海棠(Malus spp.)为蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)落叶小乔木或灌木，主要分布于北温带，横跨欧亚大陆及北美洲[1]。18 世纪海棠由中国等东亚国家传入欧美，经200 多年的育种积累，培育了大量优秀的观赏品种[2]。目前国内外对于海棠的研究主要侧重于观赏性状，包含花、叶、果的形态和色彩等方面[3]，然而海棠也是营养丰富的可用作食品原料和的重要资源。海棠叶茶是以海棠叶为主要原料加工而成的茶叶，在民间有将湖北海棠(M. hupehensis)、山荆子(M. baccata)叶片做茶饮的历史。研究表明，苹果属植物的叶片中不含咖啡因，且无毒性并富含多酚、黄酮、氨基酸等多种营养物质[4],特别是叶片中的二氢查尔酮类化合物，具有缓解酒精造成胃损伤、降血糖和抗氧化的功效[5]。由于植物化学物质对动物生长和代谢具有不同生物活性，其保健作用受到广泛关注。将海棠叶用作茶饮可有效利用其活性成分。
茶叶中游离氨基酸的含量和比例与茶汤滋味和香气密切相关[6]。根据其呈味特性可分为甜味、苦味、鲜味和无味4类[7]。游离氨基酸可被人体直接吸收，其含量和成分能反映食品的营养价值，且具有调节生物体生长发育和组织修复更新的作用[8]。目前国内外关于各类型茶叶游离氨基酸的组成、呈味特点、营养价值等方面已有较多研究。HORANNI等[9]的研究发现，γ-氨基丁酸、天冬氨酸、天冬酰胺和茶氨酸的含量可作为区分不同类型茶叶的标准，并比较了茶叶浸泡时间与游离氨基酸的提取效率之间的关系。Y
LMAZ等[10]的研究表明，游离氨基酸总量在茶叶萎凋时上升，干燥时下降。然而，目前关于海棠叶茶游离氨基酸组分和营养品质的研究尚未见报道，因此有必要对其进行探究。
本研究选择在相同条件下栽植的15个海棠品种叶片作为制茶原料，通过分析茶叶中游离氨基酸的组分和差异对游离氨基酸品质指标进行比较和综合评价，旨在为海棠品种的叶片资源利用、茶叶生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 样品来源
海棠叶来源于江苏省扬州市江都区仙女镇海棠种质资源圃。在春季选择生长健康，树龄相同，每个品种株数大于100的海棠苗进行采摘，将采摘的嫩芽按照绿茶的工艺制作，制作工艺：摊放6 h→150 ℃杀青10 min→揉捻5 min→90 ℃干燥10 min。每个品种的叶茶加工工艺一致。供试海棠品种及编号如表1所示。
表1 供试海棠品种名称
Table 1 Crabapple cultivars studied in the test
编号名称拉丁名编号名称拉丁名编号名称拉丁名1紫王子M. ‘Purple prince’6黛玉M. ‘Black Jade’11平邑甜茶M. hupenensis Rhed2露易莎M.‘Louisa’7高原红M. ‘Prairifire’12粉冠M. ‘Pink Spires’3完美紫M. ‘Perfect Purple’8丰盛M. ‘Profussion’13黄金甲M.‘Fairytail Gold’4硕红M. ‘Red Great’9时光秀M. ‘Showtime’14皇家雨点M. ‘Royal Raindrop’5鲁道夫M. ‘Roudph’10灰姑娘M. ‘Cinderella’15当娜M. ‘Donald Wyman’
1.2 仪器与试剂
S443D型全自动氨基酸分析仪(配有阳离子分析柱LCA K06/Na)，德国Sykam公司；FD5型冷冻干燥仪，美国SIM公司；Milli-Q超纯水一体机，美国Millipore公司；氨基酸标准溶液、稀释缓冲液(12 g/L柠檬酸，pH 2.20的柠檬酸钠缓冲液)，德国Sykam公司。
1.3 方法
1.3.1 游离氨基酸的测定
依据GB/T 30987—2014《植物中游离氨基酸的测定》[11]的方法并稍作改动。称取磨碎样品2 g左右(精确到0.001 g)，加人烧杯中用50 mL煮沸的水冲泡，95 ℃水浴加热振荡，提取10 min后取出，利用布氏漏斗和滤纸趁热抽滤，将滤液进行真空冷冻干燥。干燥后加入适当体积的稀释缓冲液溶解，过0.22 μm滤膜，采用全自动氨基酸分析仪，对17种游离氨基酸进行上机检测。分析条件如下：色谱柱LCA K06/Na；流动相A(0.012%柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 3.45)，B(0.02%柠檬酸-柠檬酸钠，pH 10.85)；温度58～74 ℃梯度控温；流速洗脱泵0.45 mL/min+衍生泵0.25 mL/min；压力：3～4 MPa；紫外检测波长为570和440 nm。
1.3.2 氨基酸营养评价
采用1973年FAO/WHO提出的氨基酸评分(amino acid score，AAS)和必需氨基酸指数(essential amino acid index，EAAI)，并根据FAO/WHO参考模式计算得出,如公式(1)(2)所示。FAO/WHO成人参考模式为必需氨基酸占总氨基酸的比例，依次为Phe+Tyr：3.8，Met+Cys：2.7，Lys：4.5，Thr：2.3，Leu：5.9，Val：3.9，Ile：3.0，His：1.5[12]。计算公式如下：
(1)
(2)
式中:a,某一必需氨基酸的含量;p,待测氨基酸;s,参考评分模式氨基酸;n,参与比较的必需氨基酸的个数。
1.3.3 TAV的计算
味道活性值(taste active value，TAV)定义为滋味物质的浓度与该物质的呈味阈值的比值，TAV与其滋味贡献呈正相关，当TAV>1 时，表示该物质对整体风味有贡献，TAV<1时则贡献较小[13]。
1.4 数据处理与分析
试验数据采用Excel和Origin 2018进行统计和作图，采用SPSS 22对组间显著性进行单因素方差分析,P<0.05差异显著，有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 游离氨基酸定量分析
根据表2可知，15个品种海棠叶茶均含有17种游离氨基酸，包含天冬氨酸(Asp)，苏氨酸(Thr)， 丝氨酸(Ser)， 谷氨酸(Glu)，脯氨酸(Pro)，甘氨酸(Gly)，丙氨酸(Ala)，半胱氨酸(Cys)，缬氨酸(Val)，蛋氨酸(Met)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)， 酪氨酸(Tyr)，苯丙氨酸(Phe)，组氨酸(His)， 赖氨酸(Lys)， 精氨酸(Arg)。从氨基酸组分上来看，Ser的含量显著高于其他氨基酸，含量在191.2～1 419.93 mg/100 g。游离氨基酸的总量在655.12～3 059.69 mg/100 g，‘时光秀’的总氨基酸含量最高，‘灰姑娘’的最低。不同海棠品种叶茶中氨基酸组成存在显著差异(P<0.05)。
相对于植物，人类和动物均需要通过食物蛋白来摄取某些氨基酸，这些人体中无法合成的氨基酸称为必需氨基酸(essential amino acids，EAA)，包括Thr、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、His和Lys[13]。15个品种中EAA占氨基酸总量的8.49%～37.53%，平均值为26.05%。其中‘紫王子’中的EAA含量最低，而‘灰姑娘’和‘黄金甲’的含量最高，分别达到了37.53%和37.41%，接近FAO/WHO提出40%的营养标准，且种类齐全、比例适宜、与人体需要的必需氨基酸结构相符合，易于吸收完全，营养价值较高[12]。
自然界中氨基酸有20多种，其中Glu、Asp、Arg、Gly、The、Tyr、Met、Leu、Lys等9 种氨基酸在植物中含量较少，有些氨基酸人体不能合成，但又是维持机体氮平衡所必需的，称为药用氨基酸[14]。其中，Asp有缓解疲劳，预防心脏病、高血压等疾病的功能[15]。Lys对提高智力、促进生长以及钙吸收有重要作用，但在植物中含量较少[13]。Arg可通过调节体内激素分泌，有助于治疗矮小症、糖尿病，改善性欲[15]。Glu是一种重要的功能性氨基酸，具有调节神经中枢及大脑皮质功能[17]、参与蛋白质的合成、增强肠道屏障功能和抗氧化能力的作用[16]。如表2所示，Glu、Asp和Arg是含量较高的药用氨基酸，平均含量分别达到了17.67%、9.4%和9.16%，药用氨基酸含量占氨基酸总量的25.87%～58.14%，含量在50%以上的品种有‘黛玉’、‘平邑甜茶’、‘粉冠’、‘皇家雨点’。药用氨基酸含量与报道中其他茶类，如枇杷花茶(59.94%)[18]、武夷岩茶(61.29%)[19]、辣木茶(64.08%)[20]等接近，具有较好的保健功能。
从不同品种间氨基酸含量的变异系数来看，Cys、Arg、Ser、Pro变异系数较大，均在70%以上，表明这些氨基酸的含量在品种间差异较大。而Asp、Thr、Gly、Ala变异系数均在40%以下，在品种间差异相对较小。说明虽然在同一地点种植，但由于植物中的氨基酸组成受内在遗传因素和外在环境的影响[21]，不同品种间氨基酸组成仍存在较大差异。
2.2 氨基酸营养指数评价
各品种特定氨基酸的AAS值如图1所示。Thr和His是供试品种中AAS指数最高的氨基酸。其中共6个品种(分别为3、5、7、8、10和13号)有超过半数的氨基酸AAS>1，符合营养模式标准。但在6个品种中Leu、Lys和Cys+Met 的AAS<1，说明含量较为缺乏，属于限制性氨基酸，即食物所含必需氨基酸的量，与人类所需的蛋白质必需氨基酸的量的比值较低的氨基酸[22]。
总体上这6个品种优于其他品种的必需氨基酸组成。Met+Cys的AAS在所有供试品种中均最小，为第一限制氨基酸。而Met+Cys属于含硫氨基酸，易于从人体流失，通常在蛋类和肉类中含量较多，而在植源性食品中普遍缺乏[12]。
EAAI能够反映必需氨基酸组成结构的总体营养价值，EAAI越接近100，食物蛋白与参比营养蛋白的必需氨基酸组成越接近，营养价值越高。通常，EAAI≥90，就认为该蛋白有较高的营养价值， 70≤EAAI <90,则认为该蛋白营养价值中等，EAAI <70 则表示营养价值不高。如图2所示，1号‘紫王子’得分最低，仅26.31，而10号‘灰姑娘’和13号‘黄金甲’的EAAI得分最高，为113.45和113.66，原因在于两者中存在较高比例的Thr和His，相比标准蛋白模式，营养结构不够均衡。与模式谱较接近的分别为6号‘黛玉’、3号‘完美紫’和8号‘丰盛’，EAAI依次为98.71、101.41、102.04。
图1 供试海棠品种氨基酸评分
Fig.1 AAS of the crabapple cultivars studied
2.3 呈味氨基酸分析
食物中的氨基酸有非游离态和游离态2种形式。非游离氨基酸在食用的过程中不能立即水解，对食物的滋味影响不大。游离态氨基酸呈味特性可分为4类，鲜味氨基酸(Glu、Asp)、甜味氨基酸(Thr、Gly、Ala、Ser)、苦味氨基酸(Met、His、Arg、Val、Leu、Ile、Tyr、Trp)、无味氨基酸(Cys、Lys、Pro)[7]。由于人味觉神经对不同呈味物质浓度的敏感程度不同，因而呈味氨基酸的含量越高，对滋味的贡献不一定越大。
图2 海棠品种必需氨基酸指数
Fig.2 EAAI of the protein in crabapple cultivars
TAV用于衡量呈味物质对滋味的贡献度。海棠叶茶所含的呈味氨基酸TAV如表3所示，平均TAV>1的呈味氨基酸分别是Ser、Asp、Glu、Val、Arg和His。从高到低依次为Glu>Ser>Arg>His>Val>Asp，提供鲜味的Glu和Asp平均TAV达到了6.33和1.01，提供甜味的Ser为3.33，三种苦味氨基酸Val、Arg和His的均值分别为1.34、2.65、2.27。
表3 不同品种海棠呈味氨基酸TAV
Table 3 Taste activity values of flavor amino acids in different cultivars of crabapple
分类氨基酸TAV值紫王子露易莎完美紫硕红鲁道夫黛玉高原红丰盛时光秀灰姑娘平邑甜茶粉冠黄金甲皇家雨点当娜均值阈值/(mg·g-1)甜味苏氨酸Thr0.100.450.420.290.190.230.220.340.330.310.310.200.380.230.320.292.6甘氨酸Gly0.010.010.010.020.010.010010.010.010.010.010.010.010.0030.010.011.3丙氨酸Ala0.610.370.580.450.280.320.260.380.640.320.720.460.340.230.270.420.6丝氨酸Ser2.622.183.829.474.471.873.333.728.161.062.511.211.821.302.403.331.5鲜味天冬氨酸Asp1.061.070.691.071.081.051.000.902.310.670.800.680.731.030.951.011谷氨酸Glu8.316.088.774.133.277.313.514.3716.573.907.865.784.925.634.546.330.3苦味缬氨酸Val0.211.171.533.052.121.251.401.382.570.781.210.371.180.521.361.340.4蛋氨酸Met0.010.020.020.010.0040.0030.010.020.020.010.020.010.010.010.020.010.9异亮氨酸Ile0.030.190.260.550.370.210.250.240.420.140.190.060.210.090.240.231.9亮氨酸Leu0.040.270.330.480.390.250.250.260.330.150.220.060.220.060.210.231.9苯丙氨酸Phe0.040.320.410.630.620.300.470.510.810.210.320.190.330.150.450.380.9精氨酸Arg1.821.882.513.981.751.383.352.278.590.734.571.281.022.851.762.650.5组氨酸His0.891.843.303.102.481.752.402.406.661.361.581.841.341.191.902.270.2酪氨酸Tyr0.010.050.100.050.050.020.060.080.040.030.060.020.060.010.040.052.6
在所有品种中，‘时光秀’中的Asp和Glu的TAV最高，分别为2.31和16.57。而‘硕红’和‘时光秀’中Ser、Arg、Val和His的TAV普遍较其他品种的水平高。尽管茶叶中大部分氨基酸TAV<1,但对风味并非没有贡献，滋味的构成并不来源于滋味组分的线性叠加，很多滋味组分在茶汤中具有多个滋味属性，存在互作结果，可以表现为协同、加和、抑制效应[6]。LIOE等[23]发现低于呈味阈值的苦味氨基酸，可增强其他氨基酸的鲜味和甜味;刘伟等[24]发现Phe、Tyr、Arg能增加呈味的复杂性和辅助提升鲜度。
从氨基酸水平来看，海棠叶茶以甜、苦和鲜味共同影响整体滋味，贡献强度的差异形成了品种间不同的呈味结构。本研究中海棠叶茶总体口感先有微苦，后有甜味，大部分品种间的滋味类似，但存在一定差异。与文献中海棠叶茶甘甜和苦涩的滋味报道一致[25]。由于茶叶的滋味受内含物质、加工等因素影响，较为复杂。因此，对海棠叶茶滋味的研究需要后续结合感官评价、滋味稀释分析(yaste dilution analysis, TDA)和比较滋味稀释分析(comparative taste dilution analysis, cTDA)等方法，更为系统的进一步筛选出食物中的主要滋味活性物质，并确定其滋味贡献率的大小[26]。
2.4 不同品种海棠叶茶主成分分析
根据各个品种中游离氨基酸的相对含量作为因子进行主成分分析，如图3所示。
图3 不同海棠品种主成分分析
Fig.3 Principal component analysis for different crabapple cultivars
15个品种的茶样得到了很好的区分，PC1贡献率42.58%，PC2贡献率22.64%，前2个主成分总贡献率65.22%，反映了各个品种中氨基酸组成结构的大部分信息。在横坐标的最右端，有Ile、Val、Leu、Phe 等多个因子聚集，说明这些氨基酸的含量对PC1正向的贡献较大，与X轴右侧分布的品种呈正相关，与左侧的呈负相关。1号位于横坐标的最左侧，在PC1上与Glu、Ala、Asp等氨基酸相关；在PC2上，有12种氨基酸分布在Y轴负向，说明其与第3和第4象限聚集的品种相关，它们在含量上有很大的相似性。4号在Y轴正向分布最远， Ser与其高度相关，氨基酸相对含量较其他品种有差异。PCA的分析结果直观地展示了海棠叶茶品种间游离氨基酸结构的相似性。
3 结论
本实验对海棠叶所制茶叶的游离氨基酸成分和主要营养指标进行分析，结果表明，虽然海棠鲜叶的产地相同，但不同品种间的含量和组成的变异系数差异较大。15种海棠叶茶中Ser、Glu、Arg、Asp和Thr的含量普遍较高。游离氨基酸的总量在655.12～3 059.69 mg/100 g，‘灰姑娘’和‘黄金甲’等有较高比例的必需氨基酸，接近FAO/WHO中40%的标准模式。药用氨基酸含量占氨基酸总量的25.87%～58.14%，‘黛玉’和‘平邑甜茶’是药用氨基酸含量较高的品种，Glu是含量最高的药用氨基酸，而这些药用成分对于抗疲劳和提高新陈代谢，以及增强人体的抗氧化能力和免疫能力等都有显著促进作用。根据AAS可知，海棠叶茶中的第一限制氨基酸为Met和Cys。EAAI平衡性最好的品种分别为‘黛玉’、‘完美紫’和‘丰盛’。通过计算TAV，分析了氨基酸对茶叶滋味的贡献，呈味贡献较大的氨基酸有3类，分别为甜味(Ser、Asp)、鲜味(Glu)和苦味(Val、Arg、His)氨基酸。此外，通过PCA，根据氨基酸结构特点对不同品种进行了直观地区分。
海棠叶茶中具备优良蛋白的种质，可以作为一种新型植物蛋白源，提供较高的营养成分。并且与动物蛋白结合，做到良好的互补作用。但制成迎合市场多元化需求的新型功能性饮品，还需进一步结合感官评价，选择口感易被接受的海棠种质来开发。由于本实验选择的样品产地来源仅限于扬州市，并未包括全国其他海棠叶原料来源，不能完全代表海棠叶茶品质，因此在今后还需扩大采样量和采样范围，比较不同采收时间海棠叶茶氨基酸品质的区别，详细调查气候条件和管理方式，设计实验，以明确环境因素对海棠叶茶氨基酸营养价值的影响，为海棠叶片资源利用提供更多依据。
[1] 李育农. 苹果属植物种质资源研究[M]. 北京: 中国农业出版社, 2001.
[2] 周婷, 沈星诚, 周道建, 等. 海棠品种分类研究进展[J]. 园艺学报, 2018,45(2):380-396.
[3] 姜文龙,范俊俊,张丹丹,等.观赏海棠不同叶位色彩特征及特异种质挖掘[J].园艺学报,2017,44(6):1 135-1 144.
[4] 李珮, 申洁, 毕武, 等. 苹果属植物叶片的代谢组学分析及5种成分的含量测定研究[J]. 中草药, 2018, 49(22): 5 378-5 387.
[5] LIU Bihui, ZHANG Chengfeng, ZHANG jing, et al. Wu shan shen cha(Malus asiatica Nakai. leaves)-derived flavonoids alleviate alcohol-induced gastric injury in mice via an anti-oxidative mechanism [J]. Biomolecules,2019,9(5):169.
[6] 毛世红. 基于风味组学的工夫红茶品质分析与控制研究[D]. 重庆: 西南大学, 2018.
[7] TSENG Y H， LEE Y L， LI R C， et al. Non-volatile flavour components of Ganoderma tsugae[J]. Food Chemistry, 2005, 90(3):409-415.
[8] 闫征, 郝利民, 张黎明, 等. 3种不同产地灵芝子实体主要化学成分比较[J]. 食品科学, 2019,40(6):240-246.
[9] HORANNI R， ENGELHARDT U H. Determination of amino acids in white, green, black, oolong, pu-erh teas and tea products[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2013, 31(1):94-100.
[10] Y
LMAZ C, ÖZDEMIR F,GÖKMEN V. Investigation of free amino acids, bioactive and neuroactive compounds in different types of tea and effect of black tea processing[J]. LWT, 2020,117.
[11] GB/T 30987—2014 植物中游离氨基酸的测定[S]. 北京:中国标准出版社, 2014.
[12] ZHOU Mengyi, HUA Tongtong, MA Xiaofang, et al. Protein content and amino acids profile in 10 cultivars of ginkgo (Ginkgo biloba L.) nut from China[J]. Royal Society Open Science, 2019,6(3): 181 571.
[13] 王馨雨, 王蓉蓉, 杨绿竹, 等. 不同品种及内外百合鳞片游离氨基酸组成的主成分分析及聚类分析[J]. 食品科学,2020,41(12):211-220.
[14] 张晓煜, 刘静, 袁海燕, 等. 不同地域环境对枸杞蛋白质和药用氨基酸含量的影响[J]. 干旱地区农业研究, 2004,22(3): 100-104.
[15] 侯娜, 赵莉莉, 魏安智, 等. 不同种质花椒氨基酸组成及营养价值评价[J].食品科学, 2017,38(18):113-118.
[16] 秦颖超, 周加义, 朱敏, 等. 谷氨酸吸收转运及对肠道发育影响的研究进展[J]. 动物营养学报, 2019,31(2):544-552.
[17] BROSNAN J T, BROSNAN M E. Glutamate: a truly functional amino acid[J]. Amino Acids, 2013, 45(3):413-418.
[18] 杨小芳, 王文建, 刘建福, 等. 枇杷花茶氨基酸组成分析及营养价值评价[J]. 安徽农业大学学报, 2018,45(2):225-228.
[19] 刘建福, 高俊杰, 田奥磊, 等. 武夷岩茶氨基酸组分及含量分析[J]. 热带作物学报, 2017,38(2):283-287.
[20] 陈玉芹, 尹红星, 王应清, 等. 辣木茶的氨基酸分析及营养价值评定[J]. 南方农业学报, 2017,48(7):1 280-1 285.
[21] GONZALEZ J A, KONISHI Yotaro, BRUNO M, et al. Interrelationships among seed yield, total protein and amino acid composition of ten quinoa (Chenopodium quinoa) cultivars from two different agroecological regions [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2012, 92(6): 1 222-1 229.
[22] CHAVEROUX C, LAMBERTL-ANGLAIS S, CHERASSE Y, et al. Molecular Nechanisms involved in the adaptation to aminoacid limitation in mammals [J]. Biochimie, 2010, 92(7):736-745.
[23] LIOE H N, APRIYANTONO A, TAKARA K, et al. Umami taste enhancement of MSG/NaCl mixtures by subthreshold L-α-aromatic amino acids[J]. Journal of Food Science, 2005,70(7): s401-s405.
[24] 刘伟, 张群, 李志坚, 等. 不同品种黄花菜游离氨基酸组成的主成分分析及聚类分析[J]. 食品科学, 2019, 40(10):243-250.
[25] 黄翠香.海棠优系制茶的品质研究[J].中国农学通报,2019,35(36):61-66.
[26] 王春叶, 童华荣. 滋味稀释分析及其在食品滋味活性成分分析中的应用[J]. 食品与发酵工业, 2007, 33(12):117-121.