核桃(Juglans regia L.)，为胡桃科(Juglandaceae)核桃属(Juglans)落叶乔木，又称胡桃、羌桃、万岁子等，果实具有很高的营养价值，与扁桃、腰果、榛子并列为“世界四大干果”[1]。核桃坚果的种仁外有一层薄皮，为核桃的内种皮，富集多酚类物质，可以阻止种仁的氧化酸败，对核桃果实生长发育及其采后品质的保持起着至关重要的作用[2]。鲜核桃内种皮呈黄色或浅黄色，干制后颜色加深并伴随一定程度的褐变现象[3-4]，由于其具有一定的苦涩味，因此在食品加工过程中会被剔除或者脱涩后再加工。核桃内种皮中对苦涩味起作用的主要是单宁和黄酮等酚类物质。核桃内种皮仅占种仁质量的5%左右，但对种仁口感起着决定性作用[5]，不同核桃品种口感存在较大差异。核桃口感评价一般采用感官评价法，但存在个人偏好、主观性强和重复性差等缺点。电子舌是通过模仿人体味觉机理而制成的一种新型分析仪器，通过味觉传感器阵列获取待测液信息，采用多元统计分析方法对传感器输出信号进行处理，能反映样本整体信息的“指纹”数据，是一种客观的感受系统，具有可靠性强、灵敏度高、重复性好等特点[6-9]。目前，电子舌主要应用在茶叶饮料、酒类、咖啡等液体滋味的分类与评价等方面[10-16]，也应用在肉类、酱类、蜂蜜等食品上[17-21]，还有应用在花椒的麻味预测上[22]，但在核桃口感品质分类评价上尚未见相关报道。另外，相关学者对核桃的研究主要集中在核桃仁、内种皮和青皮等的酚类物质的提取优化、含量测定以及抗氧化研究等方面[23-25]，近年来有学者利用液相色谱、液质联用等技术对核桃内种皮、核桃仁的酚类物质组分进行了研究[26-27]，也有利用转录组、代谢组等方法对不同颜色核桃的种仁、内种皮进行研究[28-29]，但对核桃内种皮口感评价的研究很少。本研究利用电子舌系统对5个核桃品种内种皮水浸提液进行检测，并进行主成分、聚类以及相似性分析，并测定了核桃内种皮的单宁和黄酮含量，将理化指标与电子舌响应值进行相关性分析，以期为后续核桃口感品质研究以及核桃种质资源分类评价等方面提供参考。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试验材料为‘ND-1’、‘薄壳香’、‘香玲’、‘京861’、‘农核1号’5个核桃品种的新鲜内种皮，2019年9月中旬采于山西省农业科学院果树研究所核桃资源圃。经实验室人员对鲜核桃整仁进行感官评价，分为3个等级，选择苦涩味较重的品种(‘ND-1’)、苦涩味略重的品种(‘薄壳香’、‘香玲’和‘京861’)、苦涩味轻的品种(‘农核1号’)用于试验测定。
1.2 仪器设备
冷冻干燥机,美国GOLD-SIM公司；AY120电子天平,日本岛津公司；SB25-12DTD超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司；Centrifuge 5804 R离心机,德国Eppendorf公司；α-ASTREE电子舌系统,法国Alpha M.O.S公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品前处理
将鲜核桃的内种皮用镊子剥离，冷冻干燥后研成粉末，过100目筛，于-40 ℃条件下保存，待用。
1.3.2 样品准备
称取内种皮粉末0.5 g于离心管中，加入50 mL超纯水，55 ℃超声波辅助提取30 min，5 000 r/min离心20 min，取上清液，于电子舌进行检测。配制质量分数为0.05%的单宁酸溶液作为涩味参照物。
准确称取内种皮粉末0.20 g，加入一定量体积分数为60%的乙醇，55 ℃超声波辅助提取30 min，10 000 r/min离心10 min，重复2次，合并上清液，定容，待测。
1.3.3 电子舌检测
采用由法国Alpha M.O.S公司生产的α-ASTREE电子舌系统，主要由味觉传感器、信号采集器和模式识别系统3部分组成。该电子舌包含7个传感器和1个AlCl3参比电极，7个传感器分别为AHS(酸味)、CTS(咸味)、NMS(鲜味)、ANS(甜味)、SCS(苦味)、PKS和CPS感知复合味道。
数据采集前，对电子舌系统进行活化、校准及诊断等操作，以保证获得数据的可靠性与稳定性。将上清液倒入电子舌专用小烧杯至刻度线，按照设置的序列位置放到电子舌自动进样器中，清洗液(超纯水)与样品交替，于室温条件(25 ℃左右)下进行测定。数据采集时间设置为120 s，每秒采集1个数据，搅拌速率为1次/s，因在100 s之后所有传感器响应强度值均趋于平稳，所以取最后20 s测定值的平均值作为输出值。每杯样品重复测定9次，选取后5次测定的数据作为原始数据进行分析。
1.3.4 单宁和黄酮含量的测定
单宁含量的测定：参照罗玉洁[30]的方法，稍作修改。吸取0.1 mL提取液到10 mL容量瓶中，分别加入0.5 mL福林酚和1 mL NaCO3溶液，用蒸馏水定容，室温静置，反应1 h后在725 nm波长下测定样品溶液的吸光度，重复3次。标准曲线回归方程为：y=0.079 9x+0.000 3，R2=0.999 3。
黄酮含量的测定：参照解利利等[31]、张春梅等[23]的方法，稍作修改。吸取0.5 mL提取液到10 mL容量瓶中，分别加入0.3 mL质量分数为5%的NaNO2溶液和0.3 mL质量分数为10%的Al(NO3)3溶液，再加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液，用体积分数为60%乙醇定容，室温静置，反应15 min后在510 nm波长下测定样品溶液的吸光度，重复3次。标准曲线回归方程为：y=0.014 9x+0.002 5，R2=0.999 2。
1.4 数据处理
数据采用电子舌配套的数据分析软件进行主成分分析和相似性分析；采用SAS 8.0统计软件的距离类平均法进行聚类分析；采用SPSS 23软件进行相关性分析。
2 结果与分析
2.1 不同核桃品种内种皮水浸提液的口感品质主成分分析
为了更直观地分析电子舌系统传感器对不同核桃样品的响应强度，将所得数据形成雷达图，每个分支代表一个传感器，结果如图1所示，所有传感器响应值在-300～3 300之间，其中ANS、CPS和NMS的响应值较高(均高于2 000)，说明它们是判断样品品质的重要传感器。相对于NMS和CPS来说，CTS、PKS、AHS、SCS和ANS对不同样品的响应存在较大差异，响应值离散度较大，表明这4个传感器对样品中的某些物质存在较高敏感度，从而说明它们对不同样品有很好的区分效果。
由图2可知，每个样品在主成分分析图上由5个点组成，第1主成分的贡献率为73.53%，第2主成分的贡献率为14.82%，2者的总贡献率达到了88.35%(>85%)，表明第1和第2主成分包含了样品大量的原始数据信息，可以反映样品的整体情况。
图1 电子舌传感器响应强度雷达图
Fig.1 Radar chart of the response intensity of the electronic tongue sensor
图2 核桃内种皮水浸提液和单宁酸溶液的主成分分析
Fig.2 Principal component analysis of water extracts of walnut pellicle and tannic acid solutions
识别指数是区分样品程度的表征值，该值越大，说明区分越好，一般该值在80分以上就表明区分有效。不同品种的核桃内种皮水浸提液分布在主成分分析图的不同区域，并且不同样品之间没有重叠，识别指数为87，表明电子舌系统对这5个样品的口感可以有效区分。
不同样品之间的品质差异可以通过主成分分析图中的距离表征，若样品之间的距离越近，说明其品质特性越相近。5个样品在主成分分析图中分别分布到3个区域中，其中‘农核1号’与其他4个核桃品种离得较远，单独分布在第2象限，说明‘农核1号’与它们之间口感差异较大；‘薄壳香’、‘香玲’和‘京861’分布的区域在第3象限，相互之间离得较近，说明它们的口感相近；‘ND-1’分布在第4象限，但是与第3象限的3个品种离得较近，说明‘ND-1’的口感与它们相近但又存在差异。‘农核1号’与其他4个核桃品种的口感主要根据主成分2进行区分，‘ND-1’与其他4个核桃品种的口感主要根据主成分1进行区分。另外，‘ND-1’与单宁酸之间的距离最近，说明两者之间口感最接近，从而表明‘ND-1’的涩味最重。由此可见，‘ND-1’的涩味最重，‘农核1号’的涩味最轻，其他3个品种涩味居中。
2.2 不同核桃品种内种皮水浸提液的口感品质聚类分析
由图3可知，单宁酸溶液与核桃品种内种皮水浸提液被聚为2大类；当类平均距离为0.4时，5个核桃品种内种皮水浸提液被聚为3大类,‘农核1号’、‘ND-1’各为一类，其他3个核桃品种为一类，这与主成分分析结果一致。在距离大约为0.19时，‘京861’和‘香玲’聚为一类；在距离为0.26时，前两者与‘薄壳香’聚为一类；这3者与‘ND-1’在距离为0.48左右时聚为一类。由此可见，‘京861’和‘香玲’内种皮水浸提液的口感最接近，‘农核1号’与‘薄壳香’、‘香玲’和‘京861’这3个核桃品种的口感差异较大，与‘ND-1’的口感差异最大。
图3 核桃内种皮水浸提液和单宁酸溶液的聚类分析
Fig.3 Cluster analysis of water extracts of walnut pellicle and tannic acid solutions
2.3 不同核桃品种内种皮水浸提液的口感品质相似性分析
相似性分析结果中若距离越小、指纹分辨指数越小，则样品之间越相似，差异越小。由表1可知，单宁酸与5个品种核桃内种皮水浸提液之间的距离和指纹分辨指数都很大(距离>940，指纹分辨指数>80%)，表明单宁酸与核桃的口感存在较大差异，5个核桃品种的涩味均不及单宁酸溶液。单宁酸与‘ND-1’的距离和指纹分辨指数最小(距离为942.55，指纹分辨指数为83.22%)、与‘香玲’和‘农核1号’的距离和指纹分辨指数均最大(距离分别为1 241.35、1 222.72，指纹分辨指数分别为88.26%、89.23%)，表明单宁酸与‘ND-1’的相似性最大、而与‘香玲’和‘农核1号’的相似性最小。因此，‘ND-1’的涩味较其他4个品种的涩味重。
‘农核1号’与其他4个核桃品种之间的距离和指纹分辨指数均较大(距离>480，指纹分辨指数>70%)，表明‘农核1号’与其他4个核桃品种在口感上相似性较小、差异较大。‘薄壳香’、‘香玲’和‘京861’之间的距离和指纹分辨指数均较小(距离<260，指纹分辨指数<60%)，表明这3个核桃品种在口感上相似性较大、差异较小。‘农核1号’与‘ND-1’之间的距离和指纹分辨指数最大(距离为635.71，指纹分辨指数为97.99%)，表明两者之间的相似性最小、差异最大。‘京861’与‘香玲’之间的距离和指纹分辨指数最小(距离为145.14，指纹分辨指数为12.40%)，表明两者之间的相似性最大、差异最小。由此可见，5个核桃品种可以分为3类：‘ND-1’为涩味较重的一类、‘农核1号’为涩味较轻的一类、其他3个核桃品种为涩味居中的一类。
表1 核桃内种皮水浸提液和单宁酸溶液的 相似性分析
Table 1 Similarity analysis of water extracts of walnut pellicle and tannic acid solutions
样品名称参照样品距离指纹分辨指数/%单宁酸ND-1942.5583.22单宁酸薄壳香1 102.9886.93单宁酸农核1号1 222.7289.23单宁酸京8611 172.3682.57单宁酸香玲1 241.3588.26ND-1薄壳香228.2982.95ND-1农核1号635.7197.99ND-1京861359.4552.28ND-1香玲455.4481.50薄壳香农核1号489.7895.20薄壳香京861190.2422.92薄壳香香玲257.4256.72农核1号京861575.0173.48农核1号香玲516.3584.65京861香玲145.1412.40
2.4 不同核桃品种内种皮单宁和黄酮含量比较
由表2可知，单宁含量从高到低为：‘ND-1’>‘京861’>‘香玲’>‘薄壳香’>‘农核1号’；黄酮含量从高到低为：‘ND-1’>‘薄壳香’>‘京861’>‘香玲’>‘农核1号’。在单宁含量方面，‘ND-1’>600 mg/g，‘农核1号’<400 mg/g，而其他3个核桃品种均在500 mg/g左右；在黄酮含量方面，‘ND-1’>160 mg/g，‘农核1号’<130 mg/g，而其他3个核桃品种均在140～150 mg/g。因此，从单宁和黄酮含量可知：‘ND-1’苦涩味较重、‘农核1号’苦涩味较轻、其他3个核桃品种居中，这与电子舌检测结果大致相同。
2.5 理化指标与电子舌响应值相关性分析
表2 不同核桃品种内种皮的单宁和黄酮含量 单位：mg/g
Table 2 Tannin and flavonoid content in pellicle of different walnut varieties
品种单宁黄酮ND-1626.64±0.78a162.05±0.40a薄壳香499.83±0.88c140.64±0.62d农核1号336.89±0.62c124.54±0.98e京861512.56±0.38b149.46±0.21b香玲501.06±0.97c146.76±0.22c
注：表中数值为平均值±标准偏差；同一列中带有不同小写字母的数值之间差异显著(P<0.05)
为了探究单宁和黄酮含量与电子舌响应值的相关性，利用皮尔逊系数对其进行相关性分析，结果如表3所示。单宁与黄酮、AHS呈极显著正相关(P<0.01)，与CTS和SCS呈正相关，与CPS呈极显著负相关(P<0.01)，与NMS、ANS呈显著负相关(P<0.05)；黄酮与单宁、AHS呈极显著正相关(P<0.01)，与SCS呈正相关，与NMS、CPS和ANS呈显著负相关(P<0.05)。由此可见，单宁和黄酮含量与苦味呈正相关，与甜味呈显著负相关。
表3 理化指标与电子舌响应值相关性分析
Table 3 Correlation analysis of physiochemical indicators and electronic tongue response value
指标单宁黄酮AHSPKSCTSNMSCPSANSSCS单宁1黄酮0.980∗∗1AHS0.965∗∗0.972∗∗1PKS-0.678-0.676-0.5321CTS0.3760.2850.4280.3641NMS-0.930∗-0.887∗-0.8330.872-0.1111CPS-0.978∗∗-0.928∗-0.914∗0.617-0.4940.900∗1ANS-0.936∗-0.916∗-0.8220.843-0.1570.951∗0.929∗1SCS0.5020.5880.491-0.818-0.574-0.645-0.337-0.5661
注：*表示显著相关(P<0.05)，**表示极显著相关(P<0.01)
3 结论与讨论
苦涩味主要来自单宁、黄酮类和儿茶素类物质，是由单宁等多酚类物质与唾液蛋白之间的相互作用引起的。未成熟的柿子具有典型的涩味，黄瓜、茶和坚果等也有苦涩味。费学谦等[32]研究认为柿单宁主要成分是儿茶素和没食子酸。田恒禄[33]认为黄瓜中主要涩味物质为儿茶素类物质。刘敏[34]发现茶叶涩味主要物质是儿茶素类物质，儿茶素是茶多酚类的主体物质。乜兰春等[35]研究得出引起苹果果实涩感的主要物质是绿原酸、儿茶素、表儿茶素和原花青素。夏勃[36]在研究中提到核桃中的苦味和涩味物质主要成分是单宁，但是没有对其进行详细的研究。俞文君等[37]对38份核桃资源的7个显苦涩味物质进行了研究，得出单宁是核桃果实中主要苦涩味物质的结论。另外，甜味对苦涩味有一定的掩蔽性，本研究中甜味高的品种其苦涩味低也证明了这一点。虽然核桃营养丰富，对人们的身体有很大益处，但是因其内种皮具有苦涩味而使人们在食用过程中会将其剔除而造成资源浪费和环境污染，因此找到低苦涩味的核桃对于核桃育种和生产实践是十分关键的环节。
本研究利用法国Alpha M.O.S公司生产的α-ASTREE电子舌系统对5个核桃品种的内种皮水浸提液进行检测，进行了主成分、聚类以及相似性分析，并测定了核桃内种皮的单宁和黄酮含量，将理化指标与电子舌响应值进行了相关性分析，发现该电子舌系统对5个核桃品种进行了有效区分，并将5个核桃品种分为3类：‘ND-1’和‘农核1号’各为一类，其他3个核桃品种为一类；‘ND-1’苦涩味较重、‘农核1号’苦涩味较轻、其他3个核桃品种居中；单宁和黄酮含量与苦味呈正相关，与甜味呈显著负相关。因此，在科研实践中，可以利用电子舌系统对不同核桃品种以及核桃种质资源的口感品质进行评价和分类等。
主成分分析图可清楚地看到各品种的分布区域及相互间的距离，聚类分析结果可更直观显示出各品种间的分类情况，相似性分析结果可直观看到各品种两两之间距离和指纹分辨指数，且这3种分析结果基本一致，说明电子舌系统可有效区分各核桃品种。这些分析结果虽不能直观地显示出哪个品种好，但可显示出各品种的差别，并将它们进行分类。因此，在生产实践中可将电子舌检测结合感官评价对核桃乳等产品的口感滋味进行调控。与口感评价相比，电子舌在食品口感品质评价方面具有客观、快速、准确等优点，其应用前景非常广阔。本研究为电子舌技术在核桃以及其他坚果的口感品质评价方面提供了新思路，也为今后核桃乳生产实践中口感检测以及寻找低苦涩味核桃品种等研究提供了重要依据。
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