随着人们对豆类蛋白营养价值认识的提高,豆类蛋白的需求量激增,大豆蛋白和豌豆蛋白受到广泛关注[1-2]。绿豆蛋白是绿豆中除淀粉外含量第二丰富的营养成分(20%~33%)[3],氨基酸组成平衡[4],营养价值高。然而,目前食用绿豆蛋白的途径仍然是将绿豆加工成不同类型的食物,如汤和粥等[5]。此外,绿豆蛋白常被作为绿豆淀粉加工的副产品,应用于饲料工业,造成了绿豆蛋白资源的严重浪费。
食品乳液通常是以蛋白质、多糖、乳化剂、油脂为主体,经过均质形成的一类分散体系,是食品加工中最复杂的体系之一[6],状态接近真实的乳饮料。其在加工过程和货架期内的稳定性容易受环境因素,如温度、离子强度及pH等影响[7],表现为脂肪上浮、蛋白沉淀、质感粗糙等,严重影响到食品的外观和口感,是食品工业中亟待解决而又难以彻底解决的重要技术问题。目前,关于绿豆分离蛋白(mung bean protein isolates,MBPI)应用于食品乳液的研究和应用尚未见报道,这与MBPI功能特性较差,尤其是在接近其等电点附近时(约为pH 4.6)溶解性和乳化性不佳密切相关[8]。
阴离子多糖常被添加到蛋白稳定的酸性乳饮料中,通过静电作用和空间位阻效应提高乳液的稳定性,减缓液滴聚集[9],改善产品的感官特性[10]。羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose, CMC)是酸性乳饮料中应用广泛的稳定剂,是由D-吡喃葡萄糖通过β-1,4-糖苷键链接而成的阴离子型线性多糖[11]。CMC与蛋白在水相体系及乳液体系中的相互作用已有较为深入的研究[9,12]。但CMC与MBPI在乳液体系中的相互作用尚不清楚。基于此,本文拟研究CMC对MBPI乳液稳定性的影响,通过考察不同pH、CMC浓度和加热温度下乳液粒径、聚集程度、ζ-电位、黏度及分层稳定性的变化,揭示CMC引起MBPI乳液稳定/失稳的内在机制。为绿豆蛋白资源在植物基乳品中的开发利用提供理论依据和技术支撑。
脱皮绿豆,涞水县金谷粮油食品有限公司;葵花籽油,购于北京物美超市;CMC,常熟威怡科技有限公司;HCl、NaOH,国药集团化学试剂公司;磷酸盐缓冲液、尼罗红、尼罗蓝,北京Solarbio生物科技有限公司;所有试剂均为分析纯。
pH计(pH400),美国Alalis公司;高速分散器(XHF-DY),宁波新芝生物科技股份有限公司;高压均质机(SCIENTZ-150),宁波新芝生物科技股份有限公司;激光粒度分析仪(Mastersizer 2000),英国Malvern公司;Zeta-电位分析仪(Zetasizer Nano ZS90),英国Malvern公司;流变仪(Physica MCR301),奥地利Anton Paar有限公司;稳定性分析仪(Turbiscan Lab® Expert apparatus),法国Formulaction公司;Carl Zeiss蔡司激光共聚焦显微镜880(LSM T-PMT),德国Carl Zeiss有限公司。
1.3.1 MBPI的制备
参考DU等[13]的方法并稍做修改。将脱皮绿豆研磨粉碎至60 目,以质量比为1∶15的比例分散于去离子水中,调节pH至9.0。在40 ℃,600 r/min下搅拌1 h后4 000 r/min离心20 min。收集上清液调节pH至4.5,4 000 r/min离心20 min,收集沉淀重新分散于去离子水中,调节pH至7.0。溶液透析24 h除去多余的盐离子后冻干,冻干物即为MBPI。
1.3.2 乳液的制备
将MBPI和CMC分别分散在去离子水中,室温下搅拌3 h后置于4 ℃过夜以确保完全水化,得到质量分数为5%MBPI和1%CMC母液。将MBPI、CMC溶液及葵花籽油按照一定比例混合,添加去离子水,配制成MBPI和葵花籽油质量分数为2%,CMC添加量(质量分数)分别为0%、0.2%、0.4%和0.5%的混合液。将混合液于10 000 r/min下高速剪切1 min后,于常温、40 MPa下高压均质1次,制备成乳液。用HCl和NaOH调节pH,得到pH 7.0 和4.5的乳液,再次在相同条件下均质后,置于4 ℃条件下贮藏备用。
1.3.3 粒径的测定
采用Mastersizer 2000粒度分布仪测定乳液液滴粒径的大小。参数设置为:分析模式通用;进样器名Hydro 2 000MU(A);颗粒折射率1.520;颗粒吸收率0.10;分散剂水;分散剂折射率1.330;泵的转速2 500 r/min;测定温度25 ℃。实验采用体积平均直径(volume weighted average diameter)d43表征液滴粒度的大小。
1.3.4 ζ-电位的测定
采用Zetasizer Nano-ZS90电位测定仪测定乳液液滴的ζ-电位,参考LIU等[14]的方法并稍作修改。测定前,样品采用与其pH相同的5 mmol/L磷酸盐缓冲液稀释5倍,测定温度25 ℃。
1.3.5 黏度的测定
根据WEI等[15]的方法并稍做修改后,采用Physica MCR301流变仪测定乳液的黏度随剪切速率的变化。测定选用不锈钢平行板转子(pp50Ti),设定间距为0.500 mm,测定温度25 ℃,平衡时间3 min,剪切速率从0.1到100 s-1。加样时直接把样品吸取在平板上,使其分布均匀并防止气泡产生。
1.3.6 放置稳定性的测定
采用Turbiscan Lab稳定性分析仪测定,结果记录为Turbiscan稳定性指数(turbiscan stability index,TSI),其中,TSI越小,乳液越稳定。取20 mL新制乳液加入圆柱形玻璃小瓶中,并置于稳定性分析仪中,测定温度25 ℃,测定时长24 h,每隔1 h扫描1次,记录数值。
1.3.7 微观结构的观察
激光共聚焦的测定参考赵谋明等[16]提到的方法并略微修改,采用莱卡激光共聚焦仪器观测乳液的微观结构。上样前,在1 mL样品中加入40 μL混合染料(0.02% 尼罗红和0.1% 尼罗蓝),充分混合均匀。选用63×油镜,在显微镜下初调焦,找到乳液液滴分散平面。选择488 nm的Ar离子和633 nm的He/Ne 离子激光预扫描,采集荧光图像。所有液滴荧光图像按1 024×1 024像素,3×zoom进行采集。然后用激光扫描共聚焦显微镜LAS AF Lite软件进行图像分析与数据处理。
1.3.8 热处理对MBPI乳液稳定性的影响
将新鲜制备的乳液分别置于60、80及100 ℃下加热30 min,冷却至室温,放置24 h后,对其粒径、ζ-电位、表观黏度、稳定性指数及乳液微观结构进行分析。
如图1所示,pH 7.0条件下,添加CMC对MBPI乳液的ζ-电位未产生显著影响。这是因为在中性条件下,MBPI稳定乳液液滴与CMC分子均带负电荷,存在较强的静电斥力,不利于CMC吸附在液滴表面,两者之间通常很少形成静电复合物,所以颗粒的ζ-电位不会产生明显变化。在pH 4.5条件下,由于MBPI处于其等电点附近(~pH 4.6),蛋白发生较为严重的絮凝,导致乳液失稳。随着CMC添加量的增加,带有负电荷的CMC与乳液液滴表面带有正电荷的MBPI发生静电吸附,乳液ζ-电位由正值转变为负值,且绝对值显著增加,这是由于带负电荷的多糖与带正电荷的绿豆蛋白之间存在静电络合作用,两者形成了静电复合物,所以颗粒ζ-电位绝对值明显增加,液滴间的静电排斥作用得到增强。KOUPANTSIS等[17]报道了酸性条件下带负电荷的CMC吸附到带正电荷的乳清蛋白表面和酪蛋白酸钠表面,与本实验结果类似。
图1 CMC添加量和pH对MBPI乳液ζ-电位的影响
Fig.1 Effects of CMC concentration and pH on the
ζ-potential of MBPI-stabilized emulsions
如图2所示,在pH 7.0条件下,随着CMC添加量由0提高到0.5%,MBPI乳液液滴粒径由2.35 μm增加至4.16 μm。图3-a激光共聚焦显微观测结果也证实添加CMC引起液滴发生了不同程度的絮凝,并产生微观相分离。这是由分散相中未吸附多糖分子诱发的液滴排斥絮凝所造成[16],这种状态的絮凝液滴间相互作用力较弱,容易被稀释、振荡、搅拌等物理作用破坏,一般是可逆的[18]。
在pH 4.5条件下,未添加CMC的乳液发生了严重的絮凝(图3-b),液滴的粒径达到33.5 μm(图2)。这主要是因为MBPI在等电点附近电荷量接近0,液滴之间的静电斥力不足以克服范德华力和疏水相互作用等吸引力,从而发生聚集。CMC的添加可显著降低乳液液滴粒径,且当CMC添加量增加到0.4%时,液滴分散均匀,粒径减小到1.08 μm,蛋白在酸性条件下的聚集得到抑制(图3-b)。这与CMC在液滴表面的吸附,提高了液滴间的静电排斥和空间位阻效应密切相关。LIU等[19]也证实了添加0.2%的高甲氧基果胶或SSPS都可以抑制酪蛋白酸钠乳液液滴的聚集,这与本实验报道现象相一致。
图2 CMC添加量和pH对MBPI乳液粒径的影响
Fig.2 Effects of CMC concentration and pH on the mean
droplet diameter (d43) of MBPI-stabilized emulsions
a-pH 7.0 MBPI乳液;b-pH 4.5 MBPI乳液
图3 CMC添加量和pH对MBPI乳液微观结构的影响
Fig.3 Effects of CMC concentration and pH on the
microstructure of MBPI-stabilized emulsions
注:图中红色为油脂;绿色为蛋白
根据斯托克斯定律,较高的黏度有助于阻止或延迟蛋白包裹液滴之间的相互聚集[20]。由图4可知,pH 7.0条件下,未添加CMC的乳液黏度很低,随着CMC添加量增加,乳液的黏度逐渐增加。而在pH 4.5条件下,未添加CMC的乳液具有较高的黏度,这可能与体系发生严重的絮凝有关。随着CMC浓度的增加,体系黏度显著降低。推测这可能与CMC吸附于MBPI稳定的液滴表面,造成连续相中多糖浓度的降低有关。而当CMC添加量达到0.5%时,体系的黏度显著升高。图1的结果也表明,当CMC添加量超过0.4%时,液滴的ζ-电位不再增加。表明此时,CMC在MBPI稳定的液滴表面发生了饱和吸附。因此,添加0.5%CMC时,过量的CMC将分散于分散相中,引起黏度升高[20]。
a-pH 7.0 MBPI乳液;b-pH 4.5 MBPI乳液
图4 CMC添加量和pH对MBPI乳液黏度的影响
Fig.4 Effects of CMC concentration and pH on the
viscosity of MBPI-stabilized emulsions
由图5可知,在pH 7.0条件下,未添加CMC的乳液具有较好的稳定性,在25 ℃放置24 h,未产生明显的分层现象(图6)。添加0.2%CMC引起乳液的分层,样品底部出现水析层。随着CMC添加量的增加,稳定性得到了增强,水析现象得到抑制。在pH 4.5条件下,MBPI乳液发生严重的失稳,分层现象严重。与中性条件下的变化趋势相一致,当添加少量CMC(0.2%)时,TSI增加,稳定性显著降低。而当CMC添加量提高到0.4%以上时,TSI明显减小,乳液具有很好的稳定性,未出现分层。ZHAO等[21]研究显示当乳铁蛋白乳液中添加0.05%~0.15%大豆多糖或甜菜果胶时,乳液发生桥连絮凝,而添加量超过0.35%时,乳液具有较好的稳定性。
a-pH 7.0 MBPI乳液;b-pH 4.5 MBPI乳液
图5 CMC添加量和pH对MBPI乳液TSI的影响
Fig.5 Effects of CMC concentration and pH on the
TSI of MBPI-stabilized emulsions
a-pH 7.0 MBPI乳液;b-pH 4.5 MBPI乳液
图6 CMC添加量和pH对MBPI乳液分层情况的影响
Fig.6 Effects of CMC concentration and pH on the
stratification of MBPI-stabilized emulsions
如图7所示,在pH 7.0和pH 4.5条件下,添加0.4%CMC的MBPI乳液在本研究所考察的热处理温度下,均未出现明显分层现象。如图8所示, TSI测定的结果表明,当加热温度由60 ℃增加到80 ℃时,不同pH体系的稳定性未发生明显变化;随着加热温度继续提高到100 ℃,体系的稳定性显著降低。如图9所示,粒径测定的结果表明,对于中性乳液,加热对液滴粒径的影响较小,但加热至100 ℃,体系发生明显的微观相分离(图10)。同时,pH 7.0条件下加热,未对样品的黏度产生显著影响(图11)。对于pH 4.5的乳液体系,当温度增加至80 ℃和100 ℃,液滴粒径显著增加(图9)。图11黏度结果也显示加热引起了液滴粒径的增加和絮凝,导致样品表观黏度有一定程度的增加。
图7 热处理温度对MBPI-CMC乳液分层情况的影响
Fig.7 Effect of temperature on the stratification of
MBPI-CMC-stabilized emulsions
(1) 在pH 7.0条件下,CMC与吸附于乳液液滴表面的MBPI未发生明显吸附。CMC主要存在于分散相中,诱导液滴发生排斥絮凝。当CMC添加量较低(≤0.2%),其对体系黏度的贡献不足以抵抗液滴间的排斥作用时,体系产生失稳现象,样品底部出现肉眼可见的水析层。随着CMC添加量增加,体系黏度增加,宏观的相分离被抑制。
a-pH 7.0 MBPI-CMC乳液;b-pH 4.5 MBPI-CMC乳液
图8 热处理温度对MBPI-CMC乳液TSI的影响
Fig.8 Effect of temperature on the TSI of
MBPI-CMC-stabilized emulsions
图9 热处理温度对MBPI-CMC乳液粒径的影响
Fig.9 Effect of temperature on the mean droplet diameter
(d43) of MBPI-CMC-stabilized emulsions
a-pH 7.0 MBPI-CMC乳液;b-pH 4.5 MBPI-CMC乳液
图10 热处理温度对MBPI-CMC乳液微观结构的影响
Fig.10 Effect of temperature on the microstructure of
MBPI-CMC-stabilized emulsions
注:图中红色为油脂;绿色为蛋白
图11 热处理温度对MBPI-CMC乳液黏度的影响
Fig.11 Effect of temperature on the viscosity of
MBPI-CMC-stabilized emulsions
(2) 在pH 4.5条件下,CMC与液滴表面带有相反电荷的MBPI发生静电吸附作用,当多糖浓度≥0.4% 时,多糖通过静电作用和空间位阻效应稳定液滴,获得分散均匀的乳液体系。此时CMC对体系的黏度贡献较小,不是酸性乳液稳定性提高的关键因素。
(3) 在热处理条件下(60~100 ℃,30 min),添加0.4%CMC的中性和酸性MBPI乳液均发生了絮凝,并且酸性条件下,液滴粒径增加较为显著。但不同温度下处理的样品,均未发生宏观的失稳现象,表明CMC稳定的MBPI乳液具有一定的热稳定性。
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