源温度300 ℃；扫描模式：多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)；驻留时间100 ms；延迟时间3 ms；MRM参数见表1。
表1 化合物的MRM优化参数
Table 1 The multiple reaction monitoring conditions
of the analytes
序列前体离子(m/z)产物离子(m/z)Q1 Pre Bias/VCE/VQ3 Pre Bias/VGR232175*-12-17-21158 -12-17-12AR246175*-12-18-20158 -12-18-18
注：*表示定量离子
1.4 氨基酸的营养价值计算
计算紫苏籽低聚肽的必需氨基酸质量分数，并分别以FAO/WHO推荐的成人体内的必需氨基酸模式作参比计算氨基酸评分(amino acid score,AAS)，以鸡蛋氨基酸模式作参比计算氨基酸化学评分(chemical score,CS)和必需氨基酸指数(essentoal amino acid index,EAAI)。
1.4.1 必需氨基酸质量分数
必需氨基酸与氨基酸总量之比(E/T)按式(1)计算:
(1)
式中：EAA为必需氨基酸的含量，TAA为氨基酸总量。
1.4.2 氨基酸评分
氨基酸评分(AAS)按式(2)计算:
(2)
1.4.3 氨基酸化学评分
氨基酸化学评分(CS)按式(3)计算:
(3)
1.4.4 必需氨基酸指数
必需氨基酸指数(EAAI)按式(4)计算:
(4)
式中：n为所涉及的必需氨基酸数;ai为实验蛋白质的各种氨基酸含量，%；A为鸡蛋蛋白中相应的必需氨基酸含量，%；i=1，2，…，n。
2 结果与分析
2.1 紫苏籽低聚肽的蛋白质及低聚肽含量
分析表明，紫苏籽低聚肽的干基蛋白含量为93.14%，干基肽含量为86.35%，说明紫苏籽低聚肽蛋白含量高，且多以低聚肽的形式存在，是一种较好的蛋白来源。
2.2 紫苏籽低聚肽的相对分子质量分布
紫苏籽低聚肽的相对分子质量分布色谱图如图1所示。
图1 分子质量分布色谱图
Fig.1 Chromatograph of molecular weight distribution
紫苏籽低聚肽为以紫苏籽蛋白为原料经预处理、酶解、分离等工艺制得，为低聚肽的混合物，分子质量分布结果显示，低聚肽主要集中在140～1 000 Da，占总比例的82.8%。相对分子质量小于1 000 Da的蛋白水解物，由于含有小分子肽，更容易被人体直接吸收，发挥生理功能[14]。因此紫苏籽低聚肽中高比例小分子蛋白水解物作为被人体直接吸收的营养物质成分。
2.3 紫苏籽低聚肽的氨基酸组成
根据方法1.3.3紫苏籽低聚肽的氨基酸组成及含量如表2所示。
表2 紫苏籽低聚肽的氨基酸组成及含量
Table 2 amino acid profile of perilla seed oligopeptides
氨基酸名称简写紫苏籽低聚肽/(mg·g-1)天门冬氨酸Asp88.86苏氨酸*Thr34.87丝氨酸Ser52.29谷氨酸Glu178.90甘氨酸Gly41.96丙氨酸Ala46.49缬氨酸*Val30.09胱氨酸+蛋氨酸*Cys+Met28.18异亮氨酸*Ile24.42亮氨酸*Leu52.81酪氨酸苯丙氨酸*Tyr+Phe72.03组氨酸His26.14赖氨酸*Lys33.69精氨酸Arg102.72脯氨酸Pro34.41TAA847.86EAA230.20EAA/TAA/%27.15
注：*表示必需氨基酸；TAA表示氨基酸总和；EAA表示必需氨基酸总和
由表2可知，组成紫苏籽低聚肽的氨基酸(色氨酸除外)总量为847.86 mg/g，必需氨基酸含量为230.20 mg/g，占紫苏籽低聚肽氨基酸总量的27.15%。含量最高的氨基酸是谷氨酸178.90 mg/g，其次是精氨酸102.72 mg/g。谷氨酸在植物源蛋白中占比均较高，而紫苏籽低聚肽中精氨酸相比其他植物源蛋白质含量较高。
从Uniport蛋白数据库中检索到一条紫苏蛋白序列，如图2所示。精氨酸(R)约占整条序列的10%，与氨基酸组成中精氨酸含量基本吻合。
图2 Uniport蛋白数据库中紫苏蛋白序列
Fig.2 Perilla protein sequence from the Uniport protein
database
2.4 紫苏籽低聚肽的营养价值评价
现在国际上以全鸡蛋的必需氨基酸模式，或根据人体所必需的氨基酸量提出的假设模式，作为评价食物蛋白质营养价值的标准。AAS用于评价蛋白质的营养价值，能够反映食物蛋白质与人体蛋白质构成模式的接近程度[15-16]；CS显示了被测食物蛋白质与标准蛋白质鸡蛋蛋白氨基酸的接近程度；必须氨基酸指数是指待测蛋白质的必需氨基酸含量与标准氨基酸(通常是鸡蛋蛋白质)中的必需氨基酸含量比值的几何平均数，是评价蛋白质营养状态的一项化学指标。
根据方法1.4折算紫苏籽低聚肽的氨基酸营养评价分值、化学评分以及必需氨基酸指数，结果见表3所示。
表3 紫苏籽低聚肽的营养价值评价结果
Table 3 Nutritional value of perilla seed oligopeptides
氨基酸种类模式蛋白质氨基酸的含量/(mg·g-1蛋白)紫苏籽低聚肽的氨基酸成人鸡蛋含量/(mg·g-1)AAS/%CS/%苏氨酸(Thr)134734.8721058异亮氨酸(Ile)185424.4217358胱氨酸+蛋氨酸(Cys+Met)245728.187933缬氨酸(Val)186630.0924968赖氨酸(Lys)227033.6911035亮氨酸(Leu)258652.8121863酪氨酸苯丙氨酸(Tyr+Phe)259372.0317046EAAI/%59.55
注：EAAI为必需氨基酸指数
与成人体内的蛋白质必需氨基酸模式相比，除含硫氨基酸(胱氨酸和蛋氨酸)以外，其余氨基酸分值均大于100，说明只有胱氨酸和蛋氨酸是紫苏籽低聚肽的限制氨基酸。必需氨基酸指数为59.55%，必需氨基酸评分含量最高的是缬氨酸，明显高于FAO/WHO推荐成人必需氨基酸模式[17]。紫苏籽低聚肽的氨基酸组成基本符合人体必需氨基酸的构成模式。
2.5 紫苏籽低聚肽的序列结构
生物活性肽序列在母体蛋白质中没有生物活性，通过酶解及生物发酵等作用可以被释放，从而表现出生物活性作用[14,18]。分子质量分布研究结果发现，紫苏籽低聚肽中相对分子质量小于1 000 Da的肽段所占比例最高，为小分子低聚肽，说明紫苏籽低聚肽可能具有潜在的生物活性。
肽段的生物活性功能与其氨基酸种类和组成结构有一定的关系。有研究表明，含有精氨酸的低聚肽具有一定活性功能。贾俊强等[19]研究与血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制肽的氨基酸组成情况，结果表明精氨酸是具有ACE抑制功能的特征之一，可能因为精氨酸与ACE活性位点亲和力较强，能够促进多肽与ACE的位点结合。SENTANDREU等研究表明，GR和AR具有ACE抑制活性，从而可能起到降血压作用[20]。SHIMIZU等从大豆中分离出GR，研究表明GR可以促进小鼠脑中神经营养因子的表达，从而提高与年龄有关的认知能力[21]。
细胞穿膜肽 (cell-penetrating peptides，CPPs) 是一类能够穿过细胞膜或组织屏障的短肽，精氨酸残基是大多数细胞渗透肽的所具有的结构，精氨酸的胍基在细胞渗透肽表面提供正电荷，与细胞膜中带负电荷的羧酸、磷酸基团能够相互作用形成氢键，从而穿过细胞膜进入细胞[22]。另有研究证实含有精氨酸残基的细胞渗透肽可以作为分子载体[23]。
氨基酸组成结果表明，紫苏籽低聚肽中精氨酸含量较高。含有精氨酸的肽段可能具有较好的生物功能活性，并且是潜在细胞渗透肽和分子载体。本实验进一步对低聚肽中部分含有精氨酸的肽段序列进行分析。结果表明，紫苏籽低聚肽中含有GR和AR两条二肽序列，色谱图如图3所示，含量分别为78.4 mg/kg和445.1 mg/kg，Uniport蛋白数据库显示有该二肽存在于紫苏蛋白中(图2中绿色和黄色突出显示)。与其他3种植物源低聚肽比较，紫苏籽低聚肽中含量均为最高，结果见表4。目前尚未有从紫苏籽低聚肽中鉴定出上述2条序列的报道。
表4 植物源低聚肽中GR和AR含量比较
Table 4 Comparison of GR and AR content in
plant-derived oligopeptides
序列紫苏籽低聚肽/(mg·kg-1)大米低聚肽/(mg·kg-1)豌豆低聚肽/(mg·kg-1)大豆低聚肽/(mg·kg-1)GR78.4±3.6a10.3±1.3b4.2±1.0c4.9±1.3cAR445.1±10.6a71.0±7.2b46.8±3.9c26.9±1.6d
注：数值表示形式：平均值±标准差，同行不同字母表示差异显著(P<0.05)
图3 紫苏籽低聚肽中GR和AR的定量色谱图
Fig.3 Quantification chromatograph of GR and
AR in perilla seed oligopeptides
3 结论
紫苏籽低聚肽蛋白含量高，且多以低聚肽的形式存在，分子质量主要分布在140～1 000 Da，是一种较好的蛋白来源。有较高的氨基酸评分，是一种优质的蛋白来源。精氨酸含量高达102.72 mg/g。胱氨酸和蛋氨酸是紫苏籽低聚肽的限制氨基酸。必需氨基酸指数为59.55%，氨基酸组成基本符合人体必需氨基酸的构成模式。
从紫苏籽低聚肽中鉴定出了2条C端为精氨酸残基的二肽GR和AR，其中GR已被证实可以促进小鼠脑中神经营养因子的表达，从而提高与年龄有关的认知能力，GR和AR均具有ACE抑制活性，两者均含有精氨酸残基，可能为细胞穿膜肽，并有作为分子载体的潜力，在吸收利用方面有潜在的优势。这2条二肽序列均为国内外首次从紫苏籽低聚肽中鉴定出，更多的生物活性成分还有待进一步挖掘。
相比于化学合成，天然物质产生的活性肽应用于功能食品和保健食品中更为安全。本研究通过对紫苏籽低聚肽的营养及特性成分进行分析，为紫苏粕及紫苏蛋白的开发利用提供了理论依据。
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