鱼精蛋白复配保鲜剂对南美白对虾的保鲜效果

南美白对虾(Penaeus vannamei)又名凡纳滨对虾，隶属于对虾科(Penaeidae)、对虾属(Penaeus)、Litopenaeus亚属，原产于中、南美洲太平洋沿岸的温暖水域，是世界三大养殖虾类之一，具有较好的营养价值[1]。该虾生长快、适应性强、产量高、品质好，是重要的水资源。但由于对虾特殊的生理生化特性，即含有大量的高活性多酚氧化酶和蛋白质，再加之虾肉中的含水量也很高[2-3]。因此对虾在死亡后易受到微生物的污染以及由于蛋白质等含氮物质的分解而产生大量的尸胺、组胺等有害物质而很快腐败变质[4-6]。同时其体内的多酚氧化酶也将催化酪氨酸等物质，产生一系列的生化反应，生成黑色素，从而使虾体表面出现黑斑，即黑变现象[7-8]。因此需要采取相应的措施来抑制对虾体内的酶活和微生物的生长繁殖，从而延缓对虾的腐败变质，延长其货架期。

鱼精蛋白是一种分子质量较小的球形碱性蛋白质。不仅是肝素唯一的拮抗剂，同时也具有良好的抑菌性，具有天然、无毒、安全等特点。其对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于革兰氏阴性菌，而食品包括各种虾类的腐败菌以革兰氏阴性菌为主，因此可将鱼精蛋白与其他保鲜剂复配使用，以提高鱼精蛋白的抑菌谱。壳聚糖是一种天然多糖，具有广谱抑菌作用、抗氧化作用和很好的成膜性，对假单胞菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌都具有很好的抑制效果。国内外对鱼精蛋白的应用研究侧重于医学领域，如抗凝血、运输药物的载体等，而在食品保鲜领域的应用研究并不多。本研究利用具有较好抑菌作用的鱼精蛋白作为保鲜剂，并与壳聚糖进行复配作为保鲜剂，分析南美白对虾在贮藏过程中的品质和理化指标的变化，探究其对南美白对虾的保鲜效果，不仅为南美白对虾的贮藏和保鲜技术提供理论支持，也为鱼精蛋白的高效利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活南美白对虾，购于临港新城农工商超市生鲜部；鱼精蛋白(来自暗纹东方鲀)，上海海洋大学食品学院实验室自制；壳聚糖(食品级)，浙江澳兴生物技术有限公司。

H3PO4、HClO4、KOH、NaOH、NaCl(均为分析纯)，国药集团上海化学试剂有限公司；KH2PO4、K2HPO4、甲醇(均为色谱纯)，上海安普实验科技股份有限公司；三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、AMP、IMP、次黄嘌呤(hypoxanthine，Hx)、肌苷(inosine，HxR)，美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

H2050R 高速冷冻离心机，长沙湘仪有限公司；AD200L-P数显高速分散均质机，上海标本模型厂；PHS-3C pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；LC-2010CHT HPLC仪，日本岛津公司；AUW320分析天平，日本岛津公司；UV-2100紫外-可见分光光度计，美国尤尼柯仪器有限公司；Kjeltec8400凯氏定氮仪，丹麦FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

将鲜活的南美白对虾用冰块低温致死，挑选无损伤且大小相近的虾((10±2)g)若干，浸泡在相应的保鲜剂中(表1)，10 min后取出，放在无菌密封袋中，4 ℃冰箱贮藏，各指标每2 d测1次。

1.3.2 pH值的测定

称取5 g碎虾肉，加入45 mL超纯水，均质60 s，静置30 min后过滤，测定其pH值。

1.3.3 硫代巴比妥酸值(TBA)的测定

参照FENG等[9]的方法，稍作修改。取5 g剁碎的虾肉，加入20%的三氯乙酸25 mL和超纯水20 mL，均质90 s，静置60 min后，于4 ℃、8 000 r/min离心10 min，过滤后定容至50 mL。滤液与0.02 mol/L的硫代巴比妥酸溶液以1∶1的体积比，沸水浴20 min，冷却。用紫外分光光度计于532 nm处测吸光度值A。TBA值用丙二醛的含量表示，

1.3.4 持水力的测定

参照孙卫青等[10]的方法，稍作修改。精确称取3 g虾肉，用滤纸包好，8 000 r/min离心10 min，取出样品，精确称量离心后虾肉的质量。持水力按公式(1)计算：

式中：m0，离心前虾肉的质量，g；m1，离心后虾肉的质量，g。

1.3.5 菌落总数(TVC)的测定

参照GB4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[11]对南美白对虾进行菌落总数的测定。称取5 g虾肉，加入45 mL灭菌生理盐水，选择3 个合适的稀释度，用平板计数琼脂计算虾肉中的菌落总数，每个稀释度倒两个平板，选取菌落数量为30～300 个的平板进行计数。培养温度为(30±1)℃，培养时间(72±3)h。

参照CHENG等[12]的方法，稍作修改。称取5 g碎虾肉，加入10%(体积分数，下同)的高氯酸(perchloric acid，PCA)10 mL，匀浆1 min，4 ℃、8 000 r/min离心10 min。收集清液，沉淀加入 5%的PCA 5 mL洗涤，搅拌均匀，4 ℃、8 000 r/min离心分离10 min。重复2 次。合并3次上清液，用1 mol/L的KOH溶液和5%的PCA溶液调节上清液pH值至6.3～6.5，静置30 min后过滤，定容至50 mL容量瓶中，摇匀。用0.22 μm的滤膜过滤后转入棕色进样瓶，于-30 ℃冰箱保存待测。

高效液相条件：色谱柱ODS-SPC18(4.6 mm×250 mm)，粒径5 μm，以0.05 mol/L的K2HPO4和KH2PO4混合液(体积比1∶1)作为流动相，流速为1 mL/min，进样量为15 μL，柱温为30 ℃，检测波长为254 nm。K值按公式(2)计算:

式中：ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx分别为三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、单磷酸腺苷、次黄嘌呤核苷酸、肌苷酸和次黄嘌呤的含量，mg/L。

1.3.7 挥发性盐基氮(TVB-N)的测定

使用自动凯氏定氮仪测定不同保鲜剂处理后的南美白对虾在4 ℃冷藏过程中的TVB-N值。每组重复3 次，取平均值。

1.3.8 色差的测定

参考赵莉等[13]的方法，稍作修改，通过色差仪，测定南美白对虾第二腹节的L*、a*、b*的值，每组实验5次平行，结果取平均值。总体色差按公式(3)计算：

式中：ΔE，总体色差；Ln，第n天的L*值；L0，第0天的L*值；an，第n天的a*值；a0，第0天的a*值；bn，第n天的b*值；b0，第0天的b*值。

依据对虾的卫生标准[14]并参考考NIRMAL等[15]的方法。感官评定小组由5 名感官敏锐并具有感官评定经验的人员组成，分值在9 分(极新鲜)和0 分(完全腐败) 之间，对南美白对虾从肌肉组织、外观和气味等方面进行评分。具体评分标准见表2。

1.4 数据处理

采用SPSS 17.0软件对数据进行Ducan多重比较法进行差异显著性检验和相关性分析，Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 鱼精蛋白复配保鲜剂对南美白对虾冷藏过程中pH值的影响

pH值的大小可判定水产品品质的优劣度。南美白对虾在冷藏过程中，随着时间的延长，其pH值在贮藏前期略有降低，但随着贮藏时间的延长，pH值逐渐升高(图1)。pH值的下降主要是由于虾体在死亡后，从僵硬至自溶解僵转变阶段会随着糖原降解而产生乳酸，并且ATP会分解成磷酸等酸性物质，导致pH值降低[16]。也有研究表明是由于脂肪水解产生了游离脂肪酸而导致pH值的下降[17-18]。随着贮藏时间的延长，虾肉进入自溶腐败阶段，在此过程中，由于虾肉自身的酶类和微生物活动导致其体内的蛋白质、氨基酸等含氮化合物分解为三甲胺等碱性含氮物，使得pH值逐渐升高[19]。SHAMSHAD等[20]研究指出,pH值为7.8是区分品质可否接受的关键点。由图1可知，CK组和PTM组在第6天时的pH值已超出可接受范围，CTS、CP1和CP3组第8天时，pH值分别为7.76、7.78和7.74，接近可接受范围，CP2组在第10天时超出可接受范围。与对照组相比，CTS、PTM、CP1、CP2和CP3处理组均能够有效抑制贮藏后期虾肉pH值的升高。尤其是CP2组最为明显。这说明复配保鲜剂能够有效的控制酶和微生物的活性，从而延缓虾肉的腐败变质。

2.2 鱼精蛋白复配保鲜剂对南美白对虾冷藏过程中脂肪氧化程度的影响

水产品中的不饱和脂肪酸易氧化成不稳定的氢过氧化物，继而进一步水解为醛、酮等物质，其中丙二醛(malondialdehyde，MDA)是主要的降解产物，其与TBA反应生成红色络合物，可用来评价脂肪的氧化程度[21]。由图2可知，新鲜的虾肉经保鲜剂处理后的TBA值约为0.04 mgMDA/kg，各组的TBA值均呈上升趋势。主要是由于随着虾肉中多不饱和脂肪酸有氧氧化程度的不断加深而生成过氧化物和最终产物，导致其后期TBA值不断升高[22]。由图2可以看出，对照组(CK)的TBA值呈直线上升趋势，而处理组(CTS、PTM、CP1、CP2和CP3)的TBA值在前6 d时变化差异不大，其上升速度明显低于对照组(CK)。从第6天开始，各处理组的TBA值显著升高，其中PTM组上升的最快，而鱼精蛋白-壳聚糖复配处理组表现出明显的抑制作用。说明含有壳聚糖的复合保鲜剂不仅可以延缓南美白对虾脂肪氧化速率，而且还能降低南美白对虾脂肪氧化程度。该结果与刘金昉等[23]的研究结果一致。

2.3 鱼精蛋白复配保鲜剂对南美白对虾冷藏过程中持水力的影响

肌肉的持水力是反映肌肉品质的重要指标，直接影响产品的质构、鲜度及感官品质[24]。虾肉中含有较多的水分，新鲜的虾肉有较好的持水性。由图3可知，新鲜的南美白对虾的持水力为83%。随着贮藏时间的延长，持水力整体呈下降趋势，表明虾肉开始逐渐腐败。虾肉在贮藏过程中持水力的变化与虾体自身发生的反应有关，主要是肌肉组织的分解反应引起的蛋白质变性及分解。实验组中虾肉的持水力降低幅度较对照组小，主要是因为对照组中的样品易滋生微生物，导致蛋白质被分解，难以与回渗水分进行水合作用，故持水力降低。CP1和CP2组表现出较优的持水力，该复合保鲜剂处理的虾体持水力无显著差异，均优于其他组别。

2.4 鱼精蛋白复配保鲜剂对南美白对虾冷藏过程中菌落总数(TBC)的影响

菌落总数的变化可反映出生物体中蛋白质和氨基酸在微生物的作用下分解代谢的情况，是衡量水产品腐败情况的重要指标。虾类的菌落总数小于等于5.0 lgCFU/g为一级鲜度，菌落总数在5.0 lgCFU/g～5.7 lgCFU/g为二级鲜度；当虾体的菌落总数大于6.0 lgCFU/g时，认为不宜食用[25-26]。南美白对虾冷藏过程中菌落总数的变化如图4所示。随着冷藏时间的延长，南美白对虾的菌落总数整体呈上升趋势。鲜活南美白对虾的菌落总数为4.3 lgCFU/g，为一级鲜度。冷藏至第2天时，南美白对虾的菌落总数不仅没有升高反而出现下降趋势，可能是因为虾体中不耐寒菌体死亡以及鱼精蛋白和醋酸浸泡处理起到了杀菌作用而导致。姚洁玉等[27]对壳聚糖-柑橘精油微胶囊对南美白对虾的保鲜效果研究中发现，贮藏1 d后的南美白对虾的菌落总数较新鲜样品的菌落总数低，可能因为醋酸浸泡与壳聚糖-柑橘精油微胶囊处理的结果。对照组从第2天起，微生物增长迅速，第6天的菌落总数为5.42 lgCFU/g，在二级鲜度范围内，第8天已超出二级鲜度范围。处理组中菌落总数的增长速度均慢于对照组，PTM组的菌落总数第6天为5.15 lgCFU/g，为二级鲜度，总菌落数较对照组低，说明鱼精蛋白可在一定程度上抑制微生物的生长繁殖，冷藏第10天时，菌落总数为5.90 lgCFU/g，超出二级鲜度范围；CTS组的菌落总数在第8天时为二级鲜度，第10天时已超出二级鲜度范围；CP1、CP2和CP3组的菌落总数第8天时分别为5.42、5.24、5.25 lgCFU/g，均为二级鲜度，冷藏至第10天时菌落总数均在二级鲜度范围内，因此说明用单纯的鱼精蛋白作为保鲜剂对南美白对虾的保鲜效果并不理想，而与壳聚糖复配后可提高其保鲜效果。

2.5 鱼精蛋白复配保鲜剂对南美白对虾冷藏过程中K值的影响

K值是用来评价水产品的鲜度指标之一，其与ATP及其降解产物有关。水产品在贮藏过程中ATP的降解途径为：ATP→ADP(二磷酸腺苷)→AMP(一磷酸腺苷)→IMP(肌苷酸)→HxR(肌苷)→Hx(次黄嘌呤)。胡亚芹等[28]指出K值越小，表示鲜度越好。K值越大，表明水产品中的蛋白质分解越严重。LI等[29]的报道指出，生物的种类、肌肉组织、捕食等因素均会对K值产生影响。一般认为，K值不大于20%时为一级鲜度，20%～40%为二级鲜度，大于60%时为初期腐败[30-31]。由图5可知，K值随贮藏时间的延长不断上升。对照组的K值在第4天时已接近二级鲜度，第6天时超出二级鲜度，而处理组的K值均低于对照组，在贮藏后期，CP1、CP2和CP3组表现出明显的优势，3组无显著差异。而对照组和PTM组的鲜度指标较差。

2.6 鱼精蛋白复配保鲜剂对南美白对虾冷藏过程中挥发性盐基氮(TVB-N)值的影响

挥发性盐基氮(TVB-N)是动物性食品在内源酶和微生物的作用下，分解产生的二甲胺、三甲胺及其他氨类化合物，是用来评价水产品腐败程度的常用指标之一[32]。根据国标GB 2733—2015《鲜、冻动物性水产品卫生标准》[33]规定，海水虾的TVB-N含量不大于30 mg/100g为可接受范围。此外，可根据TVB-N的含量划分鲜度等级，其中TVB-N含量不大于15 mg/100g时为一级鲜度，不大于20 mg/100g时为二级鲜度，不大于30 mg/100g时为三级鲜度[34]。南美白对虾4℃保藏过程中TVB-N值的变化如图6所示。各组的TVB-N值随着贮藏时间的延长呈上升趋势。新鲜南美白对虾的挥发性盐基氮含量约为5.1 mg/100 g，属于一级鲜度。对照组(CK)在整个冷藏过程中的上升速度最快，第2天时，各组的TVB-N值均未超过一级鲜度(P>0.05)，第4天时，对照组的TVB-N值为15.31 mg/100g，为二级鲜度，其他组别均为一级鲜度。对照组的TVB-N值在第8天时达到三级鲜度，第10天时已超过规定范围；CTS、PTM、CP3组均在第6天时达到二级鲜度，三者之间CTS和CP3组较优，且这2组之间无明显差异(P>0.05)，PTM组第8天时为三级鲜度，第10天时已超出规定范围，CP1和CP2组在第8天时为二级鲜度，第10天时为三级鲜度，CP3组第10天时也为三级鲜度，且CP1、CP2和CP3组的值均低于其他组，其中CP2组最优。由图4和图6可知，TVB-N的变化和菌落总数呈正相关，说明鱼精蛋白-壳聚糖复配保鲜剂在抑制微生物生长，所以能显著延缓南美白对虾TVB-N的上升。

2.7 鱼精蛋白复配保鲜剂对南美白对虾冷藏过程中色差的影响

表3为鱼精蛋白-壳聚糖复配保鲜剂对南美白对虾处理后，在4 ℃冷藏期间，色差指标的变化。总的来看，6组的明暗度L*值均呈下降趋势，表明虾体颜色随时间的延长逐渐加深。与对照组相比，处理组能显著抑制L*值的下降(P<0.05)。冷藏第2天时，PTM、CP1、CP2、CP3组与CK和CTS组存在显著性差异(P<0.05)，但前者的明暗度L*值却相对较低，说明在贮藏前期，鱼精蛋白的介入并不能保护虾体颜色的加深；冷藏第6天时，CK组、CTS、PTM、CP1、CP2组和CP3组三者之间存在显著性差异(P<0.05)，各处理组均优于CK组；冷藏第8天时，CK组、CTS、CP1、CP2、CP3组和PTM组三者之间存在显著性差异(P<0.05)，但复配保鲜剂处理未能表现出明显的优势。a*值表示虾体颜色在红绿方向的变化。a*值为负，表示虾体颜色偏绿，a*值为正，表示虾体颜色偏红。随着冷藏时间的延长，a*值逐渐增加，说明虾体表面颜色逐渐发红，各处理组直接表现出显著性差异(P<0.05)。b*值表示虾体颜色在黄蓝方向的变化。b*值为负，表示虾体颜色偏蓝，b*值为正，表示虾体颜色偏黄，随着冷藏时间的延长，虾体颜色逐渐发黄，CTS组、PTM组和CP1、CP2、CP3组之间存在显著性差异(P<0.05)，CP1、CP2、CP3组均优于其他处理组，但3组之间无显著性差异(P>0.05)。因此，复配保鲜剂处理组能有效延缓虾体的颜色变化。ΔE值表示的是虾体总色差的大小。冷藏4 d后，对照组的ΔE值明显上升，显著高于各处理组。结果表明，CP1、CP2、CP3组与PTM组存在显著性差异(P<0.05)，能明显抑制虾体颜色变化，而CP1、CP2、CP3组与CTS组相比无显著性差异(P>0.05)。

注: 同列小写字母不同表示显著差异(P<0.05)，同行大写字母不同表示显著差异(P<0.05)。

2.8 鱼精蛋白复配保鲜剂对南美白对虾冷藏过程中感官评定的影响

南美白对虾感官评定结果如表4所示。由表4可知，随着贮藏时间的延长，各组的感官评分均呈下降趋势，其中对照组下降速度最快。贮藏第2天时，对照组与其他各组存在显著性差异(P<0.05)。在贮藏后期，3种比例复配的保鲜剂处理组感官评分均优于其他各组，CP2组得分最高，但三者之间无显著性差异(P>0.05)。

注：表中数据为样品“感官品质平均分值±标准差”(n=5)；表中同一列的不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；表中同一行的不同大写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 结论

研究发现单纯的鱼精蛋白处理组保鲜效果并不乐观，可能是由于虾类含有较高的蛋白质和水分，易腐败变质，同时也因为鱼精蛋白对革兰氏阳性菌的抑制作用优于革兰氏阴性菌，而食品腐败菌中，以革兰氏阴性菌为主，因此保鲜效果不明显。而鱼精蛋白-壳聚糖复配保鲜剂对南美白对虾的保鲜效果明显优于其他处理组，可能是因为壳聚糖具有良好的成膜性，能抑制南美白对虾的氧化黑变，同时与鱼精蛋白复配后也增强了其保鲜效果。综合pH值、硫代巴比妥酸值(TBA)、持水力、菌落总数(TBC)、K值和挥发性盐基氮(TVB-N)等指标发现，3组鱼精蛋白-壳聚糖复配处理组，即0.01 g/mL壳聚糖+0.001 g/mL鱼精蛋白(CP1)、0.01 g/mL壳聚糖+0.003 g/mL鱼精蛋白(CP2)和0.01 g/mL壳聚糖+0.005 g/mL鱼精蛋白(CP3)中，CP2组表现出较优的保鲜效果，通过色差和感官评定结果发现，CP1、CP2和CP3处理组之间无显著性差异。综和考虑，CP2组为最优处理组，可以有效的控制微生物和酶的活性，从而延缓pH值、K值、菌落总数和挥发性盐基氮的升高，降低虾体的脂肪氧化程度，抑制肌肉组织中蛋白质的分解和变性，延缓持水力的降低。综合来看，该复配保鲜剂是一种高效、安全的生物保鲜剂，能有效提高南美白对虾的品质，延长其贮藏期，具有较大的推广价值。该研究也为鱼精蛋白在食品保鲜领域的应用提供参考依据。

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