预处理是秸秆类生物质原料用于发酵工业的首要环节，目前主流的预处理方法有蒸汽爆破、稀酸法和稀碱法等[1-4]。其中效果较好的方法是稀碱法[5-6]，该方法很有希望用于工业生产[7]。而稀碱法预处理可破坏木质素和半纤维素间的化学键，相对于酸法预处理具有较强的脱木质素能力，且预处理过程中糖损失较少。木质纤维素预处理液中不仅含有抑制菌体生长的酚类、酸类、酮类和呋喃类等毒素[8-9]，而且对环境造成严重的污染。相对于碱法预处理，酸法预处理液由于木质素含量较低，所以颜色较浅，目前对酸法预处理液进行脱毒的研究较多[10-11]，但对碱预处理液脱毒工艺鲜见报道。
本研究以玉米秸秆为原料，采用稀碱预处理法，先加酸沉淀以去除碱溶性木质素，再以活性炭脱毒的方式将残留的毒素进一步去除，并将脱毒后的预处理液用于水解过程和丁醇发酵液，验证其脱毒效果，以建立从源头控制废水的“清洁生产”工艺。该工艺在预处理后没有废水排放，仅有副产物碱溶性木质素，而木质素可以用来生产硫化钠[12]、活性炭[13-14]、香兰素[15-16]、无毒型生物抑制剂，还可以用于塑料和橡胶混料体系中[17]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玉米秸秆，山东泽生生物科技有限公司；纤维素酶(滤纸酶活150 FPU/mL，最适pH 4.8)，青岛蔚蓝生物股份有限公司；其他化学试剂均购自国药集团。糖丁基梭菌(Clostridium saccharobutylicum DSM 13864)，德国DSMZ微生物菌种保藏中心。
1.2 仪器与设备
DNP-9162恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；CP3900气相色谱仪，美国瓦里安公司；LC1260高效液相色谱仪，安捷伦科技(中国)有限公司；GI54T立式高压灭菌锅，南京庚辰科学仪器有限公司；Centrifuge 5810型台式高速离心机，德国 Eppendorf 公司；FE28酸度计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HYL-C组合式摇床，江苏强乐实验设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 培养基配方
种子培养基[18](g/L)：牛肉膏10，酵母浸出粉10，可溶性淀粉1，葡萄糖5，NaCl 3，蛋白胨10，半胱氨酸盐酸盐0.5，乙酸钠3，调pH值至6.5，115℃高压蒸汽灭菌20 min。
发酵培养基[18](g/L)：玉米秸秆水解液(还原糖50)，玉米浆干粉10 ，CaCO3 4，(NH4SO4) 2，K2HPO4 0.5，MnSO4·H2O 0.01，调pH值至6.5，120℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.3.2 玉米秸秆的碱预处理方法及木质素的提取方法
取粉碎后玉米秸秆100 g，配制1L、1%(质量分数) NaOH溶液，以固液比1∶10(g∶mL)的比例混合，然后于立式高压灭菌锅中以120℃加热1 h，达到碱处理的效果。处理后过滤分离得预处理后秸秆和碱预处理液。预处理后秸秆用水冲洗至中性，置入烘干箱中60℃烘干，以备后续水解糖化实验。
收集碱预处理液分别添加一定量的稀H2SO4调节pH后，12 000 r/min离心5 min去除碱溶性木质素，上清稀释一定倍数后用分光光度计测OD420和OD280，以分析预处理液中抑制物的含量。
1.3.3 预处理液脱毒用于丁醇发酵
在15个100 mL三角瓶中分别加入6 g碱处理后的秸秆、48 mL碱预处理液，按梯度分别加入0、5、10、15、20 g/L的活性炭，每个梯度3个平行样，于立式高压灭菌锅中120℃处理20 min进行脱毒。而后在超净工作台中取样0.5 mL，12 000 r/min离心5 min，取上清液250 μL，稀释到20倍和400倍测量OD420和OD280。
在无菌环境中加入干热灭菌的CaCO31 g，将膜过滤除菌的纤维素酶(30 FPU/g秸秆)加入上述灭菌后的三角瓶中，水解36 h后在超净工作台按照10%的接种量接种C. saccharobutylicum DSM 13864。
1.4 分析方法
还原糖浓度的测定采用DNS法[19]，丁醇浓度的测定采用气相色谱法[20]。
预处理液中毒素含量用比色法来测定，将预处理液稀释20倍，OD420测定美拉德反应产物[21-22]，将预处理液稀释400倍，OD280测定酚类化合物含量[23]。
2 结果与分析
2.1 工艺流程
玉米秸秆碱预处理液脱毒工艺流程如图1所示。
图1 玉米秸秆碱预处理液脱毒工艺流程图
Fig.1 Detoxification process of alkali-pretreated solution of corn stover
2.2 碱预处理液的脱毒
2.2.1 碱预处理液木质素的去除
OD420和OD280被用来评估预处理液中抑菌物质美拉德反应产物和酚类物质的含量。由图2可知，随着H2SO4添加量增加，预处理液pH逐渐下降，OD420和OD280也不断下降；当H2SO4添加量达到9 g/L，pH为3.8左右时，OD280和OD420基本达到稳定；故选择pH 3.8作为去除碱溶性木质素的最适pH。碱溶性木质素沉淀后预处理液颜色深度明显降低，碱溶性木质素大量析出。
A-OD420；B-OD280
图2 不同H2SO4添加量对预处理液OD280 、OD420和pH的影响
Fig.2 Effects of adding different amounts of sulfuric acid on OD280，OD420 and pH of pretreatment solution
2.2.2 活性炭脱毒
加酸去除预处理液中碱溶性木质素的同时，也去除了一部分抑制菌体生长的毒素。为进一步去除预处理液中的毒素，采用了活性炭脱毒方法。比较了添加CaCO3缓冲pH值至5.0和不添加CaCO3条件下活性炭的脱毒情况(图3)。当不添加CaCO3时，溶液pH值为3.8，较添加CaCO3低，而低pH有利于活性炭的吸附[24]。因此，不添加CaCO3时活性炭的脱毒效果较好，尤其是苯酚类物质的脱毒效果较好(图3-B)。当活性炭添加量为15 g/L时，脱毒效果基本达到稳定，OD420(稀释20倍)为0.025，OD280(稀释400倍)为0.003 4。
A-OD420；B-OD280
图3 活性炭添加量对碱预处理液OD420和OD280的影响
Fig.3 Effect of activated carbon on OD420 and OD280of alkali-pretreated solution
2.3 碱预处理后玉米秸秆的水解糖化
当碱预处理液活性炭脱毒后，测定预处理液中含有少量还原糖(小于0.5 g/L)，因为在碱性条件下预处理水解的部分还原糖发生羟醛缩合反应生成羧酸，如乳酸和乙酸[25]。利用CaCO3作为pH缓冲剂加入预处理液与预处理好的秸秆混合并添加纤维素酶水解(图4)。当活性炭添加量不断提高，水解的还原糖略有提高。当活性炭质量浓度为20 g/L，水解36 h后还原糖质量浓度达到63.5 g/L。以柠檬酸钠缓冲液、不加活性炭为对照，36 h水解还原糖质量浓度为57.4 g/L。pH缓冲剂CaCO3和柠檬酸钠(对照，结果未显示)对水解的影响不大。由于秸秆水解过程固液比较大，过量CaCO3可控制pH值在5.0左右，所以选择CaCO3代替柠檬酸钠缓冲液(pH 4.8)作为pH缓冲剂。乳酸发酵过程中也常用CaCO3作为pH缓冲剂[26]。
对照1-不添加活性炭；对照2-活性炭添加量10g/L
图4 活性炭脱色对秸秆酶水解的影响
Fig.4 Effect of activated carbon on enzymatic hydrolysis of corn stover
2.4 碱预处理秸秆及预处理液脱毒用于丁醇发酵
将酶水解后的秸秆水解液(连同活性炭和未彻底水解的秸秆残渣)在无菌环境中接入丁醇发酵菌种C. saccharobutylicum DSM 13864种子液和灭菌的培养基浓缩液进行发酵(图5)。发酵72 h后测定发酵液中丁醇含量，不添加活性炭的水解液没有丁醇产生；随着活性炭浓度的加大，丁醇浓度逐渐升高；当活性炭质量浓度为15 g/L时，丁醇浓度趋于稳定，达到10.2 g/L，相对于葡萄糖对照组,丁醇产量提高了21%。
图5 碱预处理秸秆及脱毒后的预处理液用于丁醇发酵
Fig.5 Butanol fermentation using alkali-pretreated corn stover and detoxification pretreatment
3 结论
本研究基于源头控制的理念，将碱预处理液进行脱毒并用于秸秆水解和丁醇发酵过程，以减少废水排放。首先，在碱预处理液中加入9 g/L的H2SO4，pH 3.8 时，可沉淀预处理液中的碱溶性木质素。接着，对去除碱溶性木质素的碱预处理液进行活性炭脱毒，不同加量活性炭对秸秆的水解影响不明显，但对丁醇发酵影响较大。当活性炭添加量为15 g/L时，发酵72 h丁醇质量浓度达到最高10.2 g/L，而不添加活性炭脱毒的预处理液在发酵中不产丁醇。本研究工艺对利用秸秆进行无废制造生物燃料有一定的参考价值。
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