目前，高血压成为危害我国居民健康的常见疾病之一，我国成人高血压患者达2.45亿，高血压前期患者高达4.35亿[1]。为治疗高血压，研究者开发出抑制血管紧张素转化酶(angiotensin-I converting enzyme,ACE)活性的降压药物，尽管药物有明确药效，但会引发皮疹、咳嗽、味觉障碍等副作用[2-4]。由于食源ACE抑制肽具有高安全性、高耐受性等优点，因而成为预防与治疗高血压的研究热点[5]。

研究发现，氧化应激与高血压密切相关。氧化应激通过干扰血压调节的信号通路，加剧血管内皮功能障碍[6]，攻击低密度脂蛋白导致胆固醇在血管壁沉积，促进高血压发生发展；另一方面，高血压加重血管损伤，促进细胞内自由基形成，加重氧化应激[7-8]。控制氧化应激对于缓解高血压有积极作用，因此，具有降压与抗氧化的双活性肽具有较高的研究价值。

目前，关于降压与抗氧化的双活性肽研究较少，多处于活性发现阶段，如GARCIA-MORA等[9]从扁豆蛋白水解物中发现具有降压与抗氧化的双活性肽；TANZADEHPANAH等[10]合成出具有降压与抗氧化的活性肽KDEDTEEVP和KDEDTEEVH。有关降压与抗氧化的双活性肽的构效关系与作用机制研究较少，有必要开展相关研究。

芝麻蛋白是抗氧化肽与ACE抑制肽的前体[11-12]。课题组前期从芝麻蛋白水解产生的多肽中，筛选出具有降血压与抗氧化的双活性肽QCKH。本文通过比较相似性指数分析法(comparative molecular similarity index analysis,CoMSIA)研究其降压与抗氧化活性的构效关系，并利用分子拼接分析其与人体血管紧张素蛋白转换酶(1O86)的结合位点，利用AdmetSAR和ToxinPred对其理化特性、代谢、安全性进行评价，随后开展环境稳定性研究，以期为后续结构修饰与应用提供理论参考，推动双活性肽构效关系研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-Tris(2-pyridyl)-S-triazine, TPTZ)、马尿酰-组氨酰-亮氨酸水合物(N-Hippuryl-His-Leu hydrate, HHL)、ACE、邻苯二甲醛(O-phthaldialdehyde, OPA)，美国Sigma-Aldrich公司；超滤膜UE003(截留分子质量3000 Da)、反渗透膜RO4，中科瑞阳膜技术有限公司；其他试剂，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TGL20M-Ⅱ高速冷冻离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；Infinite M酶标仪，瑞士Tecan集团有限公司；UV-6300双光束型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；XS205电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；LC-500型制备液相，杭州旭昱有限公司等。

1.3 试验方法

1.3.1 芝麻活性肽QCKH分离纯化与鉴定

低温芝麻饼粕采用索氏抽提脱油(溶剂为沸程30～60 ℃石油醚)后，按照袁东振等[13]方法从低温芝麻饼粕制备芝麻蛋白，参考周存山等[14]方法进行体外模拟消化，中和酶解液，冷却室温后，8 000 r/min离心30 min，取上清液采用UE003膜过滤，透过液随即利用反渗透膜RO4浓缩，采用LC-500制备液相分离并采用液质联用仪进行结构鉴定[11]，获得QCKH，其含量为0.037 2%。经蛋白质信息库检索，发现该肽段是芝麻7S globulin (ID：Q9AUD0_SESIN)中的DPELKQCKHQCKAQ 32～35的片段。

1.3.2 多肽设计与合成

为揭示QCKH的活性中心与构效关系，将该多肽分成2个区域：N端和C端，设计QC和KH，比较抗氧化与降血压活性，初步确立活性中心位置。随后在控制肽链长度的前提下，考察N末端、C末端、C端第2位氨基酸类型对活性影响，设计下面多肽SCKH、ACKH、FCKH、RCKH、ECKH、QCKR、QCKE、QCKD、QCDH、QCEH、QCED、QCIV，并固态合成(无锡亚肽公司合成)，纯度为95%。

1.3.3 构效关系建模

采用SYBYL-X软件中protein building模块将1.3.2中的多肽录入软件，多肽电荷模式采用MMFF94模拟，能量优化采用MMFF94力场的Powell共轭梯度算法(最大运算次数为10 000，能量优化终止标准0.000 5 kcal/mol Å)[11]。分别采用ACE抑制活性最高的SCKH、DPPH自由基清除能力最高的QCIV、ABTS阳离子自由基清除能力最高的QCKH为模板，C为骨架，构建CoMSIA模型，分子叠加图见图1。偏最小二乘法(partial least squares,PLS)和留一法交叉验证程序(leave-one-out cross validation,LOO)对构效模型进行评价，模型成立的标准是：交叉验证系数(Q2)>0.5，误差预测标准差(R2)>0.6[15]。

1.3.4 分子拼接

为揭示QCKH抑制ACE活性的途径，通过分子拼接软件Molecular Operating Environment 2015 (MOE 2015)分析QCKH与人体血管紧张素蛋白转换酶中氨基酸残基结合情况。从RCSB PDB网站(https://www.rcsb.org/structure/1O86)下载含有赖诺普利的人体血管紧张素蛋白转换酶的PDB文件,导入MOE 2015软件，质子化后，除去水分子，作为模板，打开MOE 2015中Dock模块，将QCKH作为配体载入，拼接方法设置为Proxy Triangle，优化设置为Rigid Receptor，得分方式选用London dG和GBV/WSA dG，从30个构型中选取5个最佳构型[16]。

1.3.5 QCKH生理活性与安全性预测

QCKH的生理活性采用AdmetSAR2.0 (http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2/)预测，选取人体肠道吸收(human intestinal absorption，HIA)和人体口服生物利用度(human oral bioavailability，HOB)表征吸收特性，选取血脑屏障(blood-brain barrier penetration，BBB)、血浆蛋白结合率(plasma protein binding，PPB)、P-糖蛋白底物与抑制剂来表征分布特性，选取细胞色素450(cytochrome P450，CYP)底物与抑制活性表征代谢特性，选取致癌性和急性经口毒性表征毒性[17]。此外，对毒性及理化特性还采用ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in /raghava/toxinpred/design.php)预测，预测方法基于Swiss-Prot[18]。

1.3.6 QCKH稳定性试验

1.3.6.1 热稳定试验

将QCKH配制成2 mg/mL的测试液，分别置于30、40、50、60、70、80、90和100 ℃水浴加热3 h，冷却至室温，测定DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率、ACE抑制率。

1.3.6.2 酸、碱稳定性试验

配制2 mg/mL QCKH溶液，分别调节pH为2、4、6、8、10和12，在20 ℃静置3 h，测定其DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率、ACE抑制率。

1.3.6.3 紫外线稳定性试验

配制2.0 mg/mL的QCKH溶液，置于15 W紫外灯(257 nm)下10 cm处，室温下照射48 h，每隔4 h，测定其DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率、ACE抑制率[19]。

1.3.7 抗氧化活性测定

采用DPPH自由基和ABTS阳离子自由基自由基清除率来评价多肽抗氧化活性，参照LU等[11]的方法，测定多肽溶液的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率，利用SPSS 25中probit模块计算IC50，即自由基清除率达到50%对应的多肽浓度。

1.3.8 ACE抑制活性测定

参考LI等[20]的方法，取20 μL的多肽溶液与40 μL ACE(12.5 mU/mL)和40 μL 4.66 mmol/L HHL溶液(0.4 mmol/L pH 8.5磷酸缓冲液含0.6 mol/L NaCl)混合，在37 ℃反应1 h后，加入150 μL 1.2 mol/L NaOH溶液终止反应，再加入40 μL体积分数 2%的OPA甲醇溶液室温反应20 min，随后加入40 mL 6 mol/L HCl溶液终止反应。将反应液按体积比1∶15 加入蒸馏水稀释后，倒入荧光比色皿，设定激发波长340 nm，发射波长455 nm，狭缝宽度5 nm，测定荧光强度。按照公式(1)计算ACE抑制率：

ACE抑制率

(1)

式中：a,含有多肽、ACE和HHL溶液的荧光强度;b,ACE和HHL溶液的荧光强度;c,多肽和HHL溶液的荧光强度;d,HHL溶液的荧光强度。

测定系列多肽浓度对应的ACE抑制率采用SPSS 25中probit计算IC50，即抑制ACE活性50%时，对应的多肽浓度。

1.3.9 数据处理

无特殊说明，所有试验平行测定3次。单因素方差分析由SPSS 25(Duncan算法)运算，显著水平0.05，高度显著水平0.01。同一曲线上带有相同小写字母的数据间在0.05水平无显著差异。

2 结果与分析

2.1 QCKH构效关系

结合前人研究，分析QCKH的氨基酸组成，推测Cys2与His4可能与QCKH的抗氧化活性相关，Cys的巯基与His的咪唑基提供孤对电子给自由基，中和自由基反应，起到抗氧化作用[21-22]。另外，前人报道ACE抑制肽等[23-26]，表明QCKH中Lys3和His4对其降压活性可能起作用。

为验证上述推测，合成QC与KH并检测活性，结果显示QC与KH均有ACE抑制与抗氧化活性，这表明以上2种多肽片段均对QCKH的活性有贡献(表1)。相较于QCKH的ACE抑制活性与抗氧化活性，QC与KH的抗氧化活性均弱于QCKH，上述结果说明QC与KH结合形成QCKH的空间结构与电荷分布提升了抗氧化活性。

根据Q2和R2，基于ACE抑制活性与DPPH自由基清除能力构建的QCKH的CoMSIA模型成立，而基于ABTS阳离子自由基清除能力构建的CoMSIA模型的Q2值与0.5接近，其准确性较差，故不予考虑(表2)。

分析结构因素对降压与抗氧化的影响发现，氢键是影响QCKH降压与抗氧化活性的首要因素，该结果与管骁等[27]研究结果部分相符。推测QCKH中氨基酸残基通过氢键与ACE的活性位点结合，改变其空间结构，造成ACE难以与人体血管紧张素1结合，起到抑制作用。同时，QCKH的氨基酸残基经氢键与自由基连接，通过共振稳定自由基结构，起到抗氧化作用[28]。电荷极性对QCKH的ACE抑制影响大于DPPH自由基清除，这可能是多肽的电荷极性会影响与ACE活性中心Zn2+结合，导致在ACE抑制活性上产生差异[29]。QCKH及其衍生肽均是4肽，分子尺寸较小，易于进入ACE与其活性位点结合，同时，由于结构简单，活性基团暴露，易于DPPH自由基结合，导致QCKH空间位阻的影响较低。

QCKH的氨基酸残基通过氢键、电荷极性、疏水作用、空间位阻对ACE抑制活性与DPPH自由基清除能力的影响见图2～图6。在图2中，氢键供体在绿色区域有利于提高ACE抑制活性与抗氧化活性，而氢键供体在红色区域不利于提高活性，由此推知，C末端氨基酸残基侧链被氢键供体基团取代可以提高ACE抑制(图2-a)，这可能是QCKH的ACE抑制活性强于QCKE的原因，QCKE中Glu4的侧链上羰基是氢键受体，QCKH中His4侧链为咪唑基是氢键供体。在N端氨基酸残基侧链顶端有氢键供体，有利于提高DPPH自由基清除能力，这与DPPH自由基中氢键受体硝基有关。通过分子间氢键，多肽能更加稳定与DPPH连接，为后续发生电子转移提供有利条件。

在图3中，氢键受体在绿色区域有利于提高ACE抑制和DPPH自由基清除活性，反之，在红色区域不利于ACE抑制和DPPH自由基清除活性。C末端羧基中羰基对于提升QCKH的ACE抑制活性起到重要作用(图3-a)。

若要提高多肽的ACE抑制和DPPH自由基清除活性，绿色区域适宜带正电荷取代基，红色区域适宜带负电取代基。由图4可知，C端氨基酸的羧基被带正电基团取代会提高ACE抑制活性，推测通过阳离子-π相互作用，影响ACE中His383和Tyr523，增加抑制效果[30]。对于QCKH的抗氧化活性而言，Lys3侧链带正电荷是有利因素(图4-b)，这可能是在电荷斥力的作用下，使缺电子带正电的自由基避开上述基团，接近Cys2的巯基，加速反应进行，显示更强的抗氧化能力。QCKH的DPPH自由基清除能力强于QCDH也证实上述结论。

图5中，疏水基团出现在绿色区域内有利于提高ACE抑制和DPPH自由基清除活性，反之，在红色区域内出现会降低ACE抑制和DPPH自由基清除活性。由图5可知，N端和Lys3氨基酸残基侧链顶端含有疏水氨基酸有利于增强ACE抑制活性，这同前人报道N端为疏水性芳香氨基酸的ACE抑制肽活性较高的结论部分一致[31]。N端氨基酸残基的α-C附近区域为疏水基团有利于提升抗氧化活性，这可能是DPPH自由基为非极性自由基，当多肽N端有疏水基团时，更有利于两者通过疏水相互作用靠近，增加Cys2与DPPH反应机率。

图6中，小体积取代基出现在红色区域、大体积取代基出现在绿色区域都有利于提高ACE抑制和DPPH自由基清除能力。由图6-a可知，增加C端氨基酸残基体积，有利于提高ACE抑制活性。上述结论同UDENIGWE等[32]报道C端为大侧链氨基酸的ACE抑制肽有较高活性的结论一致。适当减少N端氨基酸氨基体积，更容易暴露Cys2的巯基基团，有利于提高多肽DPPH自由基清除能力(图6-b)。

2.2 QCKH的分子拼接

由图7-a可知，QCKH与降血压药物赖诺普利在ACE中的位置基本吻合。由图7-b可知，QCKH通过氢键与ACE上的Tyr520、Gln281、Lys511、His513、His353、Tyr523、Ala354、Ala356和Glu411结合，通过离子键同His387、Lys511、His353和Zn701结合，还通过芳烃键与Phe457、His353发生作用。前人报道，ACE催化活性受活性口袋S1(Ala354、Glu384、Tyr523)、S2(Gln281、His353、Lys511、His513、Tyr520)、S1′(Glu162)和活性中心Zn2+(His383、His387和Glu411)的影响[33]。由此可知，QCKH主要通过影响ACE活性口袋S1、S2和Zn2+的结构实现对ACE的抑制。His4的羧基作为氢键受体同Gln281，Tyr520，Phe512，Lys511发生作用，验证了2.1构效关系分析中C端适宜由氢键受体构成的结论。

2.3 QCKH生理活性与安全性预测

活性肽在体内产生有益功能，必须能被肌体吸收、输送与代谢，同时，还有低的毒副作用。因此，有必要评价QCKH的生理活性与安全性。由表3所示，QCKH可以经口吸收；在血液中，与血浆蛋白结合率低，这表明QCKH在血液中较稳定，有利于药效发挥；高血脑屏障、非细胞色素P450酶系底物(除CYP3A4)、无抑制细胞色素P450活性，这表明QCKH既不影响中枢神经，也不干扰正常的细胞活动；QCKH预测无致癌性与无毒性，安全性高。上述结果表明，QCKH可以作为功能因子应用于保健食品。然而，基于Lipinski类药五原则，QCKH氢键受体和可旋转键偏多，且脂水分配系数偏低，需要分子修饰以简化结构和提高脂溶性。

2.4 QCKH的环境稳定性

由图8可知，温度会显著影响QCKH的活性，其中对于抗氧化活性的影响要大于降压活性的影响。随着加热温度升高，QCKH的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力迅速下降，而降压活性下降较为平缓。产生上述变化的原因可能是QCKH的抗氧化活性主要受Cys2的影响，随着温度上升，性质活泼的巯基更易氧化脱氢，同时，还会形成分子间二硫键，从而降低抗氧化活性[34]。虽然QCKH的降压活性与巯基无关，但通过二硫键连接的二聚体，改变原有的空间结构并增加体积，从而削弱与ACE结合的能力，导致ACE抑制活性下降。

pH对QCKH活性影响的见图9。当pH<6时，QCKH的抗氧活性无显著差异，进入碱性环境时，QCKH的抗氧化活性显著下降。这可能是一方面QCKH在碱性条件下，发生消旋，从而引起肽链构象发生改变，影响活性[35]；另一方面，QCKH中Cys2巯基发生解离，从而降低活性[36]。与抗氧化活性不同，QCKH的ACE抑制活性在pH 8达到最强，随后呈现下降趋势。这可能与QCKH的等电点有关，QCKH的等电点为8.57，在pH为8时，大部分QCKH中His羧基为负电荷，由2.2小节可知，这有利于QCKH抑制ACE活性，然而，随着pH的继续升高，Gln1的氨基失氢，不能作为氢键供体，减弱与ACE结合能力，从而降低ACE抑制活性；加之，碱性导致肽链消旋，改变空间结构，也影响ACE抑制活性。

紫外照射对QCKH的活性影响见图10。随着紫外照射时间延长，QCKH的ACE抑制活性与抗氧化活性均显著下降。紫外线作用导致多肽外层电子从基态跃迁到激发状态，导致羟基、巯基、氨基上的氢发生电离，从而改变原有结构，影响活性[37]。此外，紫外线照射导致水分子裂解产生羟自由基[19]，也会加速QCKH抗氧化能力的消耗，从而导致出现抗氧化活性下降大于ACE抑制活性现象。

3 结论

综上所述，QCKH的抗氧化与降血压活性与Cys2和His4有关，经CoMSIA建模发现，QCKH的抗氧化与降血压活性主要受氢键、电荷极性、疏水作用影响。QCKH通过氢键与离子键与ACE的活性口袋S1和S2、活性中心Zn2+发生作用，改变ACE空间结构，起到抑制ACE活性的作用。ADMET预测QCKH可以经口吸收，不会干扰人体正常的生理活动，安全性高。分析环境因素影响发现，在常温、中性、避光条件下，QCKH的抗氧化与降血压活性基本稳定，且在环境因素作用时，QCKH降血压活性比抗氧化活性稳定。

在后续研究中，QCKH应通过分子修饰，以达到简化结构、提高脂溶性、改善肠道吸收能力；在加工过程中，应避免高温、极端pH与光照，以减少损耗。

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Study on structure-activity relationship, molecular docking and physicochemical properties of an ACE-inhibitory and antioxidant sesame peptide QCKH

LU Xin1,2, JIA Cong1,2, WANG Ruidan1,2, GAO Jinhong1,2, ZHANG Lixia1,2, SUN Qiang1,2, ZHAO Mouming3, HUANG Jinian1,2*

1(Center of Agricultural and Sideline Products Processing of Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China) 2(Henan Engineering Research Centre of Bioactive Substances in Agricultural Products, Zhengzhou 450002, China) 3(College of Light Industry and Food Science Technology, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Abstract In order to reveal the structure-activity relationship, mechanism of interaction with Angiotensin-I converting enzyme (ACE), physicochemical properties of an ACE-inhibitory and antioxidant peptide QCKH derived from sesame 7S globulin, comparative molecular similarity indices analysis (CoMSIA) was employed to explore the structure-activity relationship of QCKH. Then molecular docking was performed to identify the interaction sites of ACE with QCKH. Furthermore, the absorption and metabolism of QCKH were predicted. Finally, the effects of environmental factors on activity of QCKH were evaluated. Results showed the ACE-inhibitory and antioxidation of QCKH were related to His4 and Cys2, respectively. Hydrogen bond and electrostatic flied were dominated factors for ACE-inhibitory and antioxidation. Moreover, QCKH formed bonds with S1 pocket (Ala354, Tyr523), S2 pocket (Gln281, His353, Lys511, His513, Tyr520), active site Zn2+, His387 and Glu411 in its tetrahedral coordination, which changed the spatial structure of ACE and caused inhibition. QCKH was recognized as oral absorption, no interference with normal metabolism in vivo and high safety by ADMET prediction. And the activity of QCKH was stable under acid and neutral conditions, and remained stable below 60 ℃. However, it was sensitive to UV. The above results support the theoretical references for structural modification and application of QCKH.

Key words sesame 7S globulin; absorption and metabolism of prediction; safety evaluation; stability evaluation; amino acid residue

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.024327

引用格式:芦鑫，贾聪，王瑞丹，等.芝麻降压与抗氧化肽QCKH的构效关系、分子拼接及理化性质研究[J].食品与发酵工业,2020,46(19):70-77.

LU Xin, JIA Cong， WANG Ruidan, et al. Study on structure-activity relationship, molecular docking and physicochemical properties of an ACE-inhibitory and antioxidant sesame peptide QCKH[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(19):70-77.

第一作者：博士，助理研究员(黄纪念研究员为通讯作者， E-mail：hjinian@sina.com)

基金项目：中原科技领军人才项目(194200510014)；河南省科技攻关项目(202102110298)；国家特色油料产业技术体系(CARS-14)

收稿日期：2020-04-28，改回日期：2020-06-04