摘 要 该文利用多组光谱和扫描电镜数据，结合光谱学、食品学、材料学方向内容，以期详细分析出“四大家鱼”鱼骨钙的组成形式。首先通过红外光谱、扫描电镜和X射线光电子能谱分析得出，4种鱼骨的钙盐主要以结晶的磷灰石和无定形CaHPO4的形式存在，而磷灰石又包括羟基磷灰石和碳酸磷灰石。然后根据X射线光电子能谱中Ca/P和拉曼光谱中
比值，计算得出3种钙盐的含量，其中羟基磷灰石质量分数为青鱼51.18%、草鱼46.72%、鲢鱼28.49%、鳙鱼29.31%；碳酸磷灰石质量分数为青鱼9.89%、草鱼10.61%、鲢鱼8.60%、鳙鱼9.72%；无定形CaHPO4质量分数为青鱼38.93%、草鱼42.67%、鲢鱼62.91%、鳙鱼60.97%。最后根据X射线光电子能谱的窄谱扫描和X射线衍射的物相检索数据，计算出羟基磷灰石和碳酸磷灰石中OH-被其他元素取代的种类及含量。这些结果可以为“四大家鱼”中鱼骨钙的综合利用提供一定的理论依据。
ABSTRACT Combined with the content of spectroscopy, food science and materials science, spectroscopy protocols and scanning electron microscope were used to analyze the composition of calcium in fish bones of "Four Major Chinese Carps" in detail. The calcium salts of the four fish bones mainly existed in the form of crystalline apatites (hydroxyapatite and carbonate apatite) and amorphous CaHPO4, as determined by infrared spectroscopy, scanning electron microscopy, and X-ray photoelectron spectroscopy. Then, based on the Ca/P ratio in the X-ray photoelectron spectroscopy and the 
ratio in the Raman spectrum, the content of three calcium salts was calculated. The hydroxyapatite content of fish bones in black carp (Mylopharyngodon piceus), grass carp (Ctenopharyngodon idellus), silver carp (Hypophthalmichthys molitrix), bighead carp (Hypophthalmichthys nobilis) was 51.18%, 46.72%, 28.49% and 29.31%, respectively. The carbonate apatite contents of fish bones were 9.89% (black carp), 10.61% (grass carp), 8.60% (silver carp) and 9.72% (bighead carp), respectively. The content of amorphous CaHPO4 was 38.93% (black carp), 42.67% (grass carp), 62.91% (silver carp) and 60.97% (bighead carp), respectively. Moreover, the contents of OH- substituted by other elements in hydroxyapatite and carbonate apatite were calculated based on narrow-spectrum scanning of X-ray photoelectron spectroscopy and X-ray diffraction phase retrieval. These results may provide theoretical basis for the comprehensive utilization of fish bone calcium in “Four Major Chinese Carps”.
Key words four major Chinese carps; Raman spectroscopy; X-ray photoelectron spectroscopy; X-ray diffraction; the composition of fish bone calcium
我国是世界淡水渔业大国，青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼作为传统“四大家鱼”，养殖历史十分悠久，其产量一直位居前列，直到今天，仍然是我国淡水鱼类养殖的主体鱼类[1]。2017年全国淡水鱼类养殖产量2 540.98万t，其中草鱼、鲢鱼、鳙鱼位居前三[2]，青鱼虽产量较低，但因其口感优良，也深受消费者喜爱。
鱼骨是鱼体中轴骨(头骨和脊骨)、附肢骨(奇鳍骨和偶鳍骨)和鱼刺的总称[3]，占鱼体总质量的10%～15%[4]，在鱼体中主要起支撑与保护功能。作为鱼类加工过程中产生的下脚料之一，鱼骨常被当成加工废料处理，随意倾倒和掩埋，严重污染环境，或者用作生产饲料和肥料，经济效益很低。因此为了提高鱼骨的利用价值，在食品工业中，鱼骨常被加工成各种补钙产品，如活性钙[5]、螯合钙[6]等，但是鱼骨钙的组成形式尚未探究清楚，研究者们一般将其简单定义为羟基磷灰石，更为详细的组成形式鲜见报道。前人报道，人骨中的钙盐主要以结晶的磷灰石(60%)和无定形的CaHPO4(40%)形式存在[7]，而鱼骨的钙盐还未有这样的探索。“四大家鱼”鱼骨是重要的高值化加工原料，不同鱼骨钙的组成形式对其加工利用存在一定的影响，例如酸法是最常用的利用鱼骨钙的方法，而在1个标准大气压、25 ℃下，CaHPO4的溶解度约是Ca3(PO4)2的68倍[8]，其与酸反应的速率与产物也不一致。
因此，本文以“四大家鱼”鱼骨为原料，通过红外光谱、扫描电镜、拉曼光谱、X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)、X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)等手段，结合光谱学、食品学、材料学等方向内容对其鱼骨钙的组成形式进行研究，以期能够详细分析出“四大家鱼”鱼骨钙的组成形式，为鱼骨钙的综合利用提供一定的理论依据。
青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼各3条，江西省南昌市江大南路菜市场，体重规格均为2～3 kg，取其脊骨；氯仿、H2O2、无水乙醇(分析纯)，西陇科学股份有限公司；甲醇(分析纯)，国药化学试剂有限公司。
Nicolet 5700型傅里叶红外光谱仪，美国热电尼高力公司；JSM 6701F型场发射扫描电镜带能谱仪，日本电子公司；ESCALAB250Xi型X射线光电子能谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；LabRAM HR型激光拉曼光谱仪，法国Jobin Yvon公司；D8 Advance型X射线衍射仪，德国Bruker公司；SXL-1002型程控箱式电炉,上海精宏实验设备有限公司。
1.3.1 红外光谱
鱼骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1溶液中完全浸没6 h，再经超纯水清洗，60 ℃烘箱中烘干12 h，研磨成粉。采用压片法对鱼骨粉进行红外光谱分析，取适量鱼骨粉与KBr共同压片，放入红外光谱仪测量，测量参数为仪器分辨率4 cm-1、扫描累加32次、扫描范围4 000～400 cm-1。
1.3.2 扫描电镜
鱼骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇溶液)=1∶1中完全浸没6 h，再用体积分数为30%的H2O2浸泡48 h，使用双蒸水于超声机内清洗2 h，无水乙醇脱水，真空冷冻干燥，取若干颗粒喷金后放入扫描电镜观察。
1.3.3 XPS
鱼骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇溶液)=1∶1中完全浸没6 h，再经超纯水清洗，60 ℃烘箱中烘干12 h，研磨成粉。将适量鱼骨粉放入样品台正中间，用X射线光电子能谱仪测量，测量参数为源枪类型Al靶(1 486.6 eV)、光斑650 μm、 扫描步长0.100 eV，结果用XPSPEAK41软件分析。
1.3.4 拉曼光谱
鱼骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇溶液)=1∶1中完全浸没6 h，再经超纯水清洗，60 ℃烘箱中烘干12 h，研磨成粉。将适量鱼骨粉放在样品室内，用拉曼光谱仪测量，测量参数为激发波长632.8 nm、光谱仪焦长800 mm、扫描频移范围300～3 500 cm-1，结果用PeakFit v4.12软件(Systat 公司，美国)分析。
1.3.5 XRD
鱼骨经900 ℃灰化8 h后研磨成粉。将适量鱼骨粉放入样品台正中间，用X射线衍射仪测量，测量参数为光源Cu-Kα(λ=1.540 56 nm)、检测电压40 kV、电流80 mA、扫描角度5°～80°、扫描步长2 °/s，结果用X′Pert HighScore Plus软件(帕纳科公司，荷兰)分析。
1.3.6 数据处理
同种鱼的3条鱼骨作为3个平行，所有实验均重复3次；文中需要绘制的图均使用Originpro 8.0软件进行绘制；数据利用SPSS 17.0软件(SPSS Inc, Chicago, Illinois, USA)中的Duncan’s test进行显著性分析(P<0.05)。
由图1可知，4种鱼骨的红外光谱出峰位置基本一致，这说明4种鱼骨的基本成分是一致的。参考高寰宇等[9]关于人骨红外光谱的分析，3 450 cm-1处的吸收峰可归属为水与OH-1的特征峰。1 500～1 600 cm-1与1 600～1 700 cm-1的峰可归属为酰胺Ⅱ与酰胺Ⅰ的特征峰，表现为1 517 cm-1处N—H的弯曲振动吸收峰与C—N的伸缩振动吸收峰，1 623 cm-1左右处主链上C
O的伸缩振动吸收峰等；无机质的峰主要集中在1 000 cm-1以下，包括1 000 cm-1处
的非对称伸缩振动吸收峰；602 cm-1、553 cm-1处的弯曲振动吸收峰；871 cm-1左右处
的弯曲振动吸收峰，871 cm-1还可归类为
的弯曲振动吸收峰，这说明无机质主要以磷酸盐与碳酸盐的形式存在。
图1 四种鱼骨的红外光谱图
Fig.1 Infrared spectra of four kinds of fish bones
鱼骨经过脱脂、脱蛋白处理后，通过扫描电镜可以看到骨中钙盐的形貌，结果如图2所示。首先可以看到鲢鱼骨上出现了许多孔洞，这可能是因为鲢鱼骨中胶原蛋白含量比较高[10]，与钙盐结合的较多，胶原蛋白被过氧化氢脱去形成孔洞。另外4种鱼骨的钙盐都存在多种形貌，前人报道骨中不同类型钙盐的形貌是不同的，以羟基磷灰石为代表的晶体钙盐多以片状形式存在[11]，非晶体钙盐多以无定形的CaHPO4形式存在，这说明4种鱼骨的钙都可能以羟基磷灰石与无定形的CaHPO4的形式存在。
1-青鱼；2-草鱼；3-鲢鱼；4-鳙鱼；a-放大100倍；
b-放大500倍；c-放大1 000倍
图2 四种鱼骨的扫描电镜图
Fig.2 Scanning electron microscope of four kinds of
fish bones
XPS可以根据谱图中各种元素的特征峰位，确定鱼骨中各种元素的化学价态。图3为4种鱼骨的XPS全谱扫描图。通过4种鱼骨Ca、O、P的特征峰位，Ca 2p特征峰处于350.6与347.0 eV，O 1s特征峰处于531.0 eV，P 2p特征峰处于133.0 eV附近，可以确定4种鱼骨中Ca，O，P的价态分别为+2，-2和+5价[12]，磷酸盐以正磷酸盐的形式存在。
图3 四种鱼骨的XPS全谱扫描图
Fig.3 XPS full-spectrum scanning images of four
kinds of fish bones
通过对4种鱼骨XPS谱图上Ca、P的特征峰进行拟合分析，利用其峰面积进行计算，可以得出4种鱼骨的Ca、P两种元素原子数的比值(Ca/P)，结果如表1所示。已知纯羟基磷灰石中Ca/P约为1.67，4种鱼骨的Ca/P都比1.67小，依次为青鱼骨1.40、草鱼骨1.38、鲢鱼骨1.25、鳙鱼骨1.27，这说明4种鱼骨中都存在一定量的无定形CaHPO4，致使P元素原子数增多，Ca/P减小。
表1 四种鱼骨钙的Ca/P的比较
Table 1 Comparison of Ca/P of four kinds of fish bones
鱼种类Ca/P青鱼1.40±0.02a草鱼1.38±0.04a鲢鱼1.25±0.01b鳙鱼1.27±0.01b
注: 在同一列中的平均值(±标准差)的上标不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
经过对Ca进行窄谱扫描、荷电校正后得出4种鱼骨Ca的精确峰位。4种鱼骨Ca的峰位与峰间距存在一定的差异，其中草鱼骨与其他3种鱼骨的差异最为显著，其峰位出现在347.05和350.70 eV处，均大于其他3种鱼骨(图4)。通常当被测原子与电负性大的原子结合时，其原子核外电子云密度会减小，会导致其XPS峰向高结合能方向位移[13]。草鱼骨峰位出现了整体向高结合能方向移动的情况，可能是由于相比其他3种鱼骨，草鱼骨Ca存在的形式是不同的，羟基磷灰石OH-发生更多的F-取代，晶格畸变更明显。
图4 四种鱼骨Ca的XPS窄谱扫描图
Fig.4 XPS Narrow Spectra of Ca of four kinds of
fish bones
与红外光谱相比，拉曼光谱分析的范围更广，对细节的分析更加方便，且不受水分干扰。图5为4种鱼骨的拉曼光谱及部分处理图，其中用于分析的有：代表含量的960 cm-1处特征峰；代表含量的1 070 cm-1处特征峰，这2个特征峰峰强的比值，可代表各自含量的比值[14-15]。另外960 cm-1处特征峰的半峰宽的倒数也可代表骨的结晶度[16]，具体结果如表2所示。
a-原始数据；b-处理图
图5 四种鱼骨的拉曼光谱及部分处理图
Fig.5 Raman spectra and partial treatment diagrams of
four kinds of fish bones
表2 四种鱼骨的
比值与矿物结晶度的比较
Table 2 Comparison of 
and mineral crystallinity of
four kinds of fish bones
鱼种类PO3-4/ CO2-3矿物结晶度青鱼0.162±0.012a0.028 5±0.001 1a草鱼0.185±0.024a0.025 0±0.000 8b鲢鱼0.232±0.009b0.022 4±0.000 7c鳙鱼0.249±0.017b0.024 0±0.000 5b-
磷灰石是晶体，但骨中钙也会以非晶体的无定形CaHPO4的形式存在[17]，矿物结晶度一定程度上可以代表磷灰石的含量，结果为青鱼>草鱼>鳙鱼>鲢鱼。
已知骨结晶状态的钙盐主要为羟基磷灰石，其分子式为Ca10(PO4)6(OH)2。但羟基磷灰石中的会被一定量的取代，被称为碳酸磷灰石。一般碳酸根离子可取代羟基磷灰石的OH-位置或位置，取代OH-位置称之为A型取代，取代位置称之为B型取代。但目前被普遍接受的观点是取代位置的B型取代[18]。
利用XPS中Ca/P的平均数与拉曼光谱中
的平均数，计算得出鱼骨中羟基磷灰石、碳酸磷灰石、无定形CaHPO4的含量，具体结果如表3所示。羟基磷灰石质量分数：青鱼51.18%、草鱼46.72%、鲢鱼28.49%、鳙鱼29.31%；碳酸磷灰石质量分数：青鱼9.89%、草鱼10.61%、鲢鱼8.60%、鳙鱼9.72%；无定形CaHPO4质量分数：青鱼38.93%、草鱼42.67%、鲢鱼62.91%、鳙鱼60.97%。
青鱼骨与草鱼骨的无定形CaHPO4质量分数接近40%，与成人骨较为接近，而鲢鱼骨与鳙鱼骨的无定形CaHPO4质量分数超过了60%，比人骨要高；磷灰石的含量是羟基磷灰石与碳酸磷灰石含量的加和，结果为青鱼>草鱼>鳙鱼>鲢鱼，该结果与拉曼光谱的结晶度数据一致；人骨中碳酸磷灰石质量分数在4%～8%[19]，而4种鱼骨的碳酸磷灰石含量都超出许多，这可能与其生活习性有关。碳酸磷灰石与无定形CaHPO4的溶解度比羟基磷灰石要高，易被酸溶解，所以提取酸溶性钙或熬制骨汤，鲢鱼骨和鳙鱼骨更为合适。
表3 四种鱼骨的羟基磷灰石、碳酸磷灰石、无定形
CaHPO4质量分数的比较 单位：%
Table 3 Comparison of content of hydroxyapatite, carbonate
apatite, amorphous CaHPO4 of four kinds of fish bones
鱼种类羟基磷灰石碳酸磷灰石无定形CaHPO4青鱼51.189.8938.93草鱼46.7210.6142.67鲢鱼28.498.6062.91鳙鱼29.319.7260.97
羟基磷灰石中的易被取代，OH-也易被氟、氯等元素取代，称为氟磷灰石、氯磷灰石等[20]，同理，碳酸磷灰石中的OH-也会发生取代。鱼骨经高温灰化后，碳酸根、胶原蛋白等被去掉，通过XRD分析出的各种磷灰石含量可以反映磷灰石的OH-的具体取代情况。灰化的鱼骨粉进行XRD测量如图6所示，经过扣除背底、寻峰、物相检索后，选出可能存在的磷灰石物相(>30)，并进行RIR半定量分析，具体结果如表4所示。羟基磷灰石与碳酸磷灰石的OH-被取代的情况，其中未被其他元素取代的质量分数为青鱼51.33%、草鱼33.67%、鲢鱼61.33%、鳙鱼43.00%；被氟元素取代的质量分数为青鱼22.67%、草鱼42.00%、鲢鱼16.67%、鳙鱼17.67%；被硫元素取代的质量分数为青鱼19.67%、草鱼17.33%、鲢鱼17.33%、鳙鱼33.33%；被氯元素取代的质量分数为青鱼5.67%、草鱼0.67%、鲢鱼4.00%、鳙鱼5.33%；被硒元素取代的质量分数为青鱼0.67%、草鱼6.3%、鲢鱼0.67%、鳙鱼0.67%。
灰化后的青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼骨寻出了相同的物相，只是含量有所不同。草鱼骨中寻出了含量较多的硒磷灰石，含量较少的氯磷灰石，且羟基磷灰石含量最低，氟磷灰石含量最高，这与XPS的分析结果是基本一致的。草鱼肉中含有硒元素，部分沉积到骨钙中，提高了骨的硒含量，但氟元素含量比较高，一定量的氟会带来许多病痛，大量的氟甚至会导致人中毒[21]，因此相比其他3种鱼骨，对草鱼骨的利用要慎重。
图6 四种鱼骨的XRD图
Fig.6 XRD patterns of four kinds of fish bones
表4 四种鱼骨的磷灰石物相及各自质量分数的比较单位：%
Table 4 Comparison of phase and content of four
kinds of fish bones apatite
鱼种类羟基磷灰石氟磷灰石硫磷灰石氯磷灰石硒磷灰石青鱼51.33±4.04a22.67±2.51a19.67±1.64a5.67±1.15a0.67±1.15a草鱼33.67±3.21b42.00±2.65b17.33±1.17a0.67±1.15b6.33±1.15b鲢鱼61.33±4.16c16.67±2.08c17.33±2.08a4.00±1.73a0.67±1.15a鳙鱼43.00±2.65d17.67±1.15c33.33±1.52b5.33±0.58a0.67±1.15a
羟基磷灰石由于具有独特的生物相容性、骨传导性和诱导性，被广泛应用于各种生物医学材料中，鱼骨为原料生产的羟基磷灰石纯度较好、成本低廉，且研究者们对其进行细胞毒性实验发现无明显毒性[22]。因此鱼骨中的钙不仅可以加工成补钙产品，而且可以用作生产羟基磷灰石。
磷灰石在骨中以六方晶系的结构存在，经过搜索晶胞与修正晶胞后，得到4种鱼骨的晶胞参数。其中青鱼骨晶胞参数a=b=0.941 5 nm、c=0.686 9 nm、V=0.527 368 nm3；草鱼骨a=b=0.940 5 nm、c=0.685 7 nm、V=0.525 309 nm3；鲢鱼骨a=b=0.941 6 nm、c=0.687 6 nm、V=0.528 009 nm3；鳙鱼骨a=b=0.941 5 nm、 c=0.687 2 nm、 V=0.527 527 nm3，可以看出,4种鱼骨的晶胞参数大小是鲢鱼>鳙鱼>青鱼>草鱼，这可能与F-的取代有关，F-比OH-的体积要小，当F-取代OH-时会使晶胞参数变小。本文参考的标准卡片01-084-1 998显示纯的羟基磷灰石的晶胞参数为a=b=0.941 7 nm、c=0.687 6 nm、V=0.527 910 nm3，与青鱼、鲢鱼、鳙鱼骨灰化后的晶胞参数较为接近，因此这3种鱼骨灰化得到的羟基磷灰石纯度较高，可以作为一种优质的羟基磷灰石加工原料。
本文创新性的利用多组光谱和扫描电镜数据，结合光谱学、食品学、材料学等方向内容，构建了一种分析“四大家鱼”鱼骨钙组成形式的方法。该方法简便、快速、准确度高，能较详细地分析出样品的骨钙组成形式，为鱼骨钙的综合利用提供更多的科学依据，也为研究其他物种的骨钙组成形式提供一定的参考。
青鱼骨与草鱼骨的无定形CaHPO4质量分数接近40%，与成人骨较为接近，而鲢鱼骨与鳙鱼骨的无定形CaHPO4质量分数均超过了60%，比人骨要高；4种鱼骨的碳酸磷灰石含量都比人骨超出许多。根据碳酸磷灰石与无定形CaHPO4的含量，得出鲢鱼骨和鳙鱼骨更为适合提取酸溶性钙或家用熬制骨汤。草鱼骨不仅含有硒，也有许多氟，因此相比其他3种鱼骨，草鱼骨的利用要慎重。青鱼、鲢鱼、鳙鱼骨灰化后的晶胞参数与纯羟基磷灰石更为接近，因此这3种鱼骨可以作为一种优质的羟基磷灰石加工原料。这些结果可以为“四大家鱼”鱼骨钙的综合利用提供一定的理论依据。
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