关于酵素的研究在20世纪初起源于日本，最初定义为酶，指生物体所产生的具有催化作用的活性大分子，其成分往往为蛋白质或核酸，后来发展到欧美、台湾等地区，商家把以果蔬等为原料发酵所得产品称作酵素，即目前市场上广泛推广和销售的酵素产品[1]。根据中国生物发酵产业协会发布的《酵素产品分类导则》标准，酵素是指以动物、植物、菌类等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品[2]，为避免产生误解，酵素的英文名也逐渐摒弃常用的“enzyme”或“ferment”，而是提出“Jiaosu”一词。根据用途，酵素可分为食用酵素、环保酵素、日化酵素、饲用酵素和农用酵素等，其中食用酵素因富含益生菌、酶、矿物质和特定的生物活性成分而在食品和健康领域受到广泛关注[2-3]。
食用酵素的发酵主要是酵母菌、乳酸菌和霉菌等益生菌通过自身新陈代谢使发酵基质(各种植物、动物与菌类等食品原料)通过复杂的生化反应，合成具有多种生物活性的酶类和中间代谢产物或复杂代谢产物。益生菌发酵不仅产生改善产品风味的物质，更重要的是产生一些新的活性成分，增加酵素的保健功能。近年来，随着健康观念的深入人心，食用酵素在我国的需求市场日益增大，然而现阶段进口的食用酵素产品在国内的售价普遍昂贵，同时我国的食用酵素产品仍主要采用自然发酵的传统加工方式，难以满足市场需求[4]。
为探讨食用酵素研究热点随年份的变化情况，我们通过CNKI数据库检索了近20年食用酵素相关的文献，将与主题相关度前200名的文献使用CNKI在线分析获得文献互引网络关系图(图1)。由图1可知，在食用酵素的研究中，微生物、发酵工艺和抗氧化活性等一直是研究热点，近年来的研究也开始注重不同原料酵素的开发。然而，当前我国食用酵素的发展尚处于起步阶段，其研究和产业化都面临着各种困难，例如，食用酵素产品种类繁多但质量参差不齐，生产工艺及菌种差异明显、缺乏统一规范，相关标准和法律法规未及时出台因而难以进行有效的市场监管等。针对这些问题，本文对当前我国食用酵素生产中的微生物、发酵工艺、功能活性以及安全性指标等展开论述，并对我国食用酵素产业未来的发展方向进行展望。
图1 近20年国内食用酵素相关文献引用及其共被引关系图
Fig.1 A network of cited and co-cited references concerning domestic edible Jiaosu in the latest 20 years 注：球形的尺寸与研究热度呈正比；球形的颜色与上方图例中年份颜色一致；标识的文字为研究热点的关键词
1 食用酵素的分类
食用酵素产品通常依据其产品形态或原料种类进行分类，以产品形态可分为液体酵素、膏体酵素、粉状酵素和酵素片剂(胶囊)[1]。其中，液体酵素是发酵原液，可保留高活性成分，利于人体吸收；膏体酵素浓度较高，饮用时需要经过稀释；而粉装酵素和片剂酵素虽然可以提高产品保质期、减少其体积和质量，并大大降低运输和存储成本，但由于生产工序复杂，原材料中的营养物质流失严重，在功效上不太显著。此外，食用酵素产品依据所用原料类型可分为单一型酵素和复合型酵素[1]，单一型酵素包括蔬菜酵素、水果酵素、谷物酵素和药食同源酵素，而复合型酵素是将果蔬及谷物等多种类型原料混合发酵，不同种类的食用酵素所采用的发酵方式、微生物及功效也具有明显差异(表1)。
1.1 单一型酵素
1.1.1 蔬菜酵素
蔬菜酵素的生产大部分采用多种蔬菜原料混合发酵的方式，将多种蔬菜混合后接种酵母菌、乳酸菌等菌种进行发酵，得到具有不同功效的酵素产品。蔬菜酵素中不仅含有丰富的维生素、微量元素(硒、铜和锌等)以及生物活性化合物(如酚类、芥子油苷、胆碱、类胡萝卜素和植物雌激素等)，还含有低聚糖、可溶性膳食纤维等具有益生作用的成分，可通过调节肠道微生态达到降低血脂、体脂和血糖等功效[5]。SIMSEK等[6]以植物乳杆菌对番茄、胡萝卜等混合蔬菜汁进行发酵，得到了具有抗糖尿病、降胆固醇、血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制、凝血和抗氧化等功效的食用酵素。
表1 不同原料种类食用酵素
Table 1 Edible Jiaosu fermented by different raw materials
食用酵素微生物发酵条件保健功能参考文献蔬菜酵素芸豆酵素酵母菌,复合乳酸菌(植物乳杆菌Lactonacillus plantarum和嗜酸乳杆菌L. acidophilus以质量比1∶1混合)在pH 5.0、接种量0.20%(体积分数)酵母,30 ℃振荡培养24 h;再分别接种1.5%植物乳杆菌和1.5%嗜酸乳杆菌,37 ℃发酵24 h;4 ℃静置发酵24 h积累风味物质富含多种球蛋白、碱性皂体及活性肽,具有维持微生态平衡、提高生物效价及控制机体内毒素等功效[24]水果酵素桑葚酵素醋酸杆菌(Acetobacterium pasteurianus)发酵温度30 ℃,发酵时间 24 h补益肝肾、滋阴养血、清肝明目、提高免疫力、延缓衰老[8, 25]猕猴桃酵素按质量比4∶1混合接种酵母菌和乳酸菌发酵温度30 ℃,发酵时间5 d美容养颜,安神益智[26]黑加仑酵素自然发酵,不接菌种多菌种混合,避光,室温自然发酵225 d预防高血压、心脏病、提高免疫力、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、保护视力等[27]树莓-石榴果汁酵素嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)37 ℃、180 r/min条件下培养96 h富含多酚类化合物,具有较强的抗氧化能力[28]谷物酵素糙米酵素酵母菌发酵温度32 ℃,培养2 h降血压、促进记忆、抗疲劳[13]燕麦酵素自然发酵,不接菌种糖添加质量分数为18%,30 ℃恒温自然发酵45 d降低血清胆固醇、减少心血管疾病、降低血糖、控制糖尿病、促进益生菌增殖、预防结肠癌、调节免疫、增强抵抗力[29]药食同源酵素解酒护肝酵素(葛根、葛花、丹参、茯苓、山楂、枳椇子)鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus)1、复合酶解;2、微生物发酵转化待温度降到30～40 ℃时加入鼠李糖乳杆菌加速体内三羧酸循环并促进乙醛的分解,改善血液中乙醇和甘油三酯浓度,提高肝组织的抗氧化能力[17]白首乌酵素酵母菌、复合乳酸菌(嗜酸乳杆菌L.acidophilus和植物乳杆菌L.plantarum以体积比1∶1混合)先接种酵母菌发酵产酶,再接种复合乳酸菌,使其发酵提供活菌并改善风味。酵母菌30 ℃发酵24 h;复合乳酸菌,37 ℃静置发酵36 h,4～8 ℃后发酵12 h补肾益精、延缓衰老、解酒护肝[30]人参术苓酵素长双歧杆菌 (Bifidobac-treium longum)、保加利亚乳杆菌(L. bulgaricus)、嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)和嗜热链球菌(S. ther-mophilus)菌液按1∶1∶1∶1 配比发酵温度37 ℃、初始pH 6.0,混合菌种接种量4.0%(体积分数),摇床培养24 h提高胃的收缩频率和幅度,调节脾胃功能,治疗非溃疡性消化不良[31]陈皮酵素植物乳杆菌(L. plantarum)发酵温度37 ℃,发酵时间5 d止咳平喘、健脾健胃、促进消化、调理肠胃、预防糖尿病、治疗心脑血管疾病[32]诺丽酵素自然发酵,不接菌种诺丽整果装桶,前15 d每天排气1次,然后完全密封发酵,保持30～35 ℃,自然发酵1年抗氧化、抗糖尿病、抗肿瘤、抗炎、调节免疫等[19]
续表1
食用酵素微生物发酵条件保健功能参考文献复合型酵素水果植物复合酵素(大麦幼苗、桑叶、黄秋葵、红薯叶、树莓、葡萄、苹果、山楂)自然发酵,所涉及微生物主要有酵母菌(接合酵母属 Zygosaccharomyces spp.、毕赤酵母属Pichia spp.)、乳酸菌(明串珠菌Leuconostoc spp.)、曲霉(米曲霉 Asper-gillus oryzae)1、水果和植物酵素分别在28～32 ℃密封发酵1～3个月至不再有气体产生;2、以适当比例均匀混合水果和植物酵素,在30～32 ℃后熟1个月使得酵素本身具有多样性、平衡性和易于吸收的特点[23]复合果蔬酵素(橙子、西红柿、山药、洋葱、黄芪、人参)纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtillis subsp.natto)、醋酸杆菌(A. pasteurianus)、植物乳杆菌(L. plantarum)按照质量比1∶1∶1接种向植物原料中加入混合益生菌,36 ℃密闭发酵180 d调节生理机能,促进新陈代谢,增强活力[33]核桃青皮果蔬酵素酵母菌和乳酸菌先接种酵母菌室温发酵2个月,再接种乳酸菌20 ℃发酵4个月营养补给、美白抗氧化、助消化和增强免疫[34]拐枣果蔬酵素酵母菌和植物乳杆菌(L. plantarum)先在35 ℃恒温发酵15 d至pH稳定后,过滤,密封后于常温避光处2次发酵成熟30 d抗肿瘤、抗病毒、抗诱变、抗衰老、美白保湿及预防心脑血管疾病[35]玉米须果蔬复合酵素安琪高活性葡萄酒酵母、保加利亚乳杆菌(L. bul-garicus)、醋酸菌接种2%(体积分数)酵母和乳酸菌混合菌液,密闭置于31 ℃恒温箱中发酵41 h后,再添加醋酸菌,摇床发酵抗痛风、抗疲劳、降血糖、降血脂、抗糖尿病、抗菌消炎、抗氧化等[36]
1.1.2 水果酵素
水果酵素即以火龙果、蓝莓、苹果、桑葚、无花果和猕猴桃等一种或多种水果为原料，经微生物发酵而成的酵素食品(表1)。水果酵素不仅可以最大限度地保留水果中的水溶性维生素、植物甾醇和膳食纤维等营养活性成分，也含有丰富的酚类物质(包括黄酮、类黄酮、酚酸及花色苷等物质)，其加工过程中还可形成超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶[7]等，因而多表现出强抗氧化作用。发酵后桑葚酵素的SOD 酶活力(24 122.2 U/mL)可比桑葚果汁(10 818.7 U/mL)提高123%[8]。此外，某些细菌在发酵过程中会产生细菌素，在水果产品防腐以及病原微生物抑制方面具有一定潜力[9]。SIROLI等[10]证明将植物乳杆菌菌株CIT3和V7B3分别接种于苹果和生菜，可提高产品的安全性和保质期。
1.1.3 谷物酵素
谷物富含膳食纤维、维生素及矿物质，这些成分不仅具有较高的营养价值，对人体也具有良好的生理调节作用，例如可刺激结肠中乳酸杆菌和双歧杆菌的生长，因而谷物类原料是益生菌生长的良好基质[11]。目前市面上的谷物酵素多为糙米酵素，发酵过程中糙米经过微生物所分泌酶的作用，其营养物质被分解细化，利于人体吸收，从而提高糙米的功能特性[12]。液态的糙米酵素经干燥后还可作为食品添加剂以及保健成分，用于生产新型功能性食品。付俏等[13]将糙米酵素加入到乳酸菌饮料中，研制出一种新型乳饮料。糙米粉经发酵后，干物质、淀粉和可溶性糖含量减少，蛋白质、维生素和生物活性物质含量增加，其中维生素B1可有效预防失眠、疲劳和食欲不振等，而维生素B2对口腔及眼部疾病的防治十分有利[14]。此外，糙米酵素中还含有丰富的γ-氨基丁酸(GABA)和γ-谷维醇等生理活性物质，前者具有降血压、抗惊厥、促进记忆和抗疲劳等功能，而后者具有降血脂、抗氧化、抗衰老、清除自由基等功效[15]。
1.1.4 药食同源酵素
“药食同源”指兼具日常食物营养价值和临床药用价值的原料，其在酵素生产中的应用是中医药膳、食养、食疗等养生观念的良好体现。由于“药食同源”酵素含有丰富的益生菌和活性成分，结合了药食同源原料的药效作用和酵素食品的营养保健功能，因而具有广阔的开发前景[16]。该类酵素常利用葛根、葛花、丹参、山楂和陈皮等药食同源原料经复合酶解和微生物转化，将其天然活性成分完整保留并有效释放。同时，在发酵过程中微生物代谢会产生次级活性代谢产物，所得产品具有改善人体肠道菌群状态、促进消化吸收、抗肿瘤、提高免疫力等功效。如表1所示，杨志鹏等[17]以葛根、葛花丹参等为原料，经复合酶酶解和鼠李糖乳杆菌217-8发酵制备成酵素，与原材料相比，其葛根素含量提高了7倍，黄酮和氨基酸含量均提高了3倍，多酚含量提高了80 mg/L，抗氧化能力提高了92%。
除此之外，由于诺丽(又称海巴戟、海巴戟天)的果实、叶片、花和茎中含有丰富的功能活性成分(包括多种氨基酸、维生素、酚类化合物、多糖、生物碱、蒽醌、莨菪亭和环烯醚萜类化合物等)，并具有抗氧化、抗糖尿病、抗肿瘤、抗炎和免疫调节等作用，因而常作为药食同源酵素的原料[18]。如表1所示，陆雨等[19]研究发现诺丽酵素中存在的化合物cyclo-(L-Pro-L-Leu)和松脂素能较为显著地抑制HepG-2和HeLa肿瘤细胞活性。WANG等[20]测定发酵72 h后的诺丽酵素，发现接种长双歧杆菌和植物乳杆菌后，其总抗氧化活性分别提高了77%和71%。
1.2 复合型酵素
复合型酵素主要以新鲜水果和蔬菜混合作为原料，通过自然发酵生产，发酵时加入某些草本植物、食盐等成分作为辅料。不同原料的复合添加，可改善发酵体系的碳氮比，增强有效成分的溶出和转移，建立良好的缓冲体系，减少毒性抑制，更利于微生物发酵[21]。此外，还有一类复合型酵素是分别先将单一或混合的果蔬、植物和谷物等进行发酵，再取各酵素原液经混合调配制成。张宏智[22]把60%～90%的混合蔬果酵素原汁与10%～40%的松树酵素原汁混合，形成了一种能增强免疫力、活化细胞的酵素饮品，该方法避免了因原料种类单一而造成的酵素功能局限问题，达到了效力成分相辅相成的作用。艾学东等[23]在制备方法上采用一次分别发酵，二次混合后熟工艺，使水果酵素、植物酵素自然融合在一起，使酵素具有多样性、平衡性和易吸收性的特点(表1)。
复合型酵素在发酵过程中除了保留植物中的维生素、矿物质等营养成分外，还可使粗粮中的不溶性膳食纤维经发酵后分解成更容易被人体利用的可溶性膳食纤维，具有营养丰富和风味独特的特点，可以满足人体对酵素在健康和营养等多方面的需求，目前已在食用酵素市场占主导地位。
2 食用酵素的微生物
按微生物来源可将食用酵素分为自然发酵和人工接种发酵，如表1和表2所示，自然发酵所涉及的微生物主要有酵母菌、曲霉菌及乳酸菌。而人工接种发酵是将所需微生物纯种培养、富集后接种发酵的方式，可分为单一菌种发酵和多菌混合发酵，常用的菌种有酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等[37]。食用酵素的发酵一般属于混菌共生发酵范畴，在共同发酵时不同菌种之间会相互影响，形成独特的风味和活性成分，有利于酵素发酵[37]。然而，多菌共同发酵时发酵环节指标不固定，较难掌控，发酵时间通常很长。
表2 含活性益生菌的食用酵素
Table 2 Edible Jiaosu products containing probiotics
酵素名称活性益生菌功能性成分及保健作用储存条件及货架期(活细胞数控制在6～9 lg CFU/mL)参考文献苹果酵素植物乳杆菌(L. plantarumPCS 26)苹果酸转化成乳酸4 ℃冷藏条件下,游离细胞处理可保存(22.0±0.68) d,固定化细胞处理可保存(32.1±5.2) d[50]菠萝酵素干酪乳杆菌(L. casei NRRL)富含酚类物质;有抗氧化、抗突变和抗癌作用,对心血管疾病和白内障有预防作用4 ℃冷藏条件下,未加糖样品可保存42 d,活菌数为6.03 lg CFU/mL;加糖样品可保存28 d,活菌数为6.05 log CFU/mL[51]石榴酵素分别接种植物乳杆菌(L.plantarum)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)富含花青苷、酚类、抗坏血酸和蛋白质;具有抗微生物、抗病毒、抗癌、抗氧化剂和抗诱变作用在4 ℃冷藏条件下储存1周后,植物乳杆菌活细胞数6.46 lg CFU/mL,德氏乳杆菌活细胞数6.34 lg CFU/mL[52]沙棘酵素鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosusATCC53103)富含酚类物质;对肠道致病性大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、非致病性大肠杆菌具有抑菌性4 ℃冷藏条件下储存28 d,活菌数>8 lg CFU/mL[53]腰果梨汁酵素干酪乳杆菌(L.casei)具有较高抗坏血酸、酚类含量,富含还原糖(果糖和葡萄糖)、矿物质和某些氨基酸;有较强抗氧化性4 ℃冷藏条件下储存42 d,活菌数(8.18±0.04) lg CFU/mL[54]卷心菜酵素短乳杆菌(L. breris)、植物乳杆菌(L. plantarum)、鼠李糖乳杆 (L. rhamnosus)总酚和黄酮含量丰富;有较强抗氧化活性4 ℃冷藏条件下储存30 d,短乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌活菌数分别为9.19、9.47和10.6 lg CFU/mL[44]
续表2
酵素名称活性益生菌功能性成分及保健作用储存条件及货架期(活细胞数控制在6～9 lg CFU/mL)参考文献混合蔬菜酵素嗜酸乳杆菌(L. acidophilus NCDC 11)、植物乳杆菌(L. plantarum NCDC 11)富含植物纤维和β-胡萝卜素;具有降血糖和抗高血糖的功效在4 ℃冷藏条件下,植物乳杆菌储存4周活菌数(7.2±0.17) lg CFU/mL,嗜酸乳杆菌储存3周活菌数(6.10±0.17)lg CFU/mL[55]欧亚山茱萸酵素植物乳杆菌(L. plantarumATCC14917)含有大量氨基酸、人体所必需的元素和生理活性较强的皂苷原糖等成分;具有抗菌、防辐射、利尿、抗糖尿病、抗组胺、抗疟疾和消炎等作用4 ℃冷藏条件下储存28 d,活菌数为(9.95±0.1) lg CFU/mL[56]诺丽果酵素长双歧杆菌(B. longum BCRC 14602)、植物乳杆菌(L. plan-tarum BCRC 10069)可刺激免疫系统、抑制低密度脂蛋白氧化、清除自由基,具有抗炎和调节胆固醇等功效4 ℃冷藏条件下储存21 d,长双歧杆菌活菌数(6.05±0.15) lg CFU/mL,植物乳杆菌活菌数(6.87±0.07) lg CFU/mL[20]燕麦酵素植物乳杆菌(L. plantarum A28)β-葡聚糖质量浓度为(31～36)g/L;具有降胆固醇、降低心血管疾病风险、抗癌等功效4～6 ℃冷藏条件下储存21 d,活菌数为6～7 lg CFU/mL[45]
2.1 食用酵素中的微生物
食用酵素中的微生物按功能主要分为2类：一类是参与发酵过程，但在发酵结束后为延长产品保质期和维持风味稳定性会被灭活。该类微生物主要的功能是分解底物产生小肽、多酚、核苷酸、有机酸等生物活性成分和风味物质；另一类是参与发酵过程并且在发酵完成后不被灭活，而作为益生菌被食用后进入消费者体内发挥功效。
2.1.1 发酵过程中的微生物
食用酵素中的微生物也是酵素食品开发应用的基础，在自然发酵的食用酵素中，原料中存在的微生物会首先形成优势菌群，抑制部分杂菌生长[4]。但是该发酵工艺不仅受限于发酵季节和气候，而且发酵周期冗长，发酵菌种繁多混杂，使发酵产品的安全质量难以控制。因此，食用酵素的生产也开始由自然发酵逐步向接种发酵转变，如以乳酸菌为代表的发酵微生物，通过与杂菌竞争营养源后分泌抑菌物质(有机酸、过氧化氢等)，该类物质可以调节机体免疫功能、降低胆固醇、降血压，对于许多疾病的预防与辅助治疗均具有显著效果[38-39]。如表1所示，彭宁等[26]通过优化生产工艺条件，确定猕猴桃酵素发酵的最佳菌种为酵母菌和乳酸菌，且接种量4%(体积分数)时酒精度下降迅速使发酵最彻底。而在紫花芸豆酵素发酵中，通过酵母菌和复合乳酸菌共同发酵不仅可以提高发酵效率，使产品具有更好的风味，还可提高SOD活力[24]。此外，人工接种优势微生物发酵，还可以大大缩短发酵周期，降低发酵成本，因而在食用酵素的工业化生产中发挥着重要作用。
2.1.2 产品中的有益活性微生物
近年来，益生菌被广泛研究，其中公认的益生作用主要有维持肠道菌群平衡、改善血脂水平、降低胆固醇、增强免疫力、缓解乳糖不耐症、促进人体对有益物质的吸收和抗氧化等[40]。在食用酵素生产过程中，部分酵素在发酵完成后会保留益生菌活性，可作为一种益生菌补充剂。消费者通过饮用这类酵素可以摄入足够数量的活菌，改善肠道微生态，从而提高健康水平。然而，通过果蔬汁或谷物传递益生菌是一个巨大的挑战，因为产品中活菌数必须保持一定数量(6～9 lg CFU/mL)才能对消费者的健康产生促进作用。通常情况下，这些益生菌的生长和存活力会受到酸度(pH)、氧气水平、营养物质和产品中是否存在抗菌物质等诸多因素的影响[41]。
现有研究表明，某些益生菌菌株在水果基质中具有较好的生长能力(表2)。在发酵新鲜水果汁中常用的益生菌包括鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌，这3种益生菌均具有耐受低pH汁液基质的能力，在低温储存过程中有较高生存能力，并且具有改善人体肠道功能、抑制腐败菌繁殖和促进人体营养物质吸收等作用，尤其对于有色人种防治乳糖不耐症有显著效果。SHEEHAN等[42]还鉴定出一种新型益生菌(副干酪乳杆菌NFBC43338)，该菌在低pH果汁基质中也具有较高生存能力(>7 lg CFU/mL)，通过测定酵素中的活菌数在贮藏过程中的变化情况，推断货架期至少可以达到12周。BARAT等[43]将嗜热链球菌和德氏乳杆菌接种在黑桑树、红葡萄和欧亚山茱萸混合的水果基质中，发酵制成的酵素不仅含有高浓度抗坏血酸和总酚类化合物，而且含有高水平的益生菌，并可在储存过程中保持较高活性。
此外，研究人员从自然发酵的蔬菜和谷物酵素中也分离出一些乳杆菌菌株(植物乳杆菌、副干酪乳杆菌/干酪乳杆菌、短乳杆菌和嗜酸乳杆菌)(表2)。研究表明，发酵白菜汁中的短乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的活细胞数在储存30 d仍可保持较高值(9～10 lg CFU/mL)，证明白菜汁因为富含蛋白质、维生素、碳水化合物、糖(包括果糖、葡萄糖、蔗糖和棉子糖)以及必需的n-3脂肪酸和亚麻酸等物质，可以作为这些益生菌生长的良好培养基[44]。根据ANGELOV等[45]的研究，植物乳杆菌A28在新鲜燕麦基质中能较好生长，活细胞计数为9.97 lg CFU/mL，并在21 d存储期后仍保持较高活性(6～7 lg CFU/mL，pH<4.5)。同样，在含有麦芽、大麦混合物的基质中，植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌生存能力也得到显著提升[46]。
2.2 食用酵素中的微生物检测技术
探究食用酵素中的微生物多样性与菌群变化规律是筛选优良优势微生物以及发酵过程菌群调控的基础。目前，相关研究大多采用分离纯化法、聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳 (polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)法等对微生物群落结构变化、菌种形态以及种类进行鉴定和分析。杨芳[47]采用 PCR-DGGE分析了6种自制酵素的微生物多样性，结果显示，其优势细菌分布于3个属5个种，优势酵母分布于3个属6个种，其中拟杆菌属(Bacteroides)、乳杆菌属(Lactobacillus)的发现为深入挖掘酵素的食用价值和保健功能提供了依据。
随着分子生物学的飞速发展，宏基因组学也开始被用于分析酵素发酵过程中微生物群落的动态变化规律。高庆超等[48]以高通量测序技术分析了黑果枸杞酵素中群落结构的动态变化，结果显示在自然发酵过程中的主要优势细菌为乳杆菌属(Lactobacillus)，而真菌的动态变化较为复杂，发酵前期和中期以子囊菌门和担子菌门为主，60 d后以酵母属尤其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 占主导地位。MA等[49]首次使用PacBio单分子实时DNA测序(single molecule real time, SMRT)技术获得日本和台湾3种酵素样品中微生物的全长 16S rRNA 谱，分析结果显示3种酵素样品中的微生物来自7个门43个属，其中以变形菌门(Proteobacteria)(98.57±0.46)%和苍白杆菌属(Ochrobactrum)(97.96±0.77)%为主。宏基因组学可以直接从样品中提取基因组 DNA 后进行测序分析，能够准确揭示微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性及环境之间的相互协作关系，因而极大地促进和扩展了食用酵素微生物的研究范围。
3 食用酵素发酵工艺及生产安全性
3.1 食用酵素的发酵工艺
传统果蔬酵素的生产工艺如图2所示[57]。主要将蜂蜜、天然果蔬和水按照1∶3∶10的质量黄金配比分层装入陶瓷发酵罐(不添加任何其他的化学物质)，水封罐口发酵，隔一定时间开罐搅拌，再封口继续发酵，在室温下自然发酵6个月以获得植物精华液，即传统酵素发酵工艺制备得到的酵素原液。
图2 传统果蔬酵素发酵工艺流程
Fig.2 Traditional fermentation process of Jiaosu with fruits and vegetables
由于该工艺操作简单，常作为家庭酵素生产的主要方法，其中密闭发酵环节最为关键，将影响最终的产品质量。研究表明，加入浓度较高的异麦芽糖、蔗糖或者米醋等成分，可以有效抑制杂菌生长和酒精的产生[58]。然而，传统酵素采用自然发酵工艺，是混菌共生的密闭发酵体系，具有参数变化复杂、难以控制且发酵周期长等问题，不适合规范化生产。为实现食用酵素大规模工业化、流程化生产，近几年研究人员主要从液态发酵和固态发酵2个方面展开研究。
3.1.1 液态发酵
现阶段酵素的生产主要采用液态发酵(也称作深层发酵)的方式，将谷物、水果、蔬菜、菇类和药食同源植物等原料接种有益菌种进行发酵，以改善原料的不良风味，产生新的活性成分[58]。2016年，杜增鹏等[59]公开了一种液态发酵果蔬生物酵素的方法和用途，主要包括天然果蔬生物酵素发酵菌种的选育及扩大培养、发酵原料的预处理和接种发酵，该方法不仅保障了微生物发酵体系菌群的多样性，还采用后酵陈贮的方法促进了生物活性物质的生成和富集。
然而，液态发酵的酵素产品不可避免地受到季节、发酵环境和发酵体系中的微生物等因素影响，因此，在发酵后采用真空冷冻干燥、喷雾干燥等技术手段除去液体酵素中的大部分水分不仅可得到仍具有生物活性的固态酵素，还可避免运输和储存过程中因微生物未灭活而导致的产气炸瓶等现象[37]。例如，以糙米为原料接种益生菌液态发酵并冷冻干燥粉碎处理后得到的糙米酵素粉[60]。
3.1.2 固态发酵
食用酵素的固态发酵就是在一定湿度的固体基质上进行无水发酵。固体发酵基质可以作为发酵底物提供碳源和氮源使有益微生物进行生长和繁殖，进而促进营养吸收和转化[37]。陈小林等[61]提出一种果蔬固态发酵混合酵素的生产工艺，即将果蔬渣作为基料，装入发酵瓶灭菌后接种入微生物菌种进行固态发酵，发酵结束后将果蔬汁拌入其中进行低温干燥，可获得既含有原果蔬营养活性成分，又含有微生物发酵产物及菌体的混合酵素。该方法可以实现整个果蔬的全部利用，不产生任何废渣，生态环保。研究和实践表明，丝状真菌、细菌以及酵母菌都能在水果皮、大豆等固态基质上进行发酵产生酶、有机酸等生物活性物质[37]。
对于固态发酵的酵素，因其发酵状态、条件不同，酵素产物的种类、含量、稳定性均有所不同。ACU
A等[62]对深层发酵和固态发酵产生的3种胞外果胶酶的物理化学和动力学特性进行比较研究，发现固态发酵得到的酶在极端pH和温度下具有更好的稳定性且没有底物抑制现象，而液态发酵得到的酶存在底物抑制现象。DIAZ等[63]对固态与液态发酵获得的脂肪酶进行研究，发现2种方法产生的酶均是单体且具有相同的分子质量，但是固态发酵获得的脂肪酶酶活力和稳定性明显高于液态发酵获得的酶。SANDHYA等[64]还发现固态发酵所产生的中性蛋白酶是液态发酵产量的3.5倍。
但从目前研究来看，多数生产酵素的原料含有大量水分，不易进行固态发酵。如今的固态发酵工艺过程中主要存在的问题有搅拌混合困难或者不充分，发酵过程中发酵速率和温度难以控制等。因此，固态发酵食用酵素工艺还需进一步完善以适应大规模工业化生产的需要。
3.2 食用酵素生产的安全性分析
3.2.1 生物性危害
(1)加工过程及所用器具、设备消毒不彻底，不能有效隔绝有毒杂菌的污染[1]。在食用酵素工业生产中，要配备充足且适宜的设施和设备，选择最佳发酵工序，创造维持酵素食品卫生与安全的生产环境，降低生产环境、设备及生产过程受杂菌直接污染或交叉污染的风险。
(2)自然发酵的工艺流程存在发酵周期过长(6～24个月)、果蔬表皮微生物难控制和高糖环境易受杂菌污染等问题，极大影响了酵素产品的开发和利用。针对自然发酵的危害，酵素企业应当选择更为规范、合理的生产方式，精确控制发酵条件保障产品质量。
(3)复合发酵所涉及的原料成分复杂、发酵菌种多样、代谢过程易受外界环境影响，难以控制代谢产物走向、并保证优势有益菌株生长[21]。因此，后续研究需在酵素生产安全菌株的选育方面投入更多精力，选育出适合不同发酵环境的优势菌，以避免有毒副产物的产生，且对外来菌种具有一定的抗定殖能力。
(4)长期使用的菌种有可能会突变成毒株，影响酵素产品的质量和食用安全[1]。生产上需要定期对菌株进行复壮，保证菌株的安全性。
3.2.2 化学及物理性危害
酵素生产原料的种植、采摘和清洗等前处理过程中，存在一些药物残留、重金属离子和化学试剂等，造成化学性危害[1]。虽然微生物对这些有毒有害成分有一定的分解转化能力[65]，但是食用酵素产品的生产过程中仍需严格把控，避免有毒有害化学物质的引入。此外，由于目前食用酵素生产企业仍主要采用传统的自然发酵技术，存在生产规模小、设备简单落后、技术含量低[21]，在加工过程中易误入砂石、毛发，以及加工机械中的铁质锈迹残留等问题，从而造成酵素生产的物理性危害。因此，食用酵素生产企业应当积极引入现代化食用酵素发酵技术，并采用规范化生产操作规程，以降低物理性危害，确保食用酵素产品的卫生质量安全[21]。
4 食用酵素的功能活性
食用酵素采用果蔬、谷物等原料经微生物发酵而成，既含有原料本身的活性成分，还有物料经微生物转化后生成的维生素、氨基酸、多糖和多酚等成分，因而具有解酒护肝、提高免疫力和抗氧化等多种生理作用和功能活性。如表1和表2所示，这些保健功效不仅与发酵基质的种类有关，也与采用的微生物和发酵方式有关。总体而言，食用酵素主要有六大类功能活性(图3)。
4.1 抗氧化作用
过量的自由基会导致人的衰老，也会导致癌症等多种疾病的发生。在酵素中常以多酚类物质作为还原介质、金属螯合剂、单线态氧淬灭剂或H·受体清除过量的自由基，从而起到抗氧化作用。果蔬酵素的发酵可促进果蔬中酚类物质的释放和转化，从而使抗氧化活性显著增强。研究表明，经过植物乳杆菌发酵的姜黄饮料含有丰富的姜黄素、四氢姜黄素等酚类物质，其生物利用率和抗氧化活性均得到了明显提高，具体表现在实验后小鼠血液中自由基数量显著降低[66]。对黑加仑酵素的抗氧化性分析显示，酵母菌发酵有利于提高
清除能力，且在发酵48 h时DPPH自由基清除能力达到了96.37%，发酵到72 h时·OH清除率达到了最大值(70.54%)[67]。值得一提的是，敖东酵素还可以通过显著提高小鼠的SOD和还原性谷胱甘肽含量来提高其抗氧化能力[68]。
图3 食用酵素的功能活性及作用机理
Fig.3 Healthy functions and mechanisms of edible Jiaosu
同时，对于不同果蔬原料的发酵，提高抗氧化活性的关键在于合适菌株的筛选。卢冬梅等[69]采用酵母菌RV171对不同种类和部位的火龙果进行发酵，发现用红心火龙果果皮发酵得到的产物中总酚和总黄酮含量最高，具有最强的总·OH清除能力、还原性以及抗氧化性。
4.2 抑菌作用
经过益生菌发酵后的果蔬制品会产生胞外多糖、细菌素等多种不同的活性成分，这些活性成分可通过阻碍蛋白质等生物大分子的合成、破坏杂菌细胞壁或细胞膜等方式来达到抑菌效果[70]。西兰花发酵液(使用L. plantarum MG208发酵)具有抑制幽门螺旋杆菌的生长和降低其黏附活性的功效，为开发保护胃环境免受幽门螺旋杆菌感染的功能性饮料提供了思路[71]；而以L. plantarum LS5 发酵的甜柠檬发酵液则对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌表现出更高的抗菌活性，且对后者的抗菌作用更强[72]。李祎等[73]通过研究发现龙葵新鲜果汁无抑菌圈产生，发酵后样液的抑菌能力则显著提高(P<0.01)，抑菌作用的增强不仅是由于发酵液中酚类物质含量的增加，也与样品pH和含糖量降低有关，并且抑菌效果与发酵液浓度有一定相关性。
4.3 降脂减肥作用
酵素代谢产物中含有的脂肪酶，是一类特殊的酯键水解酶，作为膳食脂肪消化的主要酶，其表达的改变与肥胖等代谢疾病有着密切关系。研究表明，果蔬酵素和谷物酵素均含有大量脂肪酶类，例如，发酵条件优化后的樱桃酵素中脂肪酶酶活力可达到1 242 U/mL[74]。此外，采用不同剂量的糙米酵素提取物灌喂大鼠，其肝脏粗脂肪质量显著低于高脂对照组(P<0.01)，也从侧面表明糙米酵素提取物有预防脂肪肝的作用[75]。
4.4 解酒护肝作用
过量饮酒会导致肝损伤，当肝细胞膜通透性增加或肝细胞坏死，会引起谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT) 和碱性磷酸酶水平升高[76]。植物酵素中的乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)可以分解乙醇，显著降低AST、ALT活性，从而降低机体乙醇浓度起到解酒护肝的效果。例如，木通提取物发酵产物中ADH活性提高，可以加快乙醇分解，有效降低血浆乙醇浓度并缓解酒精宿醉[77]。
近年来随着中医中药关于解酒护肝原理和机制的揭示，部分研究开始致力于以药食同源材料为基质，通过生物酶解和微生物发酵技术开发解酒护肝产品[17]。将葛根、丹参和云茯苓等食药两用植物进行复合酶解提取后，接种高产谷胱甘肽的鼠李糖乳杆菌进行发酵，可得到具有解酒护肝作用且富含天然活性成分的酵素产品[17]。
4.5 改善肠道环境
果蔬发酵汁中含有丰富的低聚糖和膳食纤维等物质，低聚糖进入人体后在肠道发酵产生短链脂肪酸，对于维持肠道稳态具有重要作用。膳食纤维则可以促进肠道蠕动，并可被肠道内有益微生物利用，改善肠道环境。研究发现，乳酸菌发酵的果蔬饮料可缓解小鼠的便秘症状，其中以鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌等复合乳酸菌发酵的果蔬乳饮料在促进小鼠排便、抑制肠道病原菌和调节肠动力神经递质方面效果更佳[78]。
此外，果蔬发酵制品中的多种益生菌与肠道黏膜上皮细胞形成的占位性保护具有生物屏障作用，其代谢产生的抗菌物质也对有害菌具有生物拮抗作用。朱艳等[79]发现果蔬酵素有促进肠道益生菌粘附和抑制肠道非益生菌黏附的作用，从而可以调节肠道菌群。此外，酵素带入并定植于肠道的益生菌能够将未被机体胃肠道消化利用的碳水化合物代谢为短链脂肪酸(如丁酸盐)，进而能够修复由溃疡性结肠炎引起的肠道上皮细胞受损，抑制结肠癌细胞增殖[79]。
4.6 提高免疫力
机体的免疫系统是通过细胞免疫和体液免疫行使免疫应答功能的，可使机体内环境保持稳定。酵素发酵所采用的益生菌及其细胞壁组分(肽聚糖、葡聚糖)和代谢产物(胞外多糖、多肽等)能激活巨噬细胞和黏膜免疫细胞、促进细胞分裂并产生干扰素、抗体等成分，因此能增强机体的非特异性和特异性免疫性反应，提高机体免疫力[80]。
管晓冉[81]在果蔬汁中加入双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，创造厌氧环境，促进了3个菌种的共生，不仅缩短了果蔬汁的发酵时间，还使其口感得到提升。发酵后的果蔬汁可通过增加免疫器官指数和提高血清溶血素抗体水平的方式，使小鼠体内巨噬细胞的吞噬能力增强。研究表明，敖东酵素也能通过小鼠血清溶血素的改变而提高小鼠的体液免疫功能[82]。此外，刘春花等[83]研究发现植物酵素可以增强单核-巨噬细胞系统功能、自然杀伤细胞活性和体液免疫功能，提高血清溶菌酶水平，进而提高机体非特异性和特异性免疫功能。
5 食用酵素产业概览
食用酵素作为一个新兴产业，近几年来的热度不断上升，以其原料种类广泛、产品形式多样、发酵机制复杂等特点，吸引着越来越多的人进入这个行业，由此带来产业新机遇。同时，不断发展的食用酵素产业也需要相应的科学理论支撑，酵素的生产工艺、发酵机制、活性组分检测、质量评价与把控等，都为深入研究食用酵素指明了方向。2015年，中国生物发酵产业协会经过近3年社会调研后，确定了酵素产业发展的必要性。近几年，业内学术交流与面向社会的科普逐步推进，国家有关部委的政策引导与监管也初步形成，促进了我国酵素产业的稳步发展。
5.1 食用酵素产品行业相关制度规范
2015年之前，中国酵素行业尚处于一个较为混乱的阶段，主要原因是没有一个有效的行业组织，没有进行规范化的生产，产品杂乱。因此在工信部、发改委和科技部等部委的指导下，由从事酵素及相关研究、开发、生产、经营的企业、科研院所、大专院校、公益机构等单位，自愿组成了中国生物发酵产业协会酵素分会，并于2015年12月3日在北京正式成立。协会成立后，对酵素产品的定义、运营分类以及生产方式、产品通用标准等方面进行了规范，逐步建立了行业规则，随后一系列规范和标准相继出台。
2016年1月14日，全国酵素行业专家委员会在上海成立，2016年10月1日T/CBFIA 08001—2016《酵素产品分类导则》、《食用酵素良好生产规范》团体标准正式实施[2, 84]。2017年6月1日《食用植物酵素》团体标准正式实施[85]。2017年7月25日，中国生物发酵产业标准化技术委员会酵素分委会在上海成立，随后《食用酵素良好生产规范》被评为2017年工信部百项团体标准应用示范项目，《食用植物酵素》被评为2018年工信部百项团体标准应用示范优秀项目。2018年12月21日，QB/T 5324—2018《酵素产品分类导则》、《植物酵素》行业标准获工业和信息化部批准[86-87]，已于2019年7月1日正式实施。2019年3月由中国生物发酵产业协会酵素标委会审议通过了酵素产业标准框架图。2019年3月28日，全国酵素行业发展自律监督委员会在京正式成立，并修订发布酵素产业发展规划(2018-2025)。制定标准的主要目的是为了行业能够稳定产品质量、有法可依，相关标准的实施也逐步确定了酵素行业的社会地位及发展目标。
在此基础上，高校与科研院所的科学研究支撑工作也逐步推进，并取得了一定的成果。2019年6月23日，华东理工大学生物工程学院成立了“全国酵素研究中心”，多个第三方检测机构和多家科研院校加入酵素产品的研究行列，填补了国内酵素产业的有关空白。2019年12月中国生物发酵产业协会酵素分会发布《中国酵素》纪录片，从官方角度解读了酵素产业近几年的发展状况，并指出行业中存在的问题和未来研究方向，对酵素行业的健康发展具有强大的推动作用。
5.2 未来食用酵素行业制度完善方向
随着相关规范和标准的颁布，中国酵素产业在近几年也逐渐步入了高质量发展的轨道。但是我国关于食用酵素的科学研究尚处于初级阶段，酵素本身原料种类复杂，生产工艺、过程控制落后以及相应的标准和法规并不完善，导致国内刚刚起步的酵素市场存在一些亟待解决的问题，比如酵素品种比较单一、酵素产品的质量难以把控、产品获取QS认证或保健批文不易等[88]。相对而言，日本的酵素产品市场已经比较规范成熟，日本厚生劳动省将食用酵素这类可以补充一定功能成分的保健功能食品明确划为营养功能型食品，采用事后监督的形式进行管理[89-90]。因为有相应的法律法规保驾护航，日本酵素食品的监管难题得到了有效解决。
日本酵素食品的监管经验给我国酵素行业的管理指明了一定的方向(1)建立以严格标识、科学宣传为核心的酵素食品标识管理制度，只允许按照规格标准要求标识特定营养及保健功能，并且不得在包装盒广告上进行夸大和误导性宣传；(2)完善酵素食品的相关法律法规定义，比如及时更新酵素保健功能目录；(3)建立分类监管、多种监管方法综合运用的酵素食品监管体制，可以借鉴日本酵素食品注册制和备案制下采用不同功能标识的方式，对消费者的知情权和选择权进行充分保障，由食品安全和卫生管理部门制定相应的标准、规范，同时增加相关食品检验机构的独立性[90]。
6 食用酵素产业未来展望
随着基因工程、发酵工程、酶工程和细胞工程等现代生物技术在食品工业中的应用范围越来越广，食用酵素等新型功能性食品的研发也逐步开始引入这些技术手段，以提高其在食品和健康领域的价值[91]。目前国外已有将食用酵素用于病毒感染、高血脂和高血压等疾病防治的先例[65]，而我国人口众多，随着大众对健康的日益重视以及对酵素功效的进一步了解，酵素产品的需求和研发具有很大的空间和潜力。在市场竞争激烈的当代，若想把握食用型酵素产品的发展机遇，相关行业人员应从以下方面考虑：
(1)从基础研究做起，微生物学、发酵工程、食品科学和传统医学等方面的人才通力合作，逐步摆脱对外来引进技术的依赖，建立起拥有自主知识产权的创新型酵素产业[92]。
(2)随着食用酵素产业的不断发展，单一酵素已难以满足人们对健康的需求，而复合酵素和螯合酵素则比较符合未来食用酵素产业的研发趋势，通过各种酵素的协同作用可达到“1+1>2”的效果[65]。
(3)采用宏基因组学和高通量测序等技术全面分析食用酵素生产过程中的微生物变化，为开发和应用功能性食品微生物奠定基础，以期在未来实现酵素的可控发酵，稳定酵素产品的质量并提高发酵效率[5]。
(4)液态酵素有易受杂菌污染、存储过程活菌依然在代谢等缺点，不易保存和运输，所以可采用冷冻干燥技术将液态酵素制成新型固态酵素，使营养物质的生物活性得到较好保持，多种维生素和膳食纤维也可以更好地发挥作用。同时固态酵素运输方便、易于储存，是未来食用酵素发展的一个方向[37]。
(5)有关食用酵素生产工艺以及酵素产品定义分类的标准虽然已经制定并实施，但是国内关于食用酵素产品功效方面的相关标准法规仍未具体落实，因而需要酵素行业从业人员和相关行业协会加快填补这一方面的空白，以达到食用酵素产业的全方位监管和健康发展，让消费者放心。
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