Effect of exogenous AHLs signal molecules on the spoilage ability of Pseudomonas
ABSTRACT In order to explore the quorum sensing (QS) of Pseudomonas and its effect on meat spoilage, exogenous acylhomoserine lactone (AHLs) -like signal molecules were added to the culture medium of Pseudomonas to measure the growth curves and biofilm change. Sterile pork chunks were treated with Pseudomonas solution supplemented with AHLs. Sensory evaluation was carried out during storage. Total volatile basic nitrogen (TVB-N) was measured. Volatile organic compounds were analyzed by gas chromatography-ion mobility spectrometry (GC-IMS). The results showed that the four signal molecules, N-hexanoyl-L-homoserine lactone(C6-HSL), N-octanoyl-L-homoserine lactone(C8-HSL),N-dodecanoyl-L-homoserine lactone (C12-HSL) and N-tetradecanoyl-L-homoserine lactone(C14-HSL) had no obvious influence on the growth of Pseudomonas(P>0.05), but they could promote the formation of biofilm(P<0.05), of which C8-HSL and C12-HSL had the most significant influence. At the later stage of pork storage, sensory score in the group with exogenous AHLs signal molecules was significantly lower than that in the control group (P<0.05), and theTVB-N value was higher (P<0.05). The volatile organic compounds produced by adding exogenous AHLs signal molecules were different from the fresh group and the control group, and the volatiles produced were also different when adding different signal molecules. The C14-HSL group had the highest similarity with the control group, while the C6-HSL group had the lowest similarity with the control group and the fresh group. This study showed that exogenous signal molecules have no effects on the growth of Pseudomonas. However, they could promote the spoilage ability of Pseudomonas, and the effects of different signal molecules were different.
Key words acylhomoserine lactone(AHLs);signaling molecule;quorum sensing; Pseudomonas； spoilage ability
大量研究表明，食品腐败菌的致腐性受群体感应(quorum sensing，QS)系统的调控，腐败菌的作用与QS密不可分[1-2]。QS是微生物之间的信息交流传递机制[3]，当细菌空间数量达到一定密度时，能够自发地产生并释放信号分子，当信号分子浓度达到阈值浓度时，细菌就会启动相关基因的表达，从而调控某些生物行为[4]，如生物发光、毒性因子分泌、孢子产生、生物膜形成和抗生素合成等[5-6]。肉的腐败变质主要是由分解蛋白质、脂肪的特定腐败菌(specific spoilage organism, SSO)引起的，在有氧条件下，假单胞菌(Pseudomonas)是冷却肉主要的SSO [7-8]。因此，研究肉中假单胞菌的QS现象并进行调控，可以控制肉的腐败进程，对于靶向抑菌及保障肉品质量安全具有重要意义[9]。假单胞菌的QS系统主要是酰基高丝氨酸内酯(acylhomoserine lactone, AHLs)系统，其信号分子为不同长度的AHLs类化合物[10]。
国内外研究者针对肉类腐败过程中信号分子的种类及其作用开展了广泛的研究[3]，但在外源信号分子对假单胞菌生长繁殖及对肉品质的影响方面的研究较缺乏。本文研究了4种不同外源信号分子N-己基-L-高丝氨酸内酯(N-hexanoyl-L-homoserine lactone,C6-HSL)、N-辛酰-L-高丝氨酸内酯(N-octanoyl-L-homoserine lactone，C8-HSL)、N-十二烷基-L-高丝氨酸内酯(N-dodecanoyl-L-homoserine lactone,C12-HSL)、N-十四烷基-L-高丝氨酸内酯(N-tetradecanoyl-L-homoserine lactone,C14-HSL)对假单胞菌生长的影响，通过测定冷却猪肉贮藏过程中感官、挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)以及挥发性有机物等指标，探究在外源AHLs信号分子诱导下假单胞菌对冷却猪肉致腐能力的影响，为进一步明确QS在肉品腐败中的作用，以及基于干扰腐败菌QS的冷却肉防腐保鲜提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冷却猪肉为猪里脊肉，双汇冷鲜肉专卖店；假单胞菌(Pseudomonas)ACCC 01056，中国农业微生物菌种保藏中心；纯度>98%AHLs标准品(C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL)，Sigma公司；蛋白胨、牛肉膏、琼脂等，北京奥博星生物技术有限责任公司；MgO、硼酸等，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
T9S紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；SCIENTZ-04无菌均质器，宁波新芝生物科技股份有限公司；BHC-1300生物安全柜，江苏通净净化设备有限公司；HZL-280恒温振荡培养箱，太仓市强乐实验设备有限公司；K9840凯氏自动定氮仪，济南海能仪器有限公司；FlavourSpec 1H1-00053气相色谱离子迁移谱，德国 G.A.S.公司；CTC-PAL自动进样装置，瑞士 CTC Analytics AG 公司；毛细管柱(30 mm×0.25 mm×0.50 μm，CLOT)，德国 CS Chromatographie Service GmbH 公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株生长曲线的绘制
根据张笑笑[11]的方法加以修改。准备1 000 mL灭菌肉汤培养基，接种10环假单胞菌，制成菌悬液，菌悬液的OD600值约为0.07。将菌悬液分成5等份于灭菌锥形瓶中，28 ℃振荡培养2 h后，分别加入过滤除菌的信号分子C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL溶液，使信号分子最终浓度约为10 μmol/L，用无菌蒸馏水代替信号分子溶液加入肉汤培养基作为对照。每隔2 h测吸光值OD600，连续测量24 h，每个处理做5次平行。以培养时间为横坐标，以OD600数值为纵坐标，绘制生长曲线。
1.3.2 假单胞菌生物膜的测定
采用结晶紫染色法[12]进行测定，根据洗脱液的吸光值对生物膜进行定量分析。准备100 mL灭菌肉汤培养基，接种1环假单胞菌，混合均匀，制成菌悬液。取5 mL菌悬液于灭菌试管中，静置培养过夜后，分别加入信号分子C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL，使信号分子的最终浓度为10 μmol/L，对照组加入相同体积的无菌水。28 ℃培养24 h，培养完成后，向试管内加入1 mL质量浓度为1 g/L结晶紫染色剂染色15 min。然后用1 mL的双蒸水冲洗，再加入5 mL 95%(体积分数)乙醇溶液进行漂洗，测定漂洗液在570 nm吸光值，每个处理进行3次平行试验。
1.3.3 无菌猪肉的处理与接种
根据朱素芹[13]的方法加以修改。在无菌条件下，将新鲜猪肉切成约(8×3×6) cm的肉块，然后用75%(体积分数)酒精浸泡1 min，再用无菌生理盐水清洗3次，最后在生物安全柜中用紫外灯照射1 h，得到表面无菌猪肉。
取10环假单胞菌置于1 000 mL无菌生理盐水中，将菌液分成5份，取其中4份分别加入信号分子C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL，使信号分子的最终浓度为10 μmol/L，第5份加入相同体积的无菌水作为对照。将无菌肉块在菌液中浸泡10 s后装入无菌封口均质袋中，置4 ℃恒温箱中贮藏，以接种假单胞菌但无信号分子的肉块为对照组，贮藏期间每2 d取样测定。
1.3.4 感官评价
感官评价标准在参考GB/T 22210—2008[14]和GB/T 9959.2—2008[15]的基础上加以修改。由15名经训练的品评员组成感官评价小组，根据色泽、气味、弹性、组织形态进行鲜度评价，评价标准如表1所示。采用5分法进行评分，4～5分为一级鲜度肉；3～4分为二级鲜度肉；3分为可接受界限，即感官拒绝点；1～3分为腐败肉。
表1 冷却猪肉品质感官评价表
Table 1 Sensory evaluation of chilled pork
评分/分色泽气味弹性组织形态5色泽明亮,肌肉切面富有光泽猪肉特有香味很浓郁坚实富有弹性,按出压痕立即消失肌肉组织紧密,纹理很清楚4色泽明亮,肌肉切面有光泽猪肉特有香味较浓郁坚实有弹性,按出压痕较快消失肌肉组织较紧密,纹理较清楚3色泽稍暗淡,肌肉切面稍有光泽特有香味清淡,略有异味较有弹性,按出压痕消失较慢肌肉组织不紧密,但不松散2色泽较暗淡,肌肉切面无光泽香味消失,有腥臭和腐臭味弹性较差,按出压痕消失很慢肌肉组织不紧密,但局部松散1色泽暗淡,肌肉切面无光泽有浓烈腥臭和腐臭味无弹性,按出压痕不消失肌肉组织不紧密,完全松散
1.3.5 挥发性盐基氮的检测
按照国标GB 5009.228—2016[16]规定的方法进行测定。取20 g切碎的肉样加入100 mL去离子水中，振摇，浸渍30 min后过滤，取10 mL滤液用半微量定氮法测定3次，取平均值。同时做试剂空白。
1.3.6 挥发性有机物检测
将1.3.3处理的样品肉在货架终点时进行气相离子迁移谱(gas chromatography-ionmobility spectrometry，GC-IMS)检测，同时测定新鲜样品的挥发性有机物。测定条件如下:
(1)顶空进样条件
顶空孵化温度：45 ℃；孵化时间：10 min；加热方式：振荡加热；顶空进样针温度：50 ℃；进样量：500.0 μL，不分流模式；利用高纯N2(纯度≥99.999%)推进和清洗进样针，清洗时间：0.5 min。
(2)GC- IMS 条件
色谱柱温度：40 ℃；运行时间：15 min；载气：高纯N2(纯度≥99.999%)；流速：初始 5 mL/min，保持10 min后于5 min内线性增至150 mL/min。漂移管长度：5 cm；管内线性电压：400 V/cm；漂移管温度：40 ℃；漂移气：高纯N2(纯度≥99.999%)；流速：150 mL/min；IMS探测器温度：45 ℃。
(3)检测方法
取3.0 g样品，置于20 mL进样瓶中，45 ℃孵化10 min，顶空进样，用FlavourSpec®风味分析仪进行检测，采用G.A.S公司开发的软件分析给出样品中挥发性有机物的差异谱图，并利用软件内置的NIST数据库和IMS数据库对物质进行定性分析。
1.3.7 数据处理
采用 SPSS 23.0 软件进行数据分析，结果均采用平均值±标准差来表示，设定 P<0.05 为差异显著，P<0.001为差异极显著，用 Origin 9.1 软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 外源AHLs信号分子对假单胞菌生长曲线的影响
添加外源信号分子与对照组的假单胞菌生长曲线如图1所示。各处理组的假单胞菌生长呈典型的S型曲线，前期增长平缓，中期急剧生长，后期又趋于缓慢增长的状态，逐渐达到平稳。实验组与对照组假单胞菌数无显著区别(P>0.05)，添加4种外源AHLs信号分子对假单胞菌生长均未产生明显的影响。
图1 添加外源信号分子AHLs后各组假单胞菌生长曲线
Fig.1 Growth curves of Pseudomonas in each group
added exogenous signal molecules AHLs
注：C6、C8、C12、C14分别表示添加C6-HSL、C8-HSL、
C12-HSL、C14-HSL组(下同)
2.2 外源AHLs信号分子对假单胞菌生物膜形成的影响
微生物形成的生物膜黏附于物体表面且难以清除，可以抵抗逆性环境，增强自身对抗生素、环境及宿主免疫系统的耐受能力，是导致腐败菌持续污染食品的重要因素之一[6]。研究发现，假单胞菌的成膜过程受QS系统的调控[17]。
图2 各处理组假单胞菌生物膜的形成
Fig.2 Formation of Pseudomonas biofilm in each group
图2为添加信号分子组与对照组培养24 h后测得的吸光值OD570，添加信号分子的4组吸光值OD570均明显高于对照组，其中C8-HSL和C12-HSL两组达到极显著差异(P<0.01)。由此推断，外源信号分子C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL提高了假单胞菌生物被膜的形成能力。
2.3 外源AHLs信号分子对冷却猪肉挥发性盐基氮的影响
TVB-N是动物类蛋白质在腐败过程中由细菌和酶作用产生的氨以及胺类等碱性含氮物质，其含量多少是评价肉类新鲜程度的重要指标。根据国标GB 2707—2016规定[18]，新鲜猪肉TVB-N≤15 mg/100g，贮藏前期各组TVB-N呈平缓上升状态，在第8～10天时达到15 mg/100g左右，此后TVB-N值上升速度加快。在贮藏前10 d，实验各组TVB-N值与对照组无明显差异(P>0.05)，第12、14、18、20天时，实验各组的TVB-N值显著高于对照组(P<0.05)。
图3 冷却猪肉贮藏过程TVB-N变化曲线
Fig.3 TVB-N curves of chilling pork during storage
2.4 外源信号分子AHLs对冷却猪肉感官评价的影响
冷却猪肉贮藏过程中，实验组与对照组感官评分如图4所示。随贮藏时间延长，感官评分下降。第0～10天，实验组与对照组感官评分无显著差异(P>0.05)；第10天后，实验各组显著低于对照组(P<0.05)，而4个实验组之间无明显异(P>0.05)。原因可能是当假单胞菌达到一定数量时，外源信号分子对假单胞菌的诱导作用使肉的腐败进程加速。
图4 冷却猪肉贮藏期间感官评分
Fig.4 Sensory score of chilling pork during storage
2.5 外源信号分子AHLs对冷却猪肉中挥发性有机物的影响
2.5.1 挥发性有机物差异
图中深色为背景色，浅色表示挥发性有机物，颜色深浅与挥发性有机物浓度有关，浅色表示该有机物浓度较低，深色表示浓度较高(图5-a)，可见不同处理组样品之间的挥发性有机物存在差异。为了更直观地显示不同实验组间的差异，采用差异对比模式(图5-b)，选取新鲜组作为参比，其他各组的谱图扣减参比。如二者挥发性成分一致，则扣减后的背景为白色，其他颜色为二者差异，其中红色代表该物质的浓度高于参比，蓝色代表该物质的浓度低于参比。由图5可知，部分挥发性有机物在贮藏肉组中的含量比新鲜肉组低(蓝色区域点)，而部分挥发性有机物在贮藏肉组中的含量远高于新鲜肉组(红色区域点)，其中有些挥发性有机物在C6-HSL组中的含量最高(如蓝色圆圈标出)。说明各处理组冷却猪肉经贮藏后挥发性有机物种类和数量发生了明显的变化。
a-原始图;b-差异对比图
图5 不同处理样品的挥发性有机物
Fig.5 Volatile organic compounds in different samples
注：XX表示新鲜组，DZ表示对照组，数字表示每个样品平行
测定次数(下同)
2.5.2 挥发性有机物指纹图谱对比
图中每一行代表一个样品的全部信号峰，每一列代表同一挥发物在不同样品中的信号峰，由图6可知，每个样品的完整挥发物信息以及样品之间挥发物的差异。在新鲜猪肉样品中以下几种物质含量较高：乙酸单体(acetic acid monomer)、2-乙基呋喃(2-ethylfuran)、1-戊醇(1-pentanol)、丙酸(propanoic acid)、2-甲基丙醇(2-methylpropanol)、3-甲基-3-丁烯-1-醇(3-methyl-3-buten-1-ol)、2-丙醇二聚体(2-propanol dimer)、2-甲基丙酸(2-methylpropanoic acid)、3-戊酮(3-pentanone)、丙酮醇(hydroxyacetone)、乙酸二聚体(acetic acid dimer)、3-甲基丁酸(3-methylbutanoic acid)、异己醇(isohexanol)、乙酸己酯(hexyl acetate)、戊酸(pentanoic acid)、1-辛烯-3-酮(1-octen-3-one)、3-甲基丁醛(3-methylbutanal)、1-戊醇(1-pentanol)、2,3-丁二醇(2,3-butanedione)等，而在实验组和对照组中含量极低，由此推断，这些物质决定了新鲜猪肉特有的风味。
在实验组C6-HSL中，丁酸(butanoic acid)、庚醛(heptanal)、乙酸丁酯(butyl acetate)、2-甲基吡嗪(2-methylpyrazine)、糠醛(furfural)等含量较高，但这些成分在新鲜猪肉中几乎不存在，在对照组及C8-HSL、C12-HSL和C14-HSL中含量较低。因此，该类物质是C6-HSL组区别于其他几组的主要成分。
图6 猪肉挥发性有机物指纹图谱
Fig.6 Fingerprint of volatile organic compounds in pork
2-乙酰呋喃(2-acetylfuran)、苯甲醇(benzyl alcohol)、苯乙醛(phenylacetaldehyde)和乙酸乙酯(ethyl acetate)等在对照组和C14-HSL中含量较高；糠醇(furfural alcohol)、芳樟醇(linalool)、1-辛烯-3-醇(1-octen-3-ol)、2-甲基-1-丁醇(2-methyl-1-butanol)等在C8-HSL中含量最高，而在对照组和其他实验组中的含量较低；甲基异丁基酮(methyl isobutyl ketone)在C14-HSL中含量最高。上述成分在新鲜样品中几乎不存在。
2.5.3 不同样品挥发物的相似度分析
对不同样品间挥发性有机物的整体相似程度进行分析，如图7和表2所示，同一样品2次平行测定结果的相似度达85%以上，说明仪器的重复性良好。新鲜组与对照组和4个实验组的相似度均较低，为41%～52%，说明冷却猪肉经贮藏后挥发性成分较新鲜肉发生了较大变化。其中，新鲜组与C6-HSL组的相似度最低，为41%～45%。4个实验组C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL中，C14-HSL组与对照组的相似度最高，为75%～84%；C6-HSL组与对照组的相似度最低，为57%～67%。由此推断，添加外源信号分子C6-HSL组冷却猪肉经一段时间贮藏后，其挥发性成分发生了显著的变化。
图7 各处理组样品挥发性有机物的匹配矩阵
Fig.7 Matching matrix of volatile organic compounds in
each group
2.5.4 不同实验组样品的聚类分析
对各处理组样品挥发性有机物进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，很明显地分为两类：一类是新鲜组，另一类包括对照组和4个实验组，可见新鲜组与对照组、实验组的差异非常大。在对照组与实验组类别中，对照组与C14-HSL组的差异最小，与C6-HSL组的差异最大(图8)。
表2 各处理组样品挥发性有机物的相似度
Table 2 Similarity of volatile organic compounds in
each group
XX-1XX-2DZ-1DZ-2C6-1C6-2C8-1C8-2C12-1C12-2C14-1C14-2XX-11008550514543505249515152XX-28510048504541475047495051DZ-15048100856257636667697575DZ-25150851006764707476788384C6-14545626710082666871706466C6-24341576482100697071696263C8-15047637066691009078777172C8-25250667468709010080817476C12-14947677671717880100917576C12-25149697870697781911007779C14-15150758364627174757710092C14-25251758466637276767992100
图8 各处理组样品主成分分析
Fig.8 PCA of samples in each group
3 结论与讨论
添加4种外源信号分子C6-HSL、C8-HSL、C12-HSL、C14-HSL后假单胞菌的生长曲线与对照组无差异(P>0.05)，说明信号分子对假单胞菌的生长繁殖不起作用，这与张笑笑[12]的研究结果一致。外源AHLs信号分子能够促进假单胞菌生物被膜的形成，其中C8-HSL与C12-HSL的影响最显著。张笑笑[12]研究发现，不同的AHLs信号分子对S.baltica100菌株生物被膜形成能力影响不同，C10-HSL显著増强了S.baltica100菌株生物被膜的形成能力。YANG等[19]研究发现添加外源C10-HSL、oxo-C10-HSL、OH-C10-HSL促进了Cylindrotheca sp.生物被膜的形成，其中C10-HSL的影响最为显著。
在贮藏前期，添加外源AHLs信号分子对冷却猪肉TVB-N和感官评价无显著影响(P>0.05)，而在贮藏后期，外源AHLs信号分子促进TVB-N的生成，并加速感官品质的降低。张笑笑[11]研究发现，外源AHLs信号分子的添加加速了无菌鱼汁的腐败，TVB-N的生成量增加。ZHU等[20]研究凡纳滨对虾也得到了相似的实验结果。
冷却猪肉添加外源AHLs信号分子组与新鲜组、对照组挥发性有机物存在差异，添加不同AHLs信号分子组之间挥发物也存在差异。相似度分析与聚类分析结果均表明，C14-HSL组与对照组的相似度最高，C6-HSL组与对照组和新鲜组的相似度均最低。
以上结果表明，外源AHLs信号分子对假单胞菌株自身的生长繁殖无影响，但能促进其对冷却猪肉的致腐能力，且不同信号分子的促进作用存在差异。原因可能与该菌株自身产生的信号分子结构有关，后期将对该菌株产生的信号分子种类和结构进行深入研究。
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