一株海洋来源高效产角蛋白酶菌株的筛选、鉴定及其酶学性质研究

张妮1,张红岩1,杨梦莹1,刘聪2,杨立芳2,申乃坤1*,姜明国1

1(广西民族大学 海洋与生物技术学院,广西多糖材料与改性重点实验室,广西高校微生物与植物资源利用重点实验室,广西 南宁, 530006)2(广西民族大学 化学化工学院,广西林产化学与工程重点实验室,广西 南宁, 530006)

摘 要 为获得高效产角蛋白酶的菌株,提高产酶能力,研究角蛋白酶酶学性质,该文从广西北部湾海鸭养殖羽毛废弃物土壤通过富集、初筛和复筛获得1株高效降解羽毛角蛋白的菌株Gxun-30,综合形态、生理生化和16S rDNA 序列的系统进化分析结构,鉴定为拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus paramycoides)。该菌株产酶条件及所产酶学性质研究结果为,菌株产酶最适温度35 ℃,发酵48 h,整根羽毛几乎完全降解,酶活性可达434.54 U/mL;所产角蛋白酶最适温度为75 ℃,最适pH为6.5;该酶热稳定性较好,在70 ℃以下,能保持酶活的稳定性;金属离子中Ca2+、Na+对该酶活性起到激活作用,而Mn2+、Cu2+对该酶有显著抑制作用;酶活性可被苯甲基磺酰氟(phenyl methy sulfonyl fluoride,PMSF)和乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)抑制,表明可能为含金属离子的丝氨酸蛋白酶类;异丙醇对酶活性有明显激活作用,相对酶活性可提高至114%;且在十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、吐温-40溶液中具有良好的稳定性;该酶降解羽毛、角蛋白及酪蛋白的能力较强,但对人发及胶原蛋白降解能力较弱,该特性使B. paramycoides Gxun-30菌株及所产角蛋白酶在羽毛降解、酪蛋白肽及医用胶原材料制备等方面具有潜在应用价值。

关键词 海洋菌株;羽毛降解;分离鉴定;角蛋白酶;酶学性质

Isolation and identification of a highly efficient keratinase producing strain from marine environment and its enzymatic properties

ZHANG Ni1,ZHANG Hongyan1,YANG Mengying1, LIU Cong2,YANG Lifang2,SHEN Naikun1*,JIANG Mingguo1

1(Guangxi Key Laboratory for Polysaccharide Materials and Modifications, Guangxi Key Laboratory of Microbial plant Resources and Utilization, School of Marine Sciences and Biotechnology, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China)2(Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products, School of Chemistry and Chemical En-gineering, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006)

ABSTRACT This study aimed to obtain a highly efficient keratinase producing strain, improve its enzyme-producing ability and study the properties of keratinase. A strain Gxun-30 of highly efficient degradation ability for feather keratin was isolated from the soil of feather waste in the duck breeding base in Beibu gulf by enrichment, primary screening and re-screening process.It was identified as Bacillus paramycoides, according to its morphology, physiological and biochemical characteristics, and 16S rDNA sequence alignment and phylogenetic trees analysis. The keratinase producing conditions and enzymatic properties were studied.The results showed that its optimum fermentation temperature was 35°C.After fermenting at 35°C for 48 h, the feather was almost completely degraded and the keratinase activity reached 434.54 U/mL. The keratinase had maximum activity at 75°C and optimum pH at 7.5.Ca2+ and Na+ could greatly enhance the activity of keratinase, but its activity was strongly inhibited by Mn2+ and Cu2+. And it was inhibited by phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF) and ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA), indicating that it is a metallo-serine keratinase. The enzyme could remain stable in the presence of surfactants, including sodium dodecyl sulfate (SDS), isopropyl alcohol and Tween 40. Especially, isopropyl alcohol could substantially enhance the activity to 114%. The substrate specificity results showed that this keratinase exhibited high activity towards casein, keratin and feather, but only little degradation on hair and type I collagen. The results indicated that B. paramycoides Gxun-30 and its protease was of potential application for feather degradation, casein peptide and collagen material preparation.

Key words marine bacterium; feather-degrading; isolation and identification; keratinase; characteristics of proteinases

近年来,随着我国家禽养殖产业迅猛发展,羽毛产量也逐年递增,超过100万t/年,大部分却并未得到利用,通常被填埋或焚烧[1]。不仅造成资源的巨大浪费,而且严重污染环境,甚至传播鸡新城疫、气囊炎和角膜结膜炎等疾病[2]。此外,焚烧还会释放氨、恶臭硫化氢等有害气体,引起头痛、恶心、腹泻等健康问题[3]。羽毛中粗蛋白含量可达85%以上,且氨基酸组成比较齐全,特别是半胱氨酸是常见天然饲料中含量最高的[4-5]。但羽毛以角蛋白为主,是一类富含二硫键、结构稳定的“不溶于水的硬性蛋白”,动物消化率极低,需要处理后才能应用。目前,常采用高温高压、强酸强碱和挤压膨化等物理或化学方法进行处理,不仅工艺复杂、耗能多、污染环境,而且处理过程中会破坏氨基酸,造成营养流失[6]。利用微生物降解废弃羽毛,不仅过程温和、效果显著,且对氨基酸破坏较小,可高效生产稀有氨基酸、肽等产品,应用于饲料、肥料、医药等行业[7-9],不仅利用废弃蛋白资源,促进羽毛的深加工发展,对环境保护也具有积极意义。

目前已筛选出真菌、放线菌、细菌等30多种可降解羽毛的微生物[4, 10]。但大多数真菌为皮肤类真菌,具有致病性,应用价值较低[11];放线菌降解羽毛能力较强,但生长缓慢,多用于固体发酵及有关蛋白酶机制研究[12]。可降解羽毛细菌多为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)[13]、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)[14]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[15]、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)[16]、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)[17]等芽孢杆菌类及耐热杆菌类[18]等,具有生长快、产酶活性较高、工业应用安全等优点,近年来日渐受到关注,成为研究的热点之一。但选育出的菌株存在降解效果不强、稳定性较差等问题,大都满足不了工业化生产的要求。因此,迫切需要筛选降解效果好、抗逆性强、性能稳定的优良菌株。

目前从陆地环境挖掘新的微生物资源愈来愈困难,而海洋微生物资源是陆地的10倍,但开发程度远低于陆地,具有非常大的开发潜力。此外,海洋微生物适应了高盐、高压、低温、缺氧等环境特点,往往活性更高、抗逆性更强。本研究取样广西北部湾海鸭羽毛堆积处土壤,通过富集培养、初筛和复筛分离出1株高效降解羽毛角蛋白的菌株,并对菌体形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列的系统进化分析,鉴定为拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus paramycoides),并对菌株所产角蛋白酶的酶学性质进行研究,为废弃羽毛资源化利用提供新备选菌株和角蛋白酶来源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 土壤样品

土壤样品来自广西北海养海鸭场内废弃羽毛堆积处土样,低温保存带回实验室处理。

1.1.2 羽毛

家禽市场收集的鸡、鸭羽毛,用水洗净,烘干至衡重备用。

1.1.3 试剂

酵母抽提物、蛋白胨,OXOID(英国);琼脂粉,西班牙进口分装;DNA 抽提、PCR 扩增及胶回收试剂盒等分子试剂,天根(北京)生物技术有限公司;干酪素、福林酚、三氯乙酸等(均为国产分析纯),生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.4 仪器与设备

紫外可见光分光光度计,上海精科学仪器有限公司;CX31型显微镜,奥林巴斯;BIOFUGE STRATOS高速冷冻离心机,美国Themo;MQD-S3R三层小容量振荡培养箱,上海旻泉仪器有限公司;GR85高压蒸汽灭菌器,美国ZEALWAY;ABI2720型PCR扩增仪,美国ABI。

1.1.5 培养基

富集培养基(g/L):酵母粉5,NaCl 2,K2HPO4 1,MgSO4 0.1,羽毛5,pH 7.0。

初筛培养基(g/L):酪蛋白30,K2HPO4 1.4,KH2PO4 0.7,NaCl 5,MgSO4 0.1,琼脂20,pH 7.0。

种子培养基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 5,pH 7.2。

发酵培养基(g/L):羽毛15,K2HPO4 1.4,KH2PO4 0.7,NaCl 5,MgSO4 0.1,pH 7.0。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株富集

取10 g土样加入90 mL的无菌水中,混匀后取上清液至富集培养基中振荡培养48 h。

1.2.2 菌株初筛

无菌水梯度稀释富集样品后涂布于筛选平板,置于30 ℃恒温培养48 h,挑选水圈较大而明显的单菌落,纯化后接种斜面培养基保存备用。

1.2.3 菌株复筛

挑取初筛单菌落至种子培养基,30 ℃,200 r/min培养15 h,按照1%(体积分数)的量接种至羽毛发酵培养基,发酵48 h后,取上清液测定角蛋白酶的酶活性,选取酶活性较高的菌株进行下一步研究。

1.2.4 菌种鉴定方法

(1)菌株形态学及生理生化特性

产酶菌株的形态观察、革兰氏染色及生理生化实验参考细菌系统鉴定手册[19]

(2)产角蛋白酶菌株的分子鉴定

提取菌株基因组后,采用16S rDNA基因的通用引物27F和1492R进行PCR扩增,PCR产物测序结果提交至GenBank进行相似性比较,利用生物学软件MEGA 7.0构建系统进化树(Neighbor-Joining)[9]

1.2.5 角蛋白酶活性测定

(1)粗酶液的制备

羽毛发酵液离心经12 000 r/min、10 min离心后,取上清液,即为粗酶液,置于4 ℃保存备用。

(2)角蛋白酶活性测定

酶活性测定:参照文献[4, 20-21]的方法进行,略有改动。取上述适当稀释后粗酶液200 μL,置于50 ℃水浴中预热2 min,再加入经同样预热的300 μL 质量浓度为20 g/L酪蛋白溶液(pH 7.5)混匀,50 ℃水浴反应10 min,立即加入4 mol/L TCA溶液500 μL终止反应,离心取上清液200 μL,依次加入1 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液和200 μL福林酚,50 ℃反应10 min。对照为先用三氯乙酸对酶灭活的酶液。反应结束后于波长660 nm处检测吸光值。1个酶活性单位的定义为:50 ℃反应温度下,1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需要的酶量。每个实验重复3次,结果取平均值。

1.2.6 发酵温度对菌株产角蛋白酶的影响

发酵培养基接种后置于不同温度(30、32.5、35、37.5、40 ℃)的摇床培养48 h,然后测定不同温度下角蛋白酶活性,确定菌株的最适产酶温度。

1.2.7 酶学性质

(1)温度对角蛋白酶活性的影响

将反应温度设为10、20、30、40、50、60、70、80、90 ℃,考察不同温度对角蛋白酶活性的影响,确定酶活性的最适反应温度。

(2)pH值对角蛋白酶活性的影响

在最适酶活性温度下,配制pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的Tris-HCl缓冲液,检测pH值对角蛋白酶活性的影响,确定酶活性的最适反应pH值。

(3)角蛋白酶的热稳定性[22]

将粗酶液分别置于不同的温度(4、25、37、50、70、90 ℃)下保温不同时间(15、30、60、90、120 min)后,测定残余酶活性。未经初始酶液为对照组,活性设为100%。不同温度及保温时间下所测得的酶活性与其相比,并计算相对酶活性,并绘制酶的热稳定性曲线,考察不同温度及保温时间对酶活性的影响。

(4)金属离子对角蛋白酶活性的影响

在酶活性测定反应体系中分别添加不同浓度的(0.5、5.0、50.0、500.0 mmol/L)不同金属离子(Ca2+、Mg2+、Na+、Mn2+、K+、Cu2+、Co2+),室温下放置60 min后测定残余酶活性。以未添加金属离子反应管为对照,酶活性设为100%。添加不同浓度金属离子所测得的酶活性与其相比,并计算出相对酶活性,考察不同浓度金属离子对酶活性影响。

(5)蛋白酶抑制剂和表面活性剂等化学试剂对角蛋白酶活力的影响[23]

向酶液中分别加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phenyl methyl sulfonyl fluoride,PMSF)(5 mmol/L)、乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraceticaid,EDTA)(5 mmol/L),还原剂β-巯基乙醇(5 mmol/L),表面活性剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)(1%,体积分数)、吐温-40(1%,体积分数),有机溶剂二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(1%,体积分数),常温下保持60 min,测定残余酶活性。以去离子水代替化学试剂反应管为对照,酶活性设为100%。添加化学试剂所测得的酶活性与其相比,并计算出相对酶活性,考察不同化学试剂对酶活性的影响。

(6)角蛋白酶底物特异性

使用不同的蛋白底物包括I型胶原蛋白、羽毛、人发、可溶性角蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白作为底物,不溶性底物做粉碎处理,测定不同底物的酶活性大小,考察角蛋白酶对不同底物降解的特异性。

2 结果与分析

2.1 高效降解羽毛菌株的分离

根据水解圈直径及径圈比值(R1/R2)的大小,初筛获得13株效果较好菌株,进一步进行羽毛发酵复筛,并进行酶活性测定,复筛共筛选获得5株降解羽毛较好菌株,酶活性大小及透明圈结果如表1、图1所示。

由表1可知,30号菌株羽毛降解效果最好、生长速度较快,且酶活性最高,可达186.38 U/mL。但30号菌株的透明圈及径圈比并不是最大,这说明平板初筛的结果还有一定的局限性。因此,选用30号菌株作为后续研究菌株,命名为Gxun-30。

表1 五株菌株复筛结果
Table 1 Screening results of 5 strains

菌株16S rDNA 分类羽毛降解效果生长速度角蛋白酶活性/(U·mL-1)2号鞘氨醇杆菌 ++++较慢148.46±0.96b11号类短短芽孢杆菌++++较快138.33±0.87c 20号短短芽孢杆菌 ++++快 152.37±1.05b21号产吲哚金黄杆菌++++较慢96.42±0.46d30号拟蕈状芽孢杆菌+++++较快186.38±1.34a

注:+表示羽毛降解效果,+++++表示羽毛完全降解;不同小写字母代表差异显著性,P<0.05

图1 不同菌落产生的水解圈
Fig.1 The hydrolysate circle produced by different colony

2.2 菌种鉴定

2.2.1 形态学、生理生化特征

菌株Gxun-30在酪蛋白平板上30 ℃培养48 h后,菌落呈白色不透明,边缘呈锯齿状,不易挑取。革兰氏染色为阳性,菌体呈球杆状,长度为1~2 μm,室温放置4 d后可观察到大量游离芽孢(图2)。菌株生理生化结果为:V-P实验为阳性;甲基红试验呈弱阳性;硝酸盐还原作用呈阳性;亚硝酸盐还原作用呈阳性;脲酶、吲哚试验均为阴性;能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇等碳源,但不产气;能水解酪蛋白、淀粉、明胶,但不能利用山梨醇、纤维二糖、半乳糖;反硝化作用呈阴性。由形态观察及生理生化特征结果可以初步确定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。

a-菌落形态;b-革兰氏染色(100×)
图2 Gxun-30菌株的菌落形态及革兰氏染色
Fig.2 Colony morphology and gram stain of strain Gxun-30

2.2.2 16S rDNA 基因序列及系统发育分析

对该菌的16S rDNA序列进行测序,所获得的序列长度为1 457 bp,使用美国国立生物技术信息中心的BLAST进行16S rDNA的相似性比对,发现Gxun-30与拟蕈状芽孢杆菌属的16S rDNA基因序列自然聚类,相似度为99.25%,与12条相似性较高的序列构建系统发育树如图3所示,Gxun-30与Bacillus paramycodeds NH24A2(MAOI0I000012)菌株聚为一群,表明Gxun-30与B. paramycodeds的菌株亲缘关系最近。

图3 Gxun-30菌株基于16S rDNA序列的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of strain Gxun-30 based on
16S rDNA sequence

根据Gxun-30的形态学及生理生化特征,结合16S rDNA基因序列及系统发育树结果,将Gxun-30命名为拟蕈状芽孢杆菌Gxun-30(B. paramycoides Gxun-30),现保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC 60687。

2.3 发酵培养条件对产酶活性的影响

2.3.1 酪氨酸标准曲线

根据制作标准曲线的方法,得出酪氨酸标准曲线线性回归方程为y=205.23x-9.097 4,线性相关系数R2=0.999 6,表明线性关系较好,可用来计算角蛋白酶活性。

2.3.2 温度对菌株产角蛋白酶活性的影响

发酵温度是微生物生长代谢的重要因素之一。由图4可知,发酵温度对菌株Gxun-30产角蛋白酶影响大,当发酵温度低于35 ℃时,所产角蛋白酶随发酵温度升高而增加;温度为35 ℃时,角蛋白酶活性达到最高386.78 U/mL,发酵48 h几乎可将整根羽毛完全降解(图5);温度为37.5 ℃时酶活性略有下降,但与最高值没有显著差异(P>0.05);但当温度为40 ℃时,酶活性下降迅速,且差异显著(P<0.05)。这与多数文献报道芽孢类菌株产酶的最适温度相类似[2,4,16]。故拟蕈状芽孢杆菌Gxun-30最适发酵温度为35~37.5 ℃。

图4 发酵温度对拟蕈状芽孢杆菌Gxun-30产角蛋白酶
活性的影响
Fig.4 The effect of fermentation temperature on keratinase
production of B. paramycoides Gxun-30

a-接种0 h;b-接种24 h;c-接种48 h
图5 拟蕈状芽孢杆菌Gxun-30 35 ℃培养条件下摇瓶
发酵对羽毛的降解效果
Fig.5 Degradation of feathers by B. paramycoides of
flask culture at 35 ℃

2.4 拟蕈状芽孢杆菌Gxun-30所产角蛋白粗酶液的酶学性质

2.4.1 温度对酶活性的影响

按照1.2.6所述试验方法,在不同温度下测定角蛋白酶活性,以反应温度为横坐标,酶活性为纵坐标的温度-酶活关系曲线如图6所示。反应温度为10 ℃时,角蛋白酶仍具有活性,但活性较低,仅为25.36 U/mL,这说明低温能抑制酶的活性,但不能使酶活性失活[22];当温度低于70 ℃时,酶活性随着温度升高逐渐增加,且70 ℃时,酶活性达到最大值434.54 U/mL;但当高于70 ℃时,酶活性随温度升高反而迅速降低。这表明该角蛋白酶的最适反应温度为70 ℃,高于报道的一些其他角蛋白酶最适温度,如B. amyloliquefaciens 50 ℃[17]B.subtilis 55 ℃[15]B.licheniformis 60 ℃[13]

图6 温度对拟蕈状芽孢杆菌Gxun-30角蛋白酶
活性的影响
Fig.6 Effect of temperature on the activity of
B. paramycoides Gxun-30 keratinase

2.4.2 pH对酶活性的影响

由图7可知,当反应体系pH值低于7.5时,酶活性随pH增加而增加,pH为7.5时,酶活性最大为469.68 U/mL;当pH值高于7.5时,酶活性随pH增加而降低,过高或过低的pH值环境影响了酶与底物的结合,或破坏了蛋白酶的结构和稳定性[8]。因此,该酶反应最适pH值为7.5,这与文献报道芽孢杆菌类角蛋白酶如 B. cereus(pH 8.0)[15]B. subtilus(pH 7.5)[16]B. amyloliquefaciens (pH 8.0) [17] 最适pH为碱性是一致的。

图7 pH对拟蕈状芽孢杆菌Gxun-30角蛋白酶活性的影响
Fig.7 Effects of pH on the keratinase activity of
B. paramycoides Gxun-30

2.4.3 角蛋白酶的热稳定性

如图8所示,当处理温度低于70 ℃时,对酶活性破坏较弱,70 ℃处理60 min,酶活性丧失<50%,高于一些常见角蛋白65 ℃处理30 min酶活性丧失70%以上的报道[4, 17];但90 ℃条件下处理30 min,酶活性丧失达80%。这可能是因为维持蛋白质高级结构的化学键被高温破坏,进而起催化作用的活性中心遭到破坏[24]。因此,拟蕈状芽孢杆菌Gxun-30所产角蛋白酶在70 ℃以下具较好热稳定性,属于耐热性蛋白酶类。可广泛应用于羽毛等角蛋白废弃物处理的高温环境中,减少酶量投入,降低生产成本。

图8 拟蕈状芽孢杆菌Gxun-30角蛋白酶的热稳定性
Fig.8 Thermostability of B. paramycoides Gxun-30 keratinase

2.4.4 金属离子对酶活性的影响

由图9可知,当金属离子浓度为0.5 mmol/L时,Cu2+和Mn2+对角蛋白酶有较强的抑制效果,而Ca2+和Na+有一定的激活作用,其他金属离子对酶活性影响较小;当浓度为5 mmol/L时,Ca2+和Na+对酶活性有明显激活作用,相对酶活性分别达到178%和147%,可能是由于Ca2+或Na+与酶分子氨基酸侧链的氧原子形成稳定的键作用力,酶活性区域的构象结构稳定性增强,或者增加“角蛋白酶-底物”复合体的稳定性进而促进酶的活性[25],具体激活机制有待进一步研究;而Cu2+和Mn2+的残余酶活性分别仅有9.62%和22.89%;当金属离子浓度为50 mmol/L时,Cu2+和Mn2+使酶的活性几乎完全丧失,Co2+对酶活性抑制超过80%,可能是由于Cu2+、Mn2+或Co2+进入细胞后与酶氨基酸分子—SH结合,而酶分子失活或变性,从而影响酶的活性[26];不同浓度K+和Mg2+对角蛋白酶活性影响均较小。

2.4.4 不同化学试剂对酶活性的影响

化学物质对酶活性影响结果如图10所示,蛋白质抑制剂PMSF完全抑制酶活性,说明该角蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类;EDTA可显著抑制酶的活性,这说明酶的活性中心可能含有Ca2+或Na+[27],与之前Ca2+、Na+促进酶活性结果相吻合;该酶在SDS、吐温-40和异丙醇存在下具有良好的稳定性,尤其异丙醇对酶活性有促进作用,可使酶活性提高至114%。

a-金属离子Ca2+、Na+、Mg2+、K+;b-金属离子CO+2、Cu2+、Mn2+
图9 金属离子对拟蕈状芽孢杆菌Gxun-30角蛋白酶
活性的影响
Fig.9 Effects of metal ions on the keratinase activity of
B. paramycoides Gxun-30

图10 化学物质对拟蕈状芽孢杆菌Gxun-30角蛋白酶活性
的影响
Fig.10 Effect of chemicals on activity of B. paramycoides
Gxun-30 keratinase

2.4.5 角蛋白酶的底物特异性

底物特异性是酶的重要特性之一。该角蛋白酶对不同底物的降解特异性较强(图11),对酪蛋白、角蛋白和羽毛的降解作用最为明显;而对I型胶原蛋白和人发几乎无降解作用;对牛血清蛋白的降解也较差。这与许多研究如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌所产角蛋白酶能够特异性降解胶原和弹性蛋白的报道不同[28]。由于不存在胶原蛋白活性,该角蛋白酶不会造成胶原蛋白的损失,或开发成不伤手的洗涤剂[26],具有良好的工业应用价值。

图11 拟蕈状芽孢杆菌Gxun-30角蛋白酶的底物特异性
Fig.11 Substrate specificity of B. paramycoides
Gxun-30 keratinase

3 结论

本研究从广西北海海边养鸭场内废弃羽毛堆积处采取土壤,经过富集、初筛和复筛过程,得到5株具有高效降解羽毛角蛋白的细菌,其中,降解效果最优的30号菌株角蛋白酶活性可达到434.54 U/mL,发酵48 h后,整根羽毛几乎完全降解。经过形态学、生理生化特性和16S rDNA序列比对结果分析,鉴定为拟蕈状芽孢杆菌,命名为B. paramycoides Gxun-30。该菌株耐高温性较好,菌株最适产酶温度为35 ℃,酶活性可达434.54 U/mL;在40 ℃发酵条件下仍能产酶。所产角蛋白酶最适温度为75 ℃,最适反应pH为6.5。该酶在70 ℃以下能保持良好的热稳定性。金属离子对酶活性研究结果表明,Ca2+、Na+有促进作用,而Mn2+、Cu2+有显著抑制作用。蛋白抑制剂PMSF可完全抑制酶活性,因此该角蛋白酶为丝氨酸蛋白酶类,EDTA可显著抑制酶的活性,因此活性中心可能含有金属离子;异丙醇对酶活性有促进作用,可提高至114%;该酶在常见表面活性剂SDS、吐温-40溶液中具有良好的稳定性。底物特异性分析表明,该对酪蛋白、角蛋白及羽毛有良好降解能力,而对人发、I型胶原及牛血清蛋白降解较差。以上结果表明,B. paramycoides Gxun-30菌株及其产生的角蛋白酶的作用温度和pH宽泛、稳定性好,具有良好的开发价值和应用前景。本研究可为废弃羽毛降解及角蛋白酶发酵工业提供新型菌种和蛋白酶资源。

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DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023702

引用格式:张妮,张红岩,杨梦莹,等.一株海洋来源高效产角蛋白酶菌株的筛选、鉴定及其酶学性质研究[J].食品与发酵工业,2020,46(18):98-104.ZHANG Ni,ZHANG Hongyan,YANG Mengying, et al. Isolation and identification of a highly efficient keratinase producing strain from marine environment and its enzymatic properties[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(18):98-104.

第一作者:张妮(本科生)和张红岩(高级工程师)为共同第一作者(申乃坤教授通讯作者,E-mail:shennaik05@126.com)

基金项目:国家自然科学基金(31660022;31660005);广西科技重点研发计划(AA18242026);广西自然科学基金(2018GXNSFAA28113;2019GXNSFAA185003);广西科技基地与人才专项(2017AD19029;AD18281066);广西民族大学相思湖青年学者创新团队(2017-6);广西民族大学科学研究项目(2018KJQD17)

收稿日期:2020-02-21,改回日期:2020-04-14