Effect of four probiotics on the physicochemical properties and probiotics viability of fermented yogurt
ABSTRACT Fresh milk was used as raw material, and the yogurt cultures was co-fermented with Bifidobacterium animalis (A-Ba), Lactobacillus plantarum (A-Lp), Lactobacillus casei (A-Lc) and Lactobacillus acidophilus (A-La) to prepare solidified yogurt, respectively. Viability of lactic acid bacteria, acidity, diacetyl contents, acetaldehyde contents and water holding capacity (WHC) were measured and the changes of physicochemical properties and probiotics were evaluated for the yogurt stored at 4 ℃ for 28 days, and the correlation between the measurements was analyzed. The results showed that the viability of L. casei was the highest, followed by B. animalis, L. plantarum, and L. acidophilus (P<0.05) in the storage period. The survival rates of S. thermophilus in the treated group and the control group elevated first and then decreased (P<0.05). Moreover, A-Lc had relatively higher diacetyl content and better butter flavor during storage period. After 7 days of storage, the content of acetaldehyde of A-Lc was better, which was better than that of other treatment groups. During the storage period, the WHC of yogurt showed an increasing trend. A-La was only lower than A-Lp on day 1～21, and the WHC on day 28 was the lowest in each group (P<0.05). There was no significant difference between A-Ba and group A in WHC during storage (P>0.05). The WHC of A-Lc was the lowest in each group (P<0.05). When yogurt was stored for 28 days, L. acidophilus had the largest capacity for acid production, followed by L. plantarum and L. casei, and the weakest was B. animalis. According to the correlation analysis, after stored at 4 ℃ for 28 days, the acidity was negatively correlated with the viability and diacetyl content, while positively correlated with acetaldehyde and WHC.
Key words co-fermentation;physicochemical properties; viability of lactic acid bacteria
益生菌是通过改善肠道微生物平衡对宿主产生有益影响的一类微生物[1]。作为益生菌，应具备对宿主无致病性和毒性、含有大量活细胞、能够在肠道内存活和代谢等特性，而益生菌产品需含有足够量的活细菌才能在肠道中发挥作用[2]。除了改善肠道健康外，益生菌对其他疾病也具有有益作用，比如乳糖不耐症、癌症、过敏、肝病、幽门螺杆菌感染、尿路感染和高脂血症等[3]。
酸奶是人体摄入食物时益生菌的最好载体之一，同时添加益生菌有利于酸奶的发酵。过去酸奶的制作多用单株菌种发酵，导致酸奶发酵时间长，凝固性差，而采用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为基础发酵剂，与益生菌共发酵可解决这个问题。关于酸奶制作过程添加益生菌进行共发酵的研究已有部分报道。KORBEKANDI等将基础发酵剂与干酪乳杆菌共发酵，在5 ℃贮藏21 d，对其pH值、活菌数、感官进行了分析，发现酸奶在贮藏期感官特性均无显著变化，pH值、活菌数持续降低，但仍高于益生菌产品的标准[4]；MANI-L
PEZ利用基础发酵剂分别与嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌共发酵，研究其滴定酸度、持水力、活菌数、感官在5 ℃贮藏35 d的变化，未发现明显的感官变化，但是乳酸从0.09%增加到0.29%，活菌数保持在粮农组织建议水平[5]；尚楠等将双歧杆菌与基础发酵剂共发酵，在4 ℃下贮藏20 d，发现酸奶酸度为100～110 °T，活菌数≥106 CFU/mL，酸奶持水力呈下降趋势，最高可达90%[6]；LI等研究了部分益生菌与嗜热链球菌发酵对贮藏期理化特性变化[7]。
目前，同时将基础发酵剂与双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌复合发酵制作酸奶，比较各酸奶在贮藏期理化特性和益生菌数的研究尚未见报道，本试验旨在研究4株益生菌酸奶在4 ℃贮藏28 d理化特性和益生菌数变化，系统比较分析添加不同益生菌复合发酵对酸奶贮藏期品质的影响规律，为益生菌酸奶的生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验菌株和处理组：本试验共分成5组，每组按照试验设计添加对应的发酵剂进行酸奶的制备。对照组，添加嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)混合菌种，丹麦Danisco公司，记为A；处理组，分别在混合菌株基础上添加双歧杆菌CICC-21717(Bifidobacterium animalis)，记为A-Ba，添加植物乳杆菌CICC-20263(Lactobacillus plantarum)，记为A-Lp，添加干酪乳杆菌CICC-20280(Lactobacillus casei)，记为A-Lc，添加嗜酸乳杆菌CICC-20248(Lactobacillus acidophilus)，记为A-La，益生菌菌株，中国工业微生物菌种保藏管理中心；鲜牛奶，新希望乳业；蔗糖，太古糖业；NaCl、NaOH、酚酞、双乙酰、三氯乙酸、邻苯二胺、HCl、NaHSO3、NaHCO3、淀粉、碘、KI均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
DHP-9052型电热恒温培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司；NS1001L型高压均质机，意大利NiroSoavi公司；PL303分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；UV-2102 PCS型紫外分光光度计，龙尼克仪器有限公司；GL-21M离心机，上海市离心机械研究所。
1.3 试验方法
1.3.1 酸奶制作工艺流程
所有酸奶制作按照以下流程进行：
主要操作过程为将鲜牛乳置于大烧杯中进行水浴加热至70 ℃，加入质量浓度为60 g/L蔗糖，混合均匀后将牛奶冷却至45 ℃再进行均质；随后进行巴氏杀菌处理，将牛奶加热至90 ℃保持10 min；杀菌结束后冷却至40～45 ℃接种菌株，先将混合菌粉按照计算量加入一定量的牛奶中溶解再分装至已消毒的酸奶杯中，然后将4株益生菌母发酵剂以2×107 CFU/mL的计算量分别接种于酸奶杯中，加入杀菌冷却后的牛奶，混合均匀后分装[8]，放入37 ℃培养箱中发酵；酸奶发酵结束后迅速冷却，放入4 ℃进行贮藏；分别于1、7、14、21、28 d对酸奶样品进行检测。
1.3.2 活菌数的检测
称取25 g酸奶样品，与225 mL 9 g/L生理盐水混合于无菌均质袋中，用无菌均质机进行拍打至混合均匀，吸取1 mL混合样品进行梯度稀释，每一梯度稀释倍数均为10倍；选取适宜的2～3梯度进行平板计数，吸取1 mL至培养皿中，再倒入15～20 mL的选择培养基；培养基凝固后倒置在37 ℃培养箱中培养。其中嗜酸乳杆菌选择培养基为克林霉素-乳酸细菌(Man Rogosa Sharpe Medoum，MRS)培养基[9]，双歧杆菌选择培养基为BL培养基[10]，植物乳杆菌为植物乳杆菌选择培养基[11]，干酪乳杆菌选择培养基为万古霉素-MRS培养基[12]，嗜热链球菌为M17培养基[13]。培养结束后，对平板进行计数，选择30～300的菌落数，计算后结果为每毫升菌落形成数量，单位为CFU/mL[4]。
1.3.3 酸奶酸度的测定
采用滴定法测定发酵乳的酸度[14]，取发酵乳样品5.0 g，加入5 mL蒸馏水，混合均匀，加入2滴5 g/L的酚酞指示剂，用0.1 mol/L NaOH滴定至淡粉色，1 min内不褪色，同时做空白试验，根据所消耗NaOH标准溶液的量计算出滴定酸度(°T)。
1.3.4 双乙酰的测定
参考邵亚东报道的双乙酰的测定方法进行[15]。按照参考的测定方法绘制双乙酰标准曲线。得到标准曲线后，取待测酸奶样品30 g，加入30 mL质量分数为16%的三氯乙酸溶液混匀，4 ℃，4 500 r/min离心10 min，将上清液再用滤纸过滤一遍，以保证澄清，同时做空白试验。每个样品取10 mL装入离心管中，分2组，一组为空白试验。再按照制作标准曲线的操作测定样品在335 nm下的吸光度。
1.3.5 乙醛的测定
参考刘宁宁测乙醛含量的方法[16]。取上清液备用(同测定双乙酰处理方法)。再精确量取2.0 mL 10 g/L的NaHSO3溶液于三角瓶中，加入处理后的酸奶上清液10 mL，摇匀，在室温下放置1 h后，加入1 mL 10 g/L淀粉溶液(现配现用)，用0.01 mol/L I2标准溶液滴定至终点(淡蓝紫色，30 s内不褪色)，不计数。再加20 mL 1 mol/L的NaHCO3，振荡混匀至溶液蓝色消失，用0.01 mol/L I2标准溶液滴定至终点，记录消耗的标准碘液的体积，同时做空白试验,乙醛含量计算如公式(1)所示：
乙醛质量浓度
(1)
式中:V1，样品滴定消耗I2标准溶液的体积,mL；V2，空白滴定消耗I2标准溶液的体积,mL；C，1/2 I2标准溶液的浓度,mol/L；0.022，乙醛化学反应基本单位,g；10，乙醛样品称样量,mL。
1.3.6 持水力的测定
根据RIENER等报道的方法稍作修改进行[17]。离心管称重，质量为m1；取酸奶10 g左右，记m2；室温下5 000 r/min离心30 min，弃上清液，离心管倒置10 min后立即称重，质量为m3，酸奶持水力为酸奶离心后的沉淀物与样品的百分比，计算持水力(water holding capacity，WHC)，如公式(2)所示：
(2)
1.3.7 数据处理
益生菌酸奶滴定酸度、活菌数、双乙酰含量、乙醛含量和相关性分析均通过SPSS进行ANOVA分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 贮藏期酸奶酸度的变化
图1为益生菌酸奶贮藏28 d各个时间点的滴定酸度变化，各组的滴定酸度均达到国家标准(°T>70)，在贮藏期均为上升趋势。在贮藏过程中，对照组的酸度均低于处理组的酸度。在试验组之间，A-La组酸度在1～21 d始终为最高，范围在88～104 °T，但在28 d时，A-Lc组酸度高于A-La组，且在试验组之间酸度最高，A-Lc组酸度为82～108 °T，说明嗜酸乳杆菌与干酪乳杆菌发酵酸奶在发酵过程中所产的乳酸与后酸化的叠加效果更大，贮藏28 d后酸度均达到100 °T以上。A-Lp组在1～14 d酸度快速上升，在21与28 d酸度上升缓慢，为75～96 °T；A-Ba组的酸度最低，为75～88 °T。处理组之间酸度变化不同，推测其原因为不同益生菌发酵乳中保加利亚乳杆菌的过度酸化程度不同[18]。综上所述，4株益生菌中产酸能力最强为嗜酸乳杆菌，其次为干酪乳杆菌，再者为植物乳杆菌，最后为双歧杆菌。
图1 四株益生菌发酵酸奶在贮藏期滴定酸度变化
Fig.1 Changes in titratable acidity of four
probiotic yoghurt during storage
2.2 贮藏期活菌数的变化
酸奶制作过程中各类益生菌经过发酵后活菌数存在明显差异(表1)。在贮藏过程中，Lc的活菌数显著高于其余益生菌(P<0.05)，说明Lc更加适应酸奶的酸环境。当贮藏1～14 d时，4组试验组的活菌数也存在显著差异(P<0.05)；而贮藏至21 d时，La和Lp活菌数显著低于Lc和Ba，且La和Lp之间尚未存在显著性差异(P>0.05)。随着贮藏时间的延长，Lc和Lp的活菌数均呈显著下降趋势(P<0.05)，但在28 d时，Lc的活菌数较21 d有显著增加(P<0.05)，其原因可能为试验误差所致；而La和Ba均呈先上升后下降趋势，La在贮藏第14天达到峰值，Ba在第7天达到峰值。同时，这4株益生菌中，Ba的下降速率快，保加利亚乳杆菌形成H2O2是混合培养中失去Ba的主要因素[19]。益生菌的存活率受贮藏期酸奶酸度变化的影响，随着酸奶酸度的增加，益生菌的存活率下降，并且保加利亚乳杆菌在贮藏期产生的H2O2，不仅会导致保加利亚乳杆菌对酸乳杆菌产生拮抗作用[19]，而且还会损害酸奶中部分益生菌[20]，进而使益生菌活菌数下降。本研究中发现4株益生菌在酸奶贮藏28 d后活菌数均在1×107 CFU/mL以上，保持在联合国粮食及农业组织建议水平(>1×107 cfu/mL)之上。
表1 四株益生菌发酵酸奶在贮藏期益生菌的存活率
Table 1 Viability of four strains of probiotic fermented
yogurt during storage period
贮藏期/d活菌数×10-7/(CFU·mL-1)LcLaBaLp113.30±2.83aA5.10±1.41cD9.10±1.41bB6.85±0.71aC711.80±2.83bA7.20±2.83bC10.70±0.00aB6.20±2.83bD1410.75±0.71cA7.75±0.71aB6.60±1.41cC4.75±2.12cD218.90±1.41eA4.45±0.71dC5.05±2.12dB4.40±1.41cC289.70±2.83dA3.25±0.71eC4.75±0.71dB3.15±0.71dC
注：小写字母表示益生菌贮藏28 d各时间点之间的差异，大写字母表示同一时间点不同益生菌之间的差异(P<0.05)(下同)；Lc为干酪乳杆菌，La为嗜酸乳杆菌，Ba为双歧杆菌，Lp为植物乳杆菌
在4 ℃贮藏过程中，A-Ba组的嗜热链球菌活菌数在1～21 d时显著高于其余组(P<0.05)，且在贮藏28 d内活菌数减少速率较其余组快，可能是保加利亚乳杆菌产生的H2O2影响嗜热链球菌的生长；在21 d时，A-Lc组显著低于其余组(P<0.05)，可能是由于A-Lc组经过贮藏后，酸度较高，导致活菌数降低；而A-La、A-Ba和A-Lp组均高于A组且无显著差异(P>0.05)。28 d时，A-Lp与A组显著低于A-La、A-Ba组(P<0.05)。随着贮藏时间的延长，A组嗜热链球菌活菌数呈下降趋势；而A-Lc、A-La、A-Ba和A-Lp组均呈先上升后下降的趋势，A-Lc组在28 d时呈上升趋势，可能是由于试验误差所致。此外，4组处理组均在贮藏第7天达到峰值。这一结果与DAVE等的研究报道结果一致[20]。DAVE等研究发现，嗜热链球菌在贮藏14 d内呈上升趋势，随后下降，贮藏期内的计数仍在107 CFU/mL以上[20]。嗜热链球菌活菌数的下降与酸奶滴定酸度的升高有关，随着乳酸菌分解乳糖产酸，体系酸度增加，乳酸菌的生长也受到抑制，同时，随着贮藏时间的延长，体系中乳酸菌能利用的营养成分也逐渐减少，导致酸奶中活菌数减少(表2)。
表2 对照组与处理组中嗜热链球菌在贮藏期的存活率
Table 2 Viability of S.thermophilus during storage in
control and treatment groups
贮藏期/d活菌数×10-8/(CFU·mL-1)A-LcA-LaA-BaA-LpA18.85±0.71bB9.00±1.41bB10.00±0.00cA7.75±3.54bC9.00±1.41aB710.90±1.41aB9.07±1.41aC11.85±0.71aA9.05±2.12aD8.85±2.12aD146.75±0.71cD7.75±0.71cB10.45±0.71bA7.20±2.83bC4.85±2.12bE214.10±1.41eC5.95±0.71dA6.05±0.71dA5.80±1.41cA4.85±0.71bB286.10±1.41dA5.60±1.41eB5.45±0.71eB3.95±0.71dC3.60±1.41cD
2.3 双乙酰含量变化
双乙酰被认为是主要的芳香化合物之一，其带有奶油香味[21]。A-La组在贮藏过程中呈下降趋势，1 d时双乙酰含量为各组中最高(P<0.05)，7～21 d双乙酰含量差异不显著(P>0.05)，28 d双乙酰含量显著低于前21 d，但显著高于其余组(P<0.05)；A-Ba组双乙酰含量在14 d达到最大值，随后下降；A、A-Lc、A-Ba组均呈先上升再下降的趋势。A-Lp组双乙酰含量从7 d开始下降，7～21 d均为各组中最低；A-Lc组在7～21 d双乙酰含量明显高于其余处理组，14 d时达到最大值，在28 d时迅速下降至各组中最低(P<0.05)，可能是28 d A-Lc组pH值上升，使得酸奶的双乙酰含量下降(图2)。双乙酰是酸奶后发酵过程中一些香味细菌产生的，所以A-Lc组的后发酵过程更利于双乙酰的生成，A-Lc组在贮藏期奶油香味更佳[22]。各组双乙酰含量在28 d时下降，随着酸奶酸度的增加，乳酸菌与某些香味细菌存活率降低且伴随着乳糖利用率降低，这有可能是导致双乙酰含量下降的原因。
图2 对照组与处理组在贮藏期双乙酰质量浓度的变化
Fig.2 Changes in diacetyl content of four
probiotic yoghurt during storage
注：小写字母表示益生菌贮藏28 d各时间点之间的差异，
大写字母表示同一时间点不同益生菌之间的差异(P<0.05)(下同)
2.4 酸奶在贮藏期乙醛含量的变化
乙醛也是酸奶滋味的主要风味物质之一，乳酸菌通过糖酵解(glycolytic pathway，EMP)途径产生丙酮酸，丙酮酸有限转化为乳酸，残留的丙酮酸转化为乙醛，在酸奶发酵过程中主要通过脱氧核糖5-磷酸在脱氧核糖醛缩酶催化作用下生成以及苏氨酸在苏氨酸醛缩酶催化作用下降解生成[21, 23]。由图3可知，随着贮藏时间的延长，A-La和A-Ba组乙醛含量均呈先上升后下降的趋势，且21 d时乙醛含量达到最大。同时，在21与28 d时，A-La组的乙醛含量均显著高于其余处理组(P<0.05)。此外，在贮藏期A组乙醛含量呈逐渐上升趋势；A-Lp组呈先下降后上升再下降趋势，在21 d达到峰值；A-Lc组呈先上升后下降再上升趋势，在14 d达到峰值，且显著高于其余组(P<0.05)。乙醛呈清爽的芳香味，但若含量过高，也会产生不愉悦的味道，一般认为乙醛最佳风味值为20～40 mg/L[24]，A组在贮藏期均达到最佳风味值，A-Lc组贮藏7 d之后均达到最佳风味值，优于其余处理组。乙醛是由酸奶中保加利亚乳杆菌所产生，因此酸奶在贮藏期的后酸化对乙醛也会产生影响，且乙醛含量随酸奶酸度的增加而增加[25]，其可能是A-Lc乙醛含量优于其余组所致。
图3 对照组与处理组在贮藏期乙醛含量的变化
Fig.3 Changes in Acetaldehyde content of four
probiotic yoghurt during storage
2.5 酸奶的持水力在贮藏期的变化
酸奶持有全部或部分自身水的能力被定义为酸奶的持水力[26]。持水力变化如图4所示，在酸奶贮藏过程中，1、21和28 d时，各组之间均无显著差异性(P>0.05)；第7天时，A-Lp组持水力显著高于其余4组(P<0.05)；第14天时，A-La、A-Lp组持水力显著高于A-Lc组(P<0.05)。此外，在贮藏期间A-Ba与A组的持水力差异不显著(P>0.05)。随着贮藏时间的延长，处理组与对照组持水力均呈上升趋势，这与DAN等的研究结果一致[27]。A-La组在1～21 d仅低于A-Lp组，28 d持水力下降为各组中最低(P<0.05)；A-Ba与A组在贮藏过程中持水力相差不大(P>0.05)；A-Lc组持水力为各组中最低(P<0.05)。不同益生菌酸奶持水力不同可能与益生菌分泌的胞外多糖有关[28]，胞外多糖能增强酸奶的持水能力，有利于防止乳清的析出[29]。
图4 对照组与处理组在贮藏期持水力的变化
Fig.4 Changes in water holding capacity of four
probiotic yoghurt during storage
2.6 相关性分析
表3为4组处理组指标间的相关性分析。由表3可知，A-La、A-Ba、A-Lp、A-L组的益生菌数与嗜热链球菌数均呈较强的正相关。A-Lac组滴定酸度与乙醛含量、持水力呈正相关，与益生菌数、嗜热链球菌数、双乙酰含量呈负相关；A-Lc组滴定酸度与乙醛含量、持水力呈正相关，与益生菌数、嗜热链球菌数、双乙酰含量呈负相关。A-Ba、A-Lp组的滴定酸度与益生菌数、嗜热链球菌数、双乙酰含量呈负相关，与乙醛含量、持水力呈正相关。4组处理组的滴定酸度与活菌数，双乙酰含量均呈负相关，与乙醛含量、持水力呈正相关。上述试验结果表明酸奶酸度是导致活菌数降低的主要因素。此外，酸度较高的环境导致部分产香的菌种无法生存，进而导致双乙酰含量下降。然而贮藏期滴定酸度的上升，使得乙醛含量随之上升，较强的后酸化会使酸奶风味降低。同时，持水力的增加不仅与滴定酸度有关，还与菌种本身分泌的胞外多糖密切相关。
表3 各指标间的相关性分析
Table 3 Correlation analysis between indicators
A-LaA-BaA-LpA-LcX1X2X3X4X5X6X1X2X3X4X5X6X1X2X3X4X5X6X1X2X3X4X5X6X11 0.700*-0.0390.588-0.568-0.56310.858**-0.2630.647*-0.120-0.936**10.883**-0.861**0.899**0.040-0.790**10.814**-0.921**0.377-0.523-0.665*X2 0.700*1-0.5830.796**-0.886**-0.903**0.858**1-0.4120.923**-0.121-0.867**0.883**1-0.5930.945**0.086-0.948**0.814**1-0.725*0.399-0.176-0.723*X30.039 -0.5831-0.5760.691*0.456-0.263-0.4121-0.5800.0670.402-0.861**-0.5931-0.6010.0730.472-0.921**-0.725*1-0.6160.682*0.820**X40.588 0.796**-0.5761-0.670*-0.791**0.647*0.923**-0.5801-0.045-0.746*0.899**0.945**-0.6011-0.020-0.844**0.3770.399-0.6161-0.215-0.860**X5-0.568 -0.886**0.691*-0.670*10.665*-0.120-0.1210.067-0.0451-0.0170.0400.0860.073-0.0201-0.240-0.523-0.1760.682*-0.21510.411X6-0.903**-0.5630.456-0.791**0.665*1-0.936**-0.867**0.402-0.746*-0.0171-0.790**-0.948**0.472-0.844**-0.2401-0.665*-0.723*0.820**-0.860**0.4111
注：X1、X2、X3、X4、X5、X6分别表示益生菌数、嗜热链球菌数、滴定酸度、双乙酰含量、乙醛含量、持水力；*表示P<0.05，相关性差异显著；**表示P<0.01，相关性差异极显著
3 结论
本研究发现，酸奶在28 d贮藏过程中4株益生菌存活率均下降；但是，Lc含量明显高于其余3株益生菌，其次为Ba活菌数，La与Lp较低。各组滴定酸度在贮藏期均呈上升趋势，4株益生菌的产酸能力强弱顺序依次为嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌。A-Lc组的双乙酰含量在1～21 d明显高于其余组；A-Lc组贮藏7 的d之后均达到最佳风味值，优于其余处理组。A-La与A-Lp组在1～21 d持水力最高，28 d时A-Lc组持水力最高，各处理组持水力的差异可能是由于不同益生菌分泌胞外多糖的能力不同。由相关性分析可知，4组处理组的滴定酸度与益生菌数、嗜热链球菌数、双乙酰含量均呈负相关，与乙醛、持水力呈正相关。综上所述，酸奶的活菌数、双乙酰含量、乙醛含量、持水力均与酸奶发酵过程菌种排酸及后酸化有关，4株益生菌酸奶产酸能力最强的为A-La组，其次为是A-Lc组，再者为A-Lp组，最后为A-Ba组。
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