干酪乳杆菌细菌素的分离纯化及抑菌特性分析

高兆建1*,曹珊珊1,宋玉林1,丁飞鸿1,赵宜峰2,焦魏3

1(徐州工程学院,食品(生物)工程学院,江苏 徐州,221018)2(长江桂柳食品睢宁有限公司,江苏 徐州,221000)3(邳州市金大地肥料有限公司,江苏 徐州,221300)

摘 要 该文从干酪乳杆菌XbC-36发酵液中分离纯化细菌素(命名为BaC21)并分析抑菌特性,为开发为新型食品防腐剂奠定理论基础。硫酸铵盐析、Sephadex G-15柱层析和半制备高效液相色谱法纯化BaC21。三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, Tricine-SDS-PAGE)法测定细菌素分子质量。菌株XbC-36在MRS培养基中发酵稳定期前期(18 h)细菌素达到最大产量1 695 AU/mL。BaC21分子质量4.4 kDa,与其他细菌素分子质量不同,推测为一种新型细菌素。BaC21在37~100 ℃加热30 min抑菌活性几乎无变化,120 ℃加热15 min抑菌活性下降,但没有完全丧失,表明具有较高热稳定性;BaC21在pH 2~8保持稳定;有机溶剂和表面活性剂对BaC21抗菌活性无影响,但SDS能提高其抗菌活性;经多种蛋白酶处理后,其抑菌活性完全失活,而脂肪酶和α-淀粉酶则无明显作用,表明BaC21具有蛋白质性质。BaC21具有广谱抑菌活性,尤其对革兰氏阴性食源性致病菌具有强抑制作用。BaC21能使金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusS. aureus)和大肠杆菌(Escherichia coliE. coli)细胞裂解而发挥抑菌作用。BaC21优良的抑菌特性表明其有开发为食品生物防腐剂的潜力。

关键词 干酪乳杆菌;细菌素;分离纯化;抑菌特性

Purification of bacteriocin from Lactobacillus casei and analysis of antibacterial characteristics

GAO Zhaojian1*,CAO Shanshan1,SONG Yulin1,DING Feihong1,ZHAO Yifeng2,JIAO Wei3

1(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221018, China)2(Yangtze River Guiliu Food Suining Co., Ltd., Xuzhou 221000, China)3(Pizhou Golden Earth Fertilizer Co., Ltd., Xuzhou 221300, China)

ABSTRACT The aim of this work was to purify and characterize the bacteriocin (named as BaC21)produced by Lactobacillus casei XbC-36 and laid a theoretical foundation for the further development of BaC21 as a new food preservative. BaC21 was purified by ammonium sulphate precipitation, Sephadex G-15 column chromatography and reverse-phase high-performance liquid chromatography. Molecular weight of BaC21 was determined by tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (Tricine-SDS-PAGE). Production of bacteriocin BaC21 in MRS medium reached the maximum yield of 1 695 AU/mL at the beginning of the stationary phase (18 h). The molecular weight of BaC21 was 4.4 kDa. Because its molecular mass was not similar to other known bacteriocins, BaC21 could be a novel bacteriocin. Then, the antimicrobial activity of BaC21 was nearly not affected by heating at 37-100 ℃ for up to 30 min and decreased but not fully suppressed when exposed to a temperature of 120 ℃ for 15 min, indicating high thermal stability of BaC21. BaC21 remained stable at pH values ranging from 2 to 8. Antimicrobial activity was also not affected by organic solvents and surfactants. And, SDS improved its antibacterial activity. BaC21 was of proteinaceous nature, in which complete inactivation of its antimicrobial activity was observed after being treated with proteases, while lipase and α-amylase exhibited no effect. In addition, BaC21 had broad antimicrobial spectra and especially for Gram-negative food-borne pathogens. It revealed a bacteriostatic mode of action against Staphylococcus aureus and Escherichia coli in culture media. In conclusion, bacteriocin BaC21 shows great potential as a food bio-preservative.

Key words Lactobacillus casei; bacteriocin; separation and purification; antibacterial characteristics

近年来,全球消费者对安全天然食品重视程度日益增长,人们越来越追求健康的生活方式,对食品加工有了更高的要求,如食品加工过程简单、维生素含量丰富、对健康有益、方便食用、感官特性保持完好、货架期保存优良等。满足这些期望是当前食品工业面临的重大挑战。伴随着消费者对食品的生物保藏需求不断增长,各种化学防腐剂、添加剂、抗生素等安全性问题得到普遍关注[1]。生物防腐剂除了减少因食物变质而造成的经济损失外,还有助于保存食物的天然味道。因此,研究和开发安全高效的生物抑菌剂至关重要。乳酸菌是一群能利用碳水化合物生成乳酸的微生物,在自然界分布广泛,是公认的食品级安全微生物,并且在医药及食品等领域具有极高的应用价值。

乳酸菌在糖发酵过程中产生各种各样的天然代谢物,如乳酸、双乙酰、过氧化氢和细菌素,同时赋予发酵食品独特的风味、质地和香气。细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成的一类具有抗菌生物活性的蛋白质或多肽[2],能够抑制多种病原菌和腐败菌,而产生菌对其有自身免疫性[3-4]。细菌素多数由革兰氏阳性(Gram-positive,G+)菌产生,并且可以抑制其他亲缘关系较近的菌株,而对大多数革兰氏阴性(Gram-negative,G-)菌、真菌等均没有抑制作用,如乳酸链球菌素。由于细菌素无毒、无残留、无抗药性,可以作为一种生物防腐剂广泛应用于食品工业[1],近年来不同来源的新型细菌素受到科研工作者的广泛关注,众多新型细菌素被陆续报道,如HU等[5]从发酵肉中分离的Lactobacillus alimentarius FM-MM4细菌素对细菌及酵母菌有广谱抗菌活性;周佳[6]所研究的肠球菌素SAU-2有良好的耐热性与酸碱性,并且对G+菌有明显抑菌作用,但对G-菌和真菌基本无抑菌活性;还有ZACHAROF等[4]对乳酸菌素的研究,COTTER等[7]对细菌素免疫的研究。乳酸链球菌素(nisin)是目前已经商业化生产应用的细菌素,对G+细菌有良好的抑菌效果,但它对G-菌、酵母和霉菌无抑菌效果,在中性pH环境下稳定较低,因此仅限于酸性食品使用[8]。尽管近年来不同特性的细菌素有大量报道,但在抑菌谱、稳定性、产量、抑菌活力及适用范围等方面还存在众多缺陷,故继续开发新的细菌素资源,深入研究其特性仍十分必要。

本研究以实验室分离的干酪乳杆菌XbC-36为菌种,从其发酵液中分离纯化细菌素,并对其生长动力学、抑菌谱、相对分子质量、抑菌活性以及稳定性等方面分析,为该细菌素在天然食品防腐剂开发方面奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

本研究所用产细菌素菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)XbC-36分离自山东临沂农村自然发酵豆制品,并通过菌体菌落形态、生理生化特征及16s rDNA序列分析鉴定,保藏于徐州工程学院食品与生物工程中心。

1.1.2 试剂及培养基

试剂:柱层析填充材料Sephadex G-15,美国Pharmacia公司;胰化蛋白胨、酵母提取物,英国Oxoid公司;蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶,上海源叶生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

培养基:MRS培养基、营养琼脂(nutrient agar,NA)培养基、马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基均由实验室配制而成,各菌株所用培养基及培养温度如表1所示。

1.1.3 仪器与设备

Sigma3k15冷冻离心机,德国SIGMA公司;UV-2450紫外可见光分光光度计,日本岛津公司;DYY-6B凝胶水平电泳仪,北京市六一仪器厂;AKTAprime蛋白纯化系统,美国GE Healthcare公司;Agilent 1260半制备高效液相色谱仪、Zorbax SB-C18高效液相色谱半制备柱,美国安捷伦公司;CascadaTM AN超纯水系统,美国PALL公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌体生长动力学及细菌素合成

将活化后的菌株XbC-36按照接种量1%接种到MRS液体培养基(pH 6.5),培养温度32 ℃,培养时间48 h,每隔3 h取样测定其吸光度及抑菌活性。

通过琼脂孔扩散法测定抑菌活性,具体测定参照文献[9-11]并稍作修改。制备对应不同指示菌的琼脂培养基平板,指示菌调整到2.0×106 CFU/mL并在平板上涂布150 μL,晾干后打孔。100 μL发酵液的上清液注入孔中,最适温度下培养1~5 d,测定抑菌圈直径大小。抑菌活力单位的定义为以S. aureus为指示菌,样品经最大稀释后,打孔检测仍产生清晰抑菌圈的最大稀释倍数的倒数作为1个抑菌活力单位。

1.2.2 细菌素的纯化

BaC21的发酵制备:MRS琼脂平板活化2次的L. casei XbC-36接种于MRS液体培养基,32 ℃培养16 h后,取5 mL 菌液接种于495 mL MRS液体培养基中。在32 ℃下培养18 h,10 000 r/min、4 ℃离心10 min,取上清液并经滤膜过滤后于80 ℃加热15 min,调节pH 7.0,得到去细胞发酵上清液(cell-free fermentation supernatant,CFS),于4 ℃冰箱短时保存备用。

分子筛凝胶过滤层析:以0.02 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液充分平衡层析柱(80 cm×1.5 cm)。经(NH4)2SO4盐析、透析并超滤浓缩后的样品上样,相同缓冲液洗脱,流速0.8 mL/min。收集各洗脱峰,测抑菌活性,合并有活性收集管,超滤浓缩后备用。

半制备反向高效液相色谱(reverse-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)纯化BaC21: RP-HPLC线性梯度洗脱,1 mL/min洗脱速度,溶剂A:体积分数5%乙腈中含有体积分数0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA),溶剂B:体积分数100%乙腈中含有体积分数0.1% TFA,52 min内溶剂A从体积分数85%到体积分数30%,溶剂B从体积分数15%到体积分数70%。手动收集洗脱峰,真空浓缩器中彻底去除乙腈,抑菌活性检测,活性组分合并、冻干并进一步分析。

1.2.3 Tricine-SDS-PAGE测定BaC21分子质量

纯化的BaC21 Tricine-SDS-PAGE测定纯化程度及分子质量。电泳结束后凝胶的一部分用考马斯亮蓝染色,另一半无菌蒸馏水中洗涤3 h,置于培养皿中,LB(luria-bertani)培养基覆盖,涂布S. aureus并37 ℃培养16~18 h,与染色脱色后的蛋白凝胶比较,观察抑菌条带。

1.2.4 酶、有机溶剂、化学试剂、pH和温度对细菌素的影响

用胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、脂肪酶和α-淀粉酶做酶解实验。调节部分纯化的BaC21至酶最适pH,加入终质量浓度2 mg/mL的酶,37 ℃水浴2 h,80 ℃加热15 min灭酶,检测抑菌活性。

分别向部分纯化的BaC21中添加体积分数1%的乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈,1 g/L的Tween-80、Tween-20、Triton X-100和SDS, 37 ℃处理2 h后测定抑菌活性。

将部分纯化的BaC21的pH调至2~9,37 ℃下处理2 h,测定其抑菌活性。

将部分纯化的BaC21取5 mL分别置于37、60、80、100 ℃保温30 min,121 ℃处理15 min,待温度恢复到室温测定抑菌活性。

以上活性检测均以S. aureus为指示菌采用琼脂孔扩散法测定。空白对照均是以未经过任何处理的BaC21为样品。

1.2.5 细菌素对S. aureusE. coli的抑菌作用

S. aureusE. coli在37 ℃下培养至指数期中期(4 h),按照两指示菌100 mL培养液加入20 mL L. casei XbC-36 CFS,并继续培养,每隔2 h测定600 nm处的吸光度。对照组为未加入CFS正常培养的菌体。

1.2.6 数据统计与分析方法

数据统计分析参照陈文莹等[12]报道的方法,检测实验均重复3次,结果以平均值±标准差(SD)表示。对实验数据进行方差分析(ANOVA),采用SNK方法评价差异显著的结果进行两两比较,P<0.05认为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 干酪乳杆菌XbC-36生长及细菌素合成

L. casei XbC-36生长曲线及BaC21合成情况如图1所示,接种6 h后开始合成BaC21(126 AU/mL),在发酵6~18 h,BaC21的产量与吸光值成正比,抑菌活性显著增加(P<0.05),在稳定期初始阶段菌体浓度最大时(OD600=2.156)合成最大量BaC21(1 695 AU/mL)。而在18 h后可能由于酸性抑制、菌体分泌蛋白酶的降解等因素导致BaC21活性略有下降[13],但在36~48 h,抑菌活性变化不明显(P>0.05),而菌体吸光值基本保持不变(P>0.05)。不同来源细菌素达到最大产量的时间差异较大,如YI等[14]研究的Lactobacillus crustorum细菌素60 h最大,WORAPRAYOTE等[15]报道的Weissella hellenica发酵12 h最大,PERUMAL等[16]报道的Enterococcus faecalis细菌素发酵20 h产量最高。BaC21在指数期开始合成,随着菌体生长BaC21产量增大并在稳定期达到最高,因此BaC21属于初级代谢产物,这与MIRANDA等[17]、MARTINEZL等[18]研究的细菌素一致,但从细菌素发酵产量看L. casei XbC-36所产细菌素更占优势。

图1 L. casei XbC-36生长动力学及BaC21合成
Fig.1 Growth kinetics and bacteriocin biosynthesis of
L. casei XbC-36
注:未标注小写字母表示差异显著(P<0.05),相同小写字母表示
差异不显著(P>0.05)

2.2 细菌素的纯化

分子筛凝胶柱层析结果如图2所示,经层析得到5个明显分离的洗脱峰。抑菌活性检测显示P3蛋白质峰出现抑菌圈,收集P3峰样品进一步纯化。

RP-HPLC如图3所示,0~52 min很多不同种类的物质被洗脱出,表明经分子筛凝胶柱的样品含有较多杂质且经RP-HPLC分离明显,36 min后无洗脱峰出现,说明已经洗脱充分。手动收集11个峰的样品检测抑菌活性,保留时间19 min的洗脱产物即4号峰有抑菌活性。RP-HPLC是纯化细菌素的高效方法,据报道陈一然[19]、PIARD等[20]、方佳琪[21]也采用该方法纯化到了细菌素。

2.3 细菌素的分子质量及原位活性检测

Tricine-SDS-PAGE如图4所示,RP-HPLC得到的活性样品1.2~4.6 kDa显示1条清晰条带,说明凝胶过滤层析和RP-HPLC可以有效纯化BaC21,根据标准蛋白marker迁移率计算得到样品分子质量4.4 kDa。凝胶原位抑菌实验显示,条带对应位置产生明显的抑菌条带。由此可确定,考马斯亮蓝染色显示的电泳条带为有抑菌活性的目的产物,其分子质量在报道的绝大多数细菌素分子质量范围内。据报道,不同微生物所产细菌素分子质量通常存在差异,BaC21分子质量与KAKTCHAM等[22]研究的乳链球菌素2MT分子质量相近(4.1 kDa),但比来源于XI等[23]研究的粪肠球菌TG2(6.3 kDa)、AYED等[24]研究的芽孢杆菌(11 kDa)、GOH等[25]研究的肠球菌C1(10 kDa)的细菌素要小;比赵圣明等[26]报道的植物乳杆菌细菌素(0.9 kDa)分子质量要大。由此推测,BaC21可能是一种新型细菌素。

图2 Sephadex G-15凝胶层析及BaC21抑菌检测
Fig.2 Sephadex G-15 gel chromatography and
bacteriostatic experiments of BaC21

图3 RP-HPLC纯化L. casei XbC-36 BaC21
Fig.3 Purification of BaC21 from L. casei XbC-36 by RP-HPLC

M-标准分子质量蛋白;1-纯化后样品;2-凝胶原位抑菌检测
图4 Tricine-SDS-PAGE分析及抑菌活性检测
Fig.4 Tricine-SDS-PAGE analysis and bacteriostatic
activity detection

2.4 细菌素的抗菌谱

BaC21抑菌情况如表1所示。BaC21对G+菌有较弱的抑菌活性,而对S. aureus抑制作用非常强,但对乳酸乳球菌无抑制作用。对大部分G-菌有强的抑制活性,但对于霍乱弧菌的抑制活性相对较弱,对真菌则无抑菌活性。整体看,BaC21对G-菌具有很强的抑菌作用,对G+菌稍弱。通常,因G-菌细胞壁中缺乏脂壁酸故细菌素不能抑制G-[13],例如已经商业化的食品防腐剂nisin仅对G+菌有抗菌活性[27],董雨馨等[28]研究的瑞士乳杆菌M14-1所产细菌素只对单核细胞增生李斯特氏菌有良好的抑菌效果,BENBRAEK等[29]研究的乳糖肠球菌4CP3只对真菌和G+菌有较强的抑制,杨亚晋等[30]研究的乳酸菌素BSN4和BCN4对G-菌和真菌都无明显抑制效果。食品防腐中通常几种不同的防腐剂联合使用从而达到满意的抑菌效果。BaC21可以作为一种天然的生物防腐剂和nisin等细菌素联合使用,发挥互补抗菌效果。

表1 BaC21对各指示菌抑制作用
Table 1 The antibacterial spectrum of bacteriocin
against various indicator strains

指示菌株培养基培养温度/℃抑菌圈直径/mm革兰氏阳性菌凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)NA377±0.1蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)NA379±0.2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NA378±0.2金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)NA3720±0.2单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)NA376±0.3乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MRS30-革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NA3723±0.5大肠杆菌(Escherichia coli)NA3722±0.6肠沙门氏菌(Salmonella enterica)NA3718±0.7伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)NA3715±0.6副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)NA3721±0.4福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)NA3714±0.5霍乱弧菌(Vibrio cholerae)NA377±0.2真菌白色念珠菌(Candida albicans)PDA28-毕赤酵母(Pichia spartinae)PDA28-青霉菌(Penicillium spp.)PDA28-

注:-表示未检出

2.5 酶及物理化学处理对细菌素抗菌活性影响

酶及各物理化学因素处理结果如表2所示。在不同蛋白酶处理后,BaC21抗菌活性完全丧失,同对照相比差异显著(P<0.05),脂肪酶和α-淀粉酶处理后抑菌活性无显著变化(P>0.05)。表明菌株XbC-36所产抗菌物质具有蛋白质特性。另一类重要的天然抗菌物质是主要来源于芽孢杆菌的脂肽,因结构中存在非正常氨基酸构成的环状肽链而对各种蛋白酶不敏感。BaC21经所试酶处理后的活性表现说明其分子中不存在脂肪、淀粉链,也不存在非正常的氨基酸链,这与所报道的其他细菌素一致,故可判断菌株XbC-36所产抗菌物质同为细菌素。BaC21蛋白质性质意味着它在食品中可以作为天然防腐剂抑制食源性致病菌、腐败菌的生长,当其同食品一起被食用后可在人胃肠道中降解并作为营养素被人吸收。

细菌素从发酵液中沉淀分离、高分子吸附介质层析、疏水层析及HPLC纯化时经常用到不同有机溶剂沉淀或洗脱,有必要分析检测其有机溶剂稳定性。用丙酮、乙腈、乙醇和异丙醇等有机溶剂对BaC21处理,其抗菌活性无明显下降(P>0.05)。证实BaC21分子中不存在与抗菌活性有显著影响的易溶于有机溶剂的脂质分子[31],因此,BaC21可以应用于高脂肪食品的保鲜。

表面活性剂吐温20、吐温80、Triton 100对BaC21抗菌活性无显著影响(P>0.05);而SDS能够增强抑菌活性,推测可能是SDS改变了细胞膜的通透性,与此相似的报道还有Lysinibacillus sp. JX402121细菌素[32]Lactococcus lactis subsp. lactis 2MT细菌素nisin[22]

BaC21在pH 2~7时,稳定性最佳,抑菌活性基本无明显变化(P>0.05);在pH 9.0时,稳定性有所下降,但其抑菌活性仍保持60%以上,同对照差异显著(P<0.05)。BaC21在酸性条件下表现出更佳的稳定性,这与报道的大部分细菌素相似,如HU等[5]Lactobacillus alimentarius FM-MM4分离的细菌素MM4在pH 7.0以上稳定性大幅降低;罗怡等[33]研究的乳酸菌素在碱性条件下完全失活;WAYAH等[1]研究的Lactobacillus salivarius SPW1细菌素在pH 8.0以上稳定性变差。在强碱性条件下的不稳定性可能是因为极端的碱性pH条件下,分子间强静电作用导致多肽氨基和羧基解离,最终导致蛋白质变性抑菌活性丧失[27]

BaC21在100 ℃以下30 min内活性基本无变化(P>0.05),但当超过100 ℃之后稳定性下降,特别是在121 ℃、15 min稳定性下降明显(P<0.05),其抑菌活性保留55.2%。整体说明BaC21具有优良的热稳定性。在食品中使用时可以耐受食品加工工艺的热处理过程。

表2 细菌素BaC21稳定性分析
Table 2 Stability analysis of bacteriocin BaC21

处理相对活性/%对照100酶胰蛋白酶0α-胰凝乳蛋白酶0胃蛋白酶0蛋白酶K0脂肪酶101.2±1.5aα-淀粉酶98.6±2.3a有机溶剂丙酮101.1±1.2a乙腈92.5±2.6a乙醇96.2±3.1a异丙醇97.9±2.4a化学试剂吐温2098.7±2.4a吐温8096.6±2.5aSDS108.2±3.4aTriton-X-10096.5±2.1apH297.2±1.5a398.8±1.1a4102.2±1.3a597.4±2.21.9a698.2±2.4a7101.1±2.6a882.1±1.4962.2±1.3温度37 ℃、30 min100.5±2.0a60 ℃、30 min99.7±1.8a80 ℃、30 min101.5±1.6a100 ℃、30 min95.4±1.6a121 ℃、15 min55.2±1.3a

注:未标注小写字母表示同对照组间差异显著(P<0.05),a表示同对照组间差异不显著(P<0.05)

2.6 细菌素对S. aureusE. coli的抑菌模式

BaC21对E. coliS. aureus的抑菌情况如图5所示,在不添加BaC21情况下,两指示菌株呈现典型的细菌生长特征,2 h前为延迟期,2~8 h呈指数生长,8~24 h逐渐从指数期过渡到稳定期。而当在培养4 h加入BaC21后,两指示菌生长显示立即受到抑制,吸光度逐渐降低,培养24 h两者OD值分别为0.301及0.101。由此可知BaC21对S. aureusE. coli不仅具有明显的抑制作用同时还可使细胞裂解。

图5 BaC21对S. aureusE. coli生长的影响
Fig.5 Effect of bacteriocin on the growth of
S.aureus and E.coli
注:小写字母表示同对照组间显著差异(P<0.05)

3 结论

L. casei XbC-36发酵液中通过两步纯化即分子筛凝胶过滤层析和RP-HPLC纯化到单一组分的BaC21,其分子质量与报道的其他细菌素不同。BaC21在酸性、中性及弱碱性环境下有良好的稳定性,并可耐受100 ℃的热处理,对有机溶剂、表面活性剂耐受性好。对G+菌和G-菌都有广谱抑菌活性,特别是对G-菌如铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、副溶血性弧菌等表现出更为显著的抑菌活性。经多种蛋白酶处理后完全失活,但对脂肪酶和淀粉酶不敏感。S. aureusE. coli在培养中添加BaC21,菌体生长受到完全抑制。综上结果表明,BaC21有潜力用做天然食品防腐剂,可以和nisin等抗菌剂联合使用提高食品的质量和安全。

参考文献

[1] WAYAH S B, PHILIP K. Purification, characterization, mode of action, and enhanced production of Salivaricin mmaye1, a novel bacteriocin from Lactobacillus salivarius SPW1 of human gut origin[J].Electronic Journal of Biotechnology, 2018,35: 39-47.

[2] 匡珍, 李学英, 徐春霞, 等. 乳酸菌细菌素研究进展及其在水产养殖和加工中的应用[J].食品工业科技, 2019, 40(4): 292-298.

[3] 贾丽艳, 高娟娟, 荆旭, 等. 一株产细菌素细菌CGMCC 6624分离鉴定及其生物学特性[J].中国食品学报, 2019,19(12): 243-249.

[4] ZACHAROF M P, LOVITT R W. Bacteriocins produced by lactic acid bacteria a review article[J].APCBEE Procedia, 2012,2: 50-56.

[5] HU Y, LIU X, SHAN C, et al. Novel bacteriocin produced by Lactobacillus alimentarius FM-MM4 from a traditional Chinese fermented meat Nanx Wudl: Purification, identification and antimicrobial characteristics[J].Food Control, 2017,77: 290-297.

[6] 周佳. 肠球菌素SAU-2的纯化和特性研究[D]. 雅安:四川农业大学, 2011.

[7] COTTER P D, HILL C, ROSS R P. Bacteriocins: Developing innate immunity for food[J].Nature Reviews Microbiology, 2005, 3(10):777-788.

[8] SIDHU P K, NEHRA K. Bacteriocin-nanoconjugates as emerging compounds for enhancing antimicrobial activity of bacteriocins[J].Journal of King Saud University-Science, 2017, 31(4): 758-767.

[9] NAIR S V, BARANWAL G, CHATTERJEE M, et al. Antimicrobial activity of plumbagin, a naturally occurring naphthoquinone from Plumbago rosea, against Staphylococcus aureus and Candida albicans[J].International Journal of Medical Microbiology, 2016,306(4): 237-248.

[10] SMITHA K T, NISHA N, MAYA S, et al. Delivery of rifampicin-chitin nanoparticles into the intracellular compartment of polymorphonuclear leukocytes[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2015,74: 36-43.

[11] NITHYA S, NIMAL T R, BARANWAL G, et al. Preparation, characterization and efficacy of lysostaphin-chitosan gel against Staphylococcus aureus[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2018,110: 157-166.

[12] 陈文莹, 杨旭芹, 刘臻, 等. 烹调三种蔬菜对红酸汤中全反式番茄红素含量的影响[J].中国调味品, 2019,44(7): 1-4.

[13] AHN H, KIM J, KIM W J. Isolation and characterization of bacteriocinproducing Pediococcus acidilactici HW01 from malt and its potential to control beer spoilage lactic acid bacteria[J].Food Control, 2017,80: 59-66.

[14] YI L, DANG Y, WU J, et al. Purification and characterization of a novel bacteriocin produced by Lactobacillus crustorum MN047 isolated from koumiss from Xinjiang, China[J].Journal of Dairy Science, 2016,99(9): 7 002-7 015.

[15] WORAPRAYOTE W, PUMPUANG L, TOSUKHOWONG A, et al. Two putatively novel bacteriocins active against Gram-negative food borne pathogens produced by Weissella hellenica BCC 7293[J].Food Control, 2015,55: 176-184.

[16] PERUMAL V, VENKATESAN A. Antimicrobial, cytotoxic effect and purification of bacteriocin from vancomycin susceptible Enterococcus faecalis and its safety evaluation for probiotization[J].LWT- Food Science and Technology, 2017,78: 303-310.

[17] MIRANDA R O, CAMPOS-GALV?O M E M, NERO L A. Expression of genes associated with stress conditions by Listeria monocytogenes in interaction with nisin producer Lactococcus lactis[J].Food Research International, 2018,105: 897-904.

[18] MARTINEZ R C R, WACHSMAN M, TORRES N I, et al. Biochemical, antimicrobial and molecular characterization of a noncytotoxic bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum ST71KS[J].Food Microbiology, 2013,34(2): 376-381.

[19] 陈一然. 产抑制革兰氏阴性菌细菌素菌株的筛选鉴定及植物乳杆菌素LPC818的纯化[D]. 合肥:安徽农业大学, 2011.

[20] PIARD J C, MURIANA P M, DESMAZEAUD M J, et al. Purification and partial characterization of lacticin 481, a lanthionine-containing bacteriocin produced by Lactococcus lactis subsp. lactis CNRZ 481[J].Applied and Environmental Microbiology, 1992, 58(1):279-284.

[21] 方佳琪. 乳酸菌细菌素LLC518的分离纯化及制备[D]. 合肥:安徽农业大学, 2011.

[22] KAKTCHAM P M, FOKO K E M, TCHABOU T M L, et al. Nisin-producing Lactococcus lactis subsp. lactis 2MT isolated from freshwater Nile tilapia in Cameroon: Bacteriocin screening, characterization, and optimization in a low-cost medium[J].Lebensmittel Wissenschaft Und Technologie, 2019,107: 272-279.

[23] XI Q, WANG J, DU R, et al. Purification and characterization of bacteriocin produced by a strain of Enterococcus faecalis TG2[J].Applied Biochemistry and Biotechnology, 2018,184(4): 1 106-1 119.

[24] AYED H B, MAALEJ H, HMIDET N, et al. Isolation and biochemical characterisation of a bacteriocin-like substance produced by Bacillus amyloliquefaciens An6[J].Journal of Global Antimicrobial Resistance, 2015,3(4): 255-261.

[25] GOH H F, PHILIP K. Isolation and mode of action of bacteriocin BacC1 produced by nonpathogenic Enterococcus faecium C1[J].Journal of Dairy Science, 2015,98(8): 5 080-5 090.

[26] 赵圣明, 赵岩岩, 马汉军. 植物乳杆菌JLA-9产细菌素的分离纯化[J].食品与发酵工业, 2017,43(6): 60-65.

[27] LV X, MA H, SUN M, et al. A novel bacteriocin DY4-2 produced by Lactobacillus plantarum from cutlassfish and its application as bio-preservative for the control of Pseudomonas fluorescens in fresh turbot (Scophthalmus maximus) fillets[J].Food Control, 2018,89: 22-31.

[28] 董雨馨, 谢远红, 张策, 等. 瑞士乳杆菌M14-1所产细菌素的分离纯化及抑菌特性分析[J].天然产物研究与开发, 2018,30(8): 1 437-1 443.

[29] BEN BRAÏEK O, CREMONESI P, MORANDI S, et al. Safety characterisation and inhibition of fungi and bacteria by a novel multiple enterocin-producing Enterococcus lactis 4CP3 strain[J].Microbial Pathogenesis, 2018,118: 32-38.

[30] 杨亚晋, 张日俊, 赵丽, 等. 两种高效抑菌乳酸菌素BSN4和BCN4的特性研究[J].微生物学杂志, 2017, 37(5): 65-70.

[31] YILDIRIM Z, BILGIN H, ISLEROGLU H, et al. Enterocin HZ produced by a wild Enterococcus faecium strain isolated from a traditional, starter-free pickled cheese[J].Journal of Dairy Research, 2014,81(2): 164-172.

[32] AHMAD V, AHMAD K, BAIG M H, et al. Efficacy of a novel bacteriocin isolated from Lysinibacillus sp. against Bacillus pumilus[J].Lebensmittel Wissenschaft Und Technologie, 2019, 102: 260-267.

[33] 罗怡, 张瀛, 刘颖, 等. 华贵栉孔扇贝肠道产细菌素乳酸菌的分离筛选[J].食品科技, 2019,44(2): 27-32;39.

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023940

引用格式:高兆建,曹珊珊,宋玉林,等.干酪乳杆菌细菌素的分离纯化及抑菌特性分析[J].食品与发酵工业,2020,46(18):91-97.GAO Zhaojian,CAO Shanshan,SONG Yulin, et al. Purification of bacteriocin from Lactobacillus casei and analysis of antibacterial characteristics[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(18):91-97.

第一作者:博士,副教授(本文通讯作者,E-mail:gaozhaojian@126.com)

基金项目:江苏省苏北科技计划项目(XZ-SZ201819;BC2013417;BN2015021);徐州市科技计划项目(KC17083)

收稿日期:2020-03-12,改回日期:2020-04-24