新疆酿酒葡萄中赭曲霉毒素A来源菌的筛选及其产毒条件研究

赵昊1,全莉1,于佳俊2,张晓蒙2,马文瑞3,武运1*,薛洁2*

1(新疆农业大学 食品科学与药学学院,新疆 乌鲁木齐,830052)2(中国食品发酵工业研究院,北京,100015) 3(天津科技大学 生物工程学院,天津,300457)

摘 要 为筛选酿酒葡萄及根系土壤中赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)来源菌及其产毒条件,以新疆四大产区(焉耆盆地、吐哈盆地、天山北麓、伊犁河谷)酿酒葡萄和根系土壤为样品,进行微生物分离纯化和分子生物学鉴定,利用荧光紫外法初筛和酶联免疫法(enzyme-linked immunoassay, ELISA)复筛选择OTA来源菌,并通过单因素试验对其产OTA条件进行探究。筛选结果表明,样品中共分离出霉菌12株,其中,M2(黑曲霉Aspergillus niger)、M7(炭黑曲霉Aspergillus carbonarius)为OTA来源菌,M7产OTA含量较高;单因素结果表明,接种量、温度、酿酒葡萄有无损伤对炭黑曲霉产OTA能力的影响较为明显。该研究为构建葡萄酒OTA污染的预警机制提供了理论依据。

关键词 葡萄;根系土壤;赭曲霉毒素A;酶联免疫法;炭黑曲霉

新疆地区自古以来就是我国主要葡萄及葡萄酒产地,具备得天独厚的资源优势。近年来,随着新疆葡萄种植面积和葡萄酒企业数量的不断增多,新疆葡萄酒产业得到了极大的发展,并逐渐成为新疆地区的经济支柱产业[1-2]。随着国民经济水平的提升,食品质量安全问题愈发严峻,这也制约着葡萄酒产业的发展[3-4]

众多真菌毒素中,赭曲霉毒素因其强烈的生物毒性和潜在的致病性而备受关注,其毒性仅次于黄曲霉毒素[5-6]。赭曲霉毒素是霉菌中某些曲霉属和青霉属菌种产生的有毒代谢产物,包括具有相似化学结构的A,B,C,D(α)4种化合物。同时具有基因毒性、神经毒性、致畸性、免疫毒性和胚胎毒性等[7-9]。赭曲霉毒素A具有热稳定性,即使在250 ℃高温加工下,也只能去除一小部分赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA),无法完全降解[10]。OTA对葡萄酒的污染会影响整个葡萄酒市场,对OTA的控制是一个亟待解决的问题。

经过大量研究证实,OTA广泛存在于谷物、水果、咖啡和葡萄酒中[11-14]。葡萄是易受OTA来源菌污染的农产品之一[15],OTA来源菌的污染、生长、产毒是葡萄酒中存在OTA残留的根本原因。目前,国内外关于新疆酿酒葡萄OTA来源菌分离筛选的相关文献不多。本研究以新疆四大产区(焉耆盆地、吐哈盆地、天山北麓、伊犁河谷)酿酒葡萄和根系土壤为样品,进行OTA来源菌的筛选及分离,并对其产毒条件进行探究,为构建葡萄酒OTA污染的预警机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与培养基

葡萄样品:赤霞珠和霞多丽,采自新疆四大产区(焉耆盆地、吐哈盆地、伊犁河谷、天山北麓)的健康和损伤葡萄。

土壤样品:葡萄园区根系土壤,采集新疆四大产区酒庄葡萄种植园区的葡萄根系土壤。

酵母膏胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)液体培养基、马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrase agar,PDA)培养基、孟加拉红培养基、察氏培养基。

霉菌DNA提取试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;霉菌通用引物(ITS 1和ITS 4),上海生工生物工程技术服务有限公司;琼脂糖,Biowest Agarose;Gold View,Sigma;改良式血球计数板,上海化科实验器材有限公司。

1.2 仪器与设备

BX51荧光显微镜,OLYMPUS中国有限公司;电泳仪,北京六一仪器厂;LRH-250生化培养箱,上海恒科仪器有限公司;Multiskan FC酶标仪,上海天能科技有限公司;PHS-3CpH计,上海精密科学仪器有限公司;高压灭菌锅,上海申安医疗器械厂;SW-CJ-2FD超净工作台,苏州净化设备有限公司;DHZ-B全温振荡器,太仓市豪威实验仪器制造有限公司;BioSpec-nano核酸蛋白检测仪,德国Eppendorf公司;紫外成像系统、PCR仪,Bio-Rad。

1.3 实验方法

1.3.1 样品采集

葡萄样品:用体积分数为75%的酒精擦拭手套后,均匀、随机地于该品种种植区东、南、西、北、中5点取样,每点取正常酿酒葡萄和落败酿酒葡萄各1.0 kg,放置于无菌的密封袋中,制作标签记录样品采集时间、地点、葡萄品种。

土壤样品:用体积分数为75%的酒精擦拭铁钎,均匀、随机地挖取葡萄园区葡萄藤根部20 cm土壤,放置于无菌密封袋,制作采样标签记录样品采集时间、地点。

1.3.2 霉菌的分离纯化

土壤样品:称取1 g土壤加入99 mL无菌生理盐水中,以180 r/min在28 ℃下振荡24 h,后续步骤参考雷纪峰[16]的方法。

1.3.3 荧光紫外法初步筛选疑似产OTA霉菌

将分离纯化好的霉菌转接到察氏培养基上,倒置于28 ℃恒温培养箱培养72 h,在460 nm紫外灯照射下,以不接种的相应平板作对照,观察平板上是否能够产荧光。

1.3.4 ELISA法确定OTA来源菌

挑选出能产绿色或者黄绿色荧光的霉菌接种到察氏培养基上28 ℃培养7 d,加15 mL甲醇并用封口膜封住平皿,来回晃动平皿5 min,放置于遮光环境下浸提3 h。用0.22 μm滤膜过滤提取液,提取整个平板的毒素,用酶联免疫(enzyme-linked immunoassay,ELISA)试剂盒法测霉菌浸提液OTA含量,确定OTA来源菌株,具体步骤参照全莉等[17]的方法。

1.3.5 OTA来源菌的形态观察

将分离纯化的菌株滴落于载玻片上,在显微镜下观察菌体形态,进行初步鉴定。

1.3.6 OTA来源菌ITS rDNA序列鉴定

1.3.6.1 DNA提取

用霉菌DNA提取试剂盒对分离纯化的霉菌DNA进行提取,提取步骤按试剂盒说明书进行。

1.3.6.2 ITS rDNA PCR扩增

具体步骤参照耿晓杰等[18]的方法,并通过DNA浓度检测和琼脂糖凝胶电泳确定DNA浓度及ITS区域(400~800 bp)是否获得了目的片段。

1.3.6.3 序列分析

将PCR引物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序结果在美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中进行BLAST对比分析,通过与Genbank数据库中已知序列进行同源性比对确定待测菌株种属。

1.3.7 OTA来源菌接种至酿酒葡萄方法

1.3.7.1 OTA来源菌悬液的制备

具体步骤参照彭娅萍[19]的方法,最终稀释菌悬液孢子至106、107、108 个/mL备用,每个试验处理做3个重复。

1.3.7.2 OTA来源菌的接种

取200 g无损伤、大小均匀的整串酿酒葡萄置于体积分数为75%的乙醇中1 min,浸泡后用无菌水清洗2~3次,待葡萄表面干燥后接种。

将干燥后的酿酒葡萄,用一次性注射器在每个洗净、干燥的酿酒葡萄表面穿刺2~3个针孔,刺入深度2 mm,针孔直径约0.5 mm,为损伤酿酒葡萄。

分别将200 g洗净、干燥酿酒葡萄和损伤酿酒葡萄浸泡浓度为106、107、108 个/mL的炭黑曲霉菌悬浮液中,浸泡5 min后移出至250 mL的烧杯中,用封口膜密封,每天取样观察葡萄感染情况,检测炭黑曲霉产OTA情况。

1.3.8 OTA来源菌产OTA条件的研究

选取产OTA量较高的菌株进行单因素试验。

1.3.8.1 温度对OTA来源菌产OTA的影响

将接种量为107 个/mL的无损酿酒葡萄放置于恒温恒湿培养箱中,控制相对湿度为75%,光照条件为光暗交替,温度设为18、28、38 ℃。每隔24 h,连续7 d 测OTA含量。

1.3.8.2 相对湿度对OTA来源菌产OTA的影响

将接种量为107 个/mL的无损酿酒葡萄放置于恒温恒湿培养箱中,控制温度为28 ℃,光照条件为光暗交替,相对湿度设为65%、75%、85%。在培养后每隔24 h,连续7 d测OTA含量。

1.3.8.3 接种量对OTA来源菌产OTA的影响

分别将接种量为106、107、108 个/mL的无损酿酒葡萄置放于恒温恒湿培养箱中,控制温度为28 ℃,光照条件为光暗交替,相对湿度设为75%。在培养后每隔24 h,连续7 d 测OTA含量。

1.3.8.4 光照条件对OTA来源菌产OTA的影响

将接种量为107个/mL的无损酿酒葡萄放置于恒温恒湿培养箱中,控制温度28 ℃,相对湿度设为75%,光照条件设为光照、光暗交替、避光。在培养后每隔24 h,连续7 d 测OTA含量。

1.3.8.5 葡萄有无损伤对OTA来源菌产OTA的影响

分别将接种量为107 个/mL的无损酿酒葡萄和损伤酿酒葡萄放置于恒温恒湿培养箱中,控制温度为28 ℃,光照条件为光暗交替,相对湿度设为75%。在培养后每隔24 h,连续7 d 测OTA含量。

1.3.8.6 样品OTA测量方法

每次取酿酒葡萄10 g于10 mL离心管中,用灭菌过的玻璃棒进行破碎处理,离心后采用ELISA试剂盒法参照1.3.4小节的方法测OTA含量。

1.4 数据分析

试验数据处理运用Excel 2018、Origin 8.5及SPSS 19.0软件。

2 结果与分析

2.1 霉菌分离情况

采用PDA 培养基和孟加拉红培养基对葡萄及根系土壤中的真菌进行分离。在葡萄果实中分离到25个单个菌落真菌,在葡萄根系土壤中分离到5个单个菌落,说明葡萄果实更易被有害菌污染。将分离出霉菌接种至PDA培养基进行二次分离纯化,通过镜检排除酵母菌,最终收集12株不同形态的霉菌,图1为部分霉菌分离纯化后的形态。

图1 部分霉菌的菌落形态图
Fig.1 Colony morphology of partial molds

2.2 OTA来源菌的筛选及形态观察

通过荧光紫外法初筛,12株霉菌中有3株产荧光,占25.0%。将3株产荧光的霉菌单点接种至胡萝卜琼脂培养基上28 ℃培养7 d,提取整个培养基毒素,用ELISA试剂盒检测提取液OTA含量,1株确定为假阳性,其余2株产OTA,标号为M2和M7,OTA产量如表1所示。

图2为M2和M7在显微镜下细胞形态,2株霉菌的细胞形态有典型的帚状分支,分生孢子梗做二三次分支,分生孢子链呈分散柱状,具有典型的曲霉细胞形态,呈黄褐色、黑色,中心呈青黄色或红褐色,边缘白色,质地丝状、絮状较紧实,菌株边缘有较多气生菌丝,反面土黄色,菌落大小约40 mm。这与OTA来源菌主要以青霉和曲霉属为主的相关文献报道一致,雷纪锋等[6]从宁波地区的农庄葡萄中筛选出了8株OTA来源菌,包括5株青霉和3株曲霉;彭娅萍等[9]从江苏镇江市句容葡萄园的葡萄、土壤及枝叶中筛选出3株OTA来源菌,为青霉和曲霉。

表1 产荧光菌株生成OTA的含量
Table 1 OTA concent produced by fluoresce strains

菌株编号OTA含量/(μg·L-1)M211.63M50.00M70.37

a-菌株M2;b-菌株M7
图2 两株OTA来源菌细胞形态图
Fig.2 Cell morphology of two OTA-derived strains

2.3 霉菌ITS rDNA序列鉴定

2.3.1 霉菌ITS rDNA区域扩增结果

以OTA来源菌DNA为模板,对ITS区域特异性扩增后的产物进行电泳后在凝胶成像系统下进行观察,结果如图3所示。2株OTA来源菌特异性片段扩增结果良好,条带清晰且唯一,分子量约为600 bp,符合DNA测序要求,可以送至生物公司测序。

1-对照;2-Marker
图3 两株OTA来源菌ITS rDNA扩增琼脂糖 凝胶电泳图
Fig.3 Agarose gel electrophoresis of two strains of OTA ITS rDNA amplified by agarose gel electrophoresis

2.3.2 BLAST比对结果

OTA来源菌测序结果经BLAST比对,结果如表2所示。霉菌M2和M7分别为黑曲霉Aspergillus niger和炭黑曲霉Aspergillus carbonarius,与菌株形态观察结果基本一致。

表2 OTA来源菌测序结果比对
Table 2 Comparison of sequencing results of OTA- derived bacteria

菌株编号可信度/%所属菌种M299黑曲霉(Aspergillus niger)M799炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)

2.4 不同温度条件下炭黑曲霉感染酿酒葡萄产OTA情况

不同温度条件下,炭黑曲霉感染赤霞珠、霞多丽葡萄产OTA情况如图4所示。

a-赤霞珠葡萄;b-霞多丽葡萄
图4 不同温度炭黑曲霉感染赤霞珠葡萄和 霞多丽葡萄OTA含量的变化
Fig.4 Changes of OTA content in Cabernet Sauvignon and Chardonnay grape infected by A.carbonarius at different temperatures

由图4-a可知,不同温度条件下,感染炭黑曲霉的赤霞珠葡萄OTA含量明显高于未感染的对照组;28、38 ℃条件下,感染炭黑曲霉的赤霞珠葡萄在第3~6天产OTA能力较强,在第4天产OTA量达到峰值,分别为1.82和1.64 μg/L,产OTA能力呈先上升后快速降低的趋势;18 ℃条件下,感染炭黑曲霉的赤霞珠葡萄产OTA能力较为均衡,平均含量为0.78 μg/L,说明18 ℃时炭黑曲霉菌株的产OTA能力低于28和38 ℃;18 ℃时,被感染的赤霞珠OTA产量明显较低,这可能与低温条件不适宜霉菌生长代谢有关;由图4-b可知,不同温度条件下,感染炭黑曲霉的霞多丽葡萄OTA含量明显高于未感染的对照组;18、28、38 ℃条件下,感染炭黑曲霉的霞多丽葡萄在第2~5天产OTA能力较强,第3天达到峰值,产OTA能力均呈逐渐上升后降低的趋势;温度为18 ℃时,被感染的霞多丽OTA产量略低于温度28、38 ℃,但差异不大。

以上结果表明,不同温度条件下,炭黑曲霉感染酿酒葡萄产OTA能力存在明显差异且显著高于对照组。炭黑曲霉在赤霞珠葡萄上的产OTA量略低于在霞多丽葡萄上的产OTA量;接种第3天,霞多丽葡萄OTA含量出现峰值且平均含量为1.75 μg/L,接种第4天,赤霞珠葡萄OTA含量出现峰值且平均含量为1.46 μg/L,说明成熟的霞多丽葡萄比赤霞珠葡萄更易感染炭黑曲霉,并且霞多丽葡萄产OTA量高于赤霞珠葡萄的产OTA量;温度为18 ℃时,炭黑曲霉在赤霞珠、霞多丽葡萄上的产OTA量均较低,说明低温一定程度抑制了炭黑曲霉的产OTA能力;观察葡萄表面感染情况时,发现温度为38 ℃时,酿酒葡萄易明显发生感染杂菌的情况,可能与细菌在38 ℃时存活能力较强有关。

2.5 不同湿度条件下炭黑曲霉感染酿酒葡萄产OTA情况

不同湿度条件下,炭黑曲霉感染赤霞珠、霞多丽葡萄产OTA情况如图5所示。由图5-a可知,不同湿度条件下,感染炭黑曲霉的赤霞珠葡萄OTA含量明显高于未感染对照组;感染炭黑曲霉的赤霞珠葡萄OTA含量由高到低为相对湿度85%>相对湿度75%>相对湿度65%,但总体差异不大;赤霞珠葡萄被感染的第4天产OTA量达到峰值,产OTA量呈先迅速上升后快速降低的趋势;由图5-b可知,不同湿度条件下,感染炭黑曲霉的霞多丽葡萄明显高于未感染的对照组;感染炭黑曲霉的霞多丽葡萄OTA含量由高至低为相对湿度85%>相对湿度75%>相对湿度65%,但差异不明显;霞多丽葡萄被感染的第3天产OTA量达到峰值,产OTA量同样呈先迅速上升后快速降低的趋势。

总的来说,不同湿度条件下,炭黑曲霉感染酿酒葡萄产OTA能力存在的差异不明显,但显著高于;炭黑曲霉在赤霞珠葡萄上的产OTA量略低于在霞多丽葡萄上的产OTA量;感染第3天,霞多丽葡萄产OTA量出现峰值,感染第4天,赤霞珠葡萄产OTA量出现峰值,说明成熟的霞多丽比赤霞珠葡萄更易感染炭黑曲霉并产OTA;随着相对湿度逐渐增加,炭黑曲霉在赤霞珠、霞多丽葡萄上的产OTA量也逐渐增加,但增加差异不明显,说明较高的湿度环境中,炭黑曲霉更易感染酿酒葡萄并产OTA;观察葡萄表面感染情况时,发现各湿度条件下,酿酒葡萄陆续出现感染杂菌的情况,说明高湿度时成熟葡萄容易被微生物感染,但组间差异不明显,可能与相对湿度设置均较高有关。

a-赤霞珠葡萄;b-霞多丽葡萄
图5 不同湿度炭黑曲霉感染赤霞珠葡萄和 霞多丽葡萄OTA含量的变化
Fig.5 Changes of OTA content in Cabernet Sauvignon and Chardonnay grape infected by A.carbonarius with different humidity

2.6 不同接种量条件下炭黑曲霉感染酿酒葡萄产OTA情况

不同接种量条件下,炭黑曲霉感染赤霞珠、霞多丽葡萄产OTA情况如图6所示。由图6-a可知,不同接种量条件下,被感染的赤霞珠葡萄OTA含量明显高于对照组;炭黑曲霉菌悬液孢子数越高,被感染的赤霞珠葡萄OTA含量就越高;赤霞珠葡萄被感染的第4~5天产OTA量最高;被感染的赤霞珠葡萄产OTA量总体呈先上升后降低的趋势,炭黑曲霉菌悬液孢子数为108个/mL时,被感染赤霞珠葡萄OTA含量降低不明显;由图6-b可知,不同接种量条件下,被感染的霞多丽葡萄OTA含量明显高于对照组;炭黑曲霉菌悬液孢子数越高,被感染的霞多丽葡萄OTA含量就越高;赤霞珠葡萄被感染的第2~4天产OTA量较高,炭黑曲霉菌悬液孢子数为108个/mL时,被感染的霞多丽葡萄OTA含量显著高于菌悬液孢子数为106个/mL;被感染的霞多丽葡萄产OTA量总体呈先上升后降低的趋势,但炭黑曲霉菌悬液孢子数为108个/mL时,被感染霞多丽葡萄OTA含量降低不明显。

a-赤霞珠葡萄;b-霞多丽葡萄
图6 不同接种量下炭黑曲霉感染赤霞珠葡萄和 霞多丽葡萄OTA含量的变化情况
Fig.6 Changes of OTA content in Cabernet Sauvignon and Chardonnay grape infected by A.carbonarius at different inoculation amounts

总的来说,不同接种量条件下,炭黑曲霉感染酿酒葡萄产OTA能力存在明显差异,且被感染的酿酒葡萄OTA含量显著高于对照组;炭黑曲霉菌悬液孢子数与被感染的酿酒葡萄OTA含量呈正相关;被感染的酿酒葡萄OTA含量随感染时间增加呈先上升后下降趋势,但炭黑曲霉菌悬液孢子数为108个/mL时,被感染霞多丽葡萄OTA含量降低不明显;观察葡萄表面感染情况时,发现黑曲霉菌悬液孢子数为108个/mL时,酿酒葡萄几乎没有感染杂菌。

2.7 不同光照条件下炭黑曲霉感染酿酒葡萄产OTA情况

不同光照条件下,炭黑曲霉感染赤霞珠、霞多丽葡萄产OTA情况如图7所示,由图7-a可知,不同光照条件下,感染炭黑曲霉的赤霞珠葡萄OTA含量明显高于未感染的对照组;黑暗条件下的赤霞珠葡萄感染炭黑曲霉后OTA含量明显高于光照条件下的赤霞珠葡萄,而光暗交替条件下赤霞珠葡萄感染炭黑曲霉后OTA含量居中;赤霞珠葡萄被感染的第3~5天产OTA量较高,最高为黑暗条件下第4天,OTA含量为1.72 μg/L;另外,赤霞珠葡萄被感染后OTA含量均呈先上升后降低的趋势,感染组和对照组感染杂菌情况较少;由图7-b可知,不同光照条件下,感染炭黑曲霉的霞多丽葡萄OTA含量明显高于未感染的对照组;被感染的霞多丽葡萄OTA含量由高到低为黑暗环境>黑暗交替环境>光照环境;霞多丽葡萄被感染的第2~4天产OTA量较高,最高为黑暗条件下第3天,OTA含量为2.35 μg/L;另外,被感染的霞多丽葡萄OTA含量也呈先上升后降低的趋势。

a-赤霞珠葡萄;b-霞多丽葡萄
图7 不同光照下炭黑曲霉感染赤霞珠葡萄和 霞多丽葡萄OTA含量的变化情况
Fig.7 Changes of OTA content in Cabernet Sauvignon and Chardonnay grape infected by A.carbonarius under different illumination

以上结果表明,不同光照条件下的酿酒葡萄感染炭黑曲霉产OTA能力存在明显差异,且显著高于对照组;炭黑曲霉感染赤霞珠葡萄的OTA含量略低于霞多丽;黑暗条件下,炭黑曲霉感染酿酒葡萄的OTA含量明显高于光照条件下被感染的酿酒葡萄OTA含量,说明炭黑曲霉在光照条件下产OTA能力较弱;观察葡萄表面感染情况时,发现部分霞多丽葡萄感染杂菌。

2.8 炭黑曲霉接种至有无损伤酿酒葡萄上产OTA情况

炭黑曲霉感染有无损伤的赤霞珠、霞多丽葡萄产OTA情况如图8所示,由图8-a可知,感染了炭黑曲霉的赤霞珠葡萄OTA含量明显高于未感染的对照组;有损伤的赤霞珠葡萄感染炭黑曲霉后OTA含量明显高于无损伤的赤霞珠葡萄;有损伤赤霞珠葡萄被感染的第3天产OTA量达到峰值,无损伤赤霞珠葡萄被感染的第4天产OTA量达到峰值,产OTA量均呈先上升后降低的趋势;另外,对照组有损伤的赤霞珠葡萄OTA含量逐渐上升,可能与葡萄损伤后在接种过程中感染产OTA霉菌有关;由图8-b可知,感染了炭黑曲霉的霞多丽葡萄OTA含量明显高于未感染的对照组;有损伤的霞多丽葡萄感染炭黑曲霉后OTA含量明显高于无损伤的赤霞珠葡萄,说明成熟酿酒葡萄损伤后更易感染炭黑曲霉菌;有损伤霞多丽葡萄被感染的第2天产OTA量达到峰值,无损伤赤霞珠葡萄被感染的第3天产OTA量达到峰值,产OTA量呈先上升后降低的趋势;同样,对照组有损伤的霞多丽葡萄OTA含量逐渐上升,可能与取样过程感染OTA来源霉菌有关。

a-赤霞珠葡萄;b-霞多丽葡萄
图8 炭黑曲霉感染有无损伤赤霞珠葡萄和 霞多丽葡萄OTA含量的变化情况
Fig.8 Changes of OTA content in Cabernet Sauvignon and Chardonnay grape infected by A.carbonarius without damage

以上结果表明,有无损伤的酿酒葡萄感染炭黑曲霉产OTA能力存在的差异十分明显,且显著高于对照组;炭黑曲霉在赤霞珠葡萄上的产OTA量略低于在霞多丽葡萄上的产OTA量;有损伤赤霞珠、霞多丽葡萄产OTA量比无损伤赤霞珠、霞多丽葡萄产OTA量出现峰值的日期提前了一天,且有损伤的酿酒葡萄OTA含量呈逐渐上升趋势,说明有损伤的酿酒葡萄比无损伤的酿酒葡萄更易感染炭黑曲霉并产OTA;观察葡萄表面感染情况时,发现有损伤的酿酒葡萄明显感染杂菌。

3 结论

通过对新疆地区不同产区葡萄品种和根系土壤中霉菌的分离,共分离出霉菌12株,这其中有3株产黄绿色荧光,经检测有2株为OTA来源菌,分别A.nigerA.carbonarius,且炭黑曲霉产OTA含量较高;单因素试验结果表明,接种量、温度、酿酒葡萄有无损伤这几个条件对炭黑曲霉产OTA能力的影响较为明显,各条件下,炭黑曲霉感染成熟霞多丽葡萄的OTA含量高于炭黑曲霉感染赤霞珠葡萄的OTA含量且OTA含量基本呈现先上升后降低的趋势,这与霉菌更易感染果皮较薄且酸度较低、含糖量较高的酿酒葡萄有关[20]。因此,对于酒庄来说,本研究可为构建葡萄酒OTA污染的预警机制提供理论依据。

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Ochratoxin A-producing microbes in wine grapes in Xinjiang: Identification and formation condition

ZHAO Hao1, QUAN Li1, YU Jiajun2, ZHANG Xiaomeng2, MA Wenrui3, WU Yun1*, XUE Jie2*

1(Department of Food Science and Pharmacy, Xinjiang Agriculture University, Urumqi 830052, China) 2(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 10015, China) 3(College of Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Abstract The present study aims to screen ochratoxin A(OTA)-producing microbes in wine grapes and root soil, and to identify the OTA production conditions. Wine grapes and root soil from four major producing areas in Xinjiang (Yanqi basin, Tuha basin, North foot of Tianshan mountain, Yili river valley) were used for microbial separation and purification, and molecular biology identification were performed. Thus, the OTA contents were determined strains were selected using fluorescence UV primary screening and enzyme-linked immunoassay (ELISA) secondary screening, and the single-factor experiment was used to explore the OTA production conditions. 12 strains of molds were isolated, of which M2 (Aspergillus niger) and M7 (Aspergillus carbonarius) were identified as OTA-producing strains, and the yield of OTA by M7 was higher. The inoculum size, incubation temperature, and mechanical injury of the wine grapes had was significant related to OTA production capacity of A. niger.

Key words grape; root soil; ochratoxin A; enzyme-linked immunoassay; Aspergillus carbonarius

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023606

引用格式:赵昊,全莉,于佳俊,等.新疆酿酒葡萄中赭曲霉毒素A来源菌的筛选及其产毒条件研究[J].食品与发酵工业,2020,46(19):35-41.

ZHAO Hao, QUAN Li, YU Jiajun, et al. Ochratoxin A-producing microbes in wine grapes in Xinjiang: Identification and formation condition[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(19):35-41.

第一作者:硕士研究生(武运教授和薛洁教授级高级工程师为共同通讯作者,E-mail:764630324@qq.com;825728388@qq.com)

基金项目:新疆维吾尔自治区重大科技专项(2017A01001-2);北京市科技计划课题(Z191100004019018)

收稿日期:2020-02-12,改回日期:2020-04-30