肌原纤维蛋白(myofibrillar protein, MP)是组成肌肉中肌纤维的一种重要的蛋白质，约占肌肉中总蛋白质的50%～55%，其在影响加工肉制品质量方面起着关键作用[1]。对于肉类产品来说，它对肉制品独特的风味和感官特性有重要影响[2]。国内外很多学者主要针对添加外源性物质改变MP功能特性的影响展开相关研究。袁程程等[3]将沙蒿胶加入虾蛄肌原纤维蛋白中，研究报道了适当添加沙蒿胶有利于提高MP的乳化特性和理化性质；杨明等[4]将转谷氨酰胺酶和马铃薯淀粉加入鲤鱼肌原纤维蛋白中，研究表明两者均能改善MP的功能特性；贾娜等[5]向猪肉肌原纤维蛋白中加入食用胶，研究发现食用胶均可显著提高MP的乳化能力、凝胶硬度和弹性以及保水性，且添加量越高，增加的幅度越大；但添加食用胶后，肌原纤维蛋白的凝胶白度略有下降。ZHUANG等[6]将甘蔗膳食纤维加入到MP中研究报道了甘蔗膳食纤维可以提高MP凝胶的功能特性等，寻找并通过外源物质的添加不仅能改善MP的加工特性，而且对于开发新型功能食品也具有重要意义。
茶叶中含有很多功能成分，如茶多酚、茶多糖、维生素等，国内有一些关于茶多酚在肉制品中的报道，如马嫄等[7]在午餐肉中分别添加一定量的茶多酚和TBHQ，研究报道了不同添加量茶多酚处理的午餐肉均有较好的抗氧化效果。XIONG等[8]向肉中加入绿茶提取物，研究发现茶提取物的抗氧化能力是由于其含有高含量的儿茶素、单宁等黄酮类化合物。梁进等[9]将茶多酚和纳米茶多酚加入瘤株小鼠体内，研究报道了纳米茶多酚对人肝癌细胞HepG2有明显的生长抑制作用，并呈剂量与时效关系。但大多是茶中活性成分的利用，但茶粉对肉制品的影响还未见报道，且茶粉中纤维素含量高，市场上废茶碎茶多，研究茶粉对MP的功能特性影响，这对茶粉在肉制品中的应用起重要的指导意义。糯米粉中主要成分是支链淀粉，淀粉是人体摄入能量的主要来源，由于其价格低、天然可再生，同时又是优良的增稠剂，因而被广泛运用到食品工业中。YI等[10]将糯米粉添加进牛肉饼中，研究表明糯米粉能有效改善牛肉饼的理化性能和感官特性。GAO等[11]研究了糯米粉对猪肉饼品质的影响，研究表明添加3%的糯米粉的猪肉饼品质更好。但糯米粉对MP乳化特性的研究还未见报道。
本研究旨在评估超微茶粉和糯米粉对肌原纤维蛋白乳化特性的影响，研究不同质量浓度TP和GRF对MP乳化活性(emulsion activity index, EAI)、乳化稳定性(emulsion stability index, ESI)、起泡性(foaming ability, FA)、起泡稳定性(foaming stability, FS)乳化液粒度和分布、乳化液微观的影响，以期对超微茶粉和糯米粉在肉与肉制品中的应用提供理论指导和参考，也为开发新型功能肉制品提供思路和借鉴。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 原料及主要试剂
(1)原料
普通绿茶,由安徽农业大学茶与食品科技学院提供;糯米粉,淮南市新食客食品有限公司;金龙鱼牌大豆油,益海嘉里粮油有限公司;普通猪瘦肉,购于大润发超市。
(2)主要试剂
NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、牛血清蛋白、CuSO4，酒石酸钾钠、NaOH、十二烷基磺酸钠(SDS)、尼罗蓝、尼罗红、卡尔科弗卢尔荧光增白剂、异丙醇,以上试剂均为分析纯。
1.1.2 主要设备与仪器
GZX-9070 MBE 数显鼓风干燥箱，博讯实业有限公司医疗设备厂；Ultra Turrax T-25 Basic 高速分散器，德国IKA公司；LSM800 激光共聚焦显微镜，德国卡尔蔡司有限公司；Masterizer2000 激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；Beckman Avanti J-E 离心机，美国Beckman coulter公司；FE20实验室pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；IKA C-MAG HS7 磁力搅拌器，德国IKA公司；PE Lambda35紫外可见分光光度计，力臻卓越科学仪器有限公司；JA503 分析电子天平，常州幸运电子设备有限公司；YXQM-1L系列行星球磨机，长沙米淇仪器设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 原料的制备
(1)MP的提取
参照 PARK等[12]，并稍作修改。将猪肉剔除筋膜后充分斩碎至肉糜状，加入4倍体积的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.5)，缓冲溶液浓度为0.02 mol/L，肉浆在10 000 r/min 转速下用高速分散器匀浆1 min，匀浆液在4 ℃下于冷冻离心机内以7 800 r/min 的转速离心20 min，弃上清液，向沉淀中加入4倍体积磷酸盐缓冲液离心，重复3次，得到粗MP。然后向粗MP中加入4倍体积的0.1 mol/L的NaCl 溶液，再匀浆离心1次，用冰洗液冲洗得到的沉淀，4层纱布过滤，滤液再次进行离心，离心后的沉淀即是MP。提取的MP用4 ℃的冰箱储存，以备后续使用。实验过程温度保持在4 ℃左右。
(2)超微茶粉的制备[13]
利用球磨机生产超微茶粉的工艺，将茶叶于40 ℃干燥，再用小型家用粉碎机进行粗粉碎，过40目筛。将所得到的粗颗粒进球磨机(球磨机公转盘转速为400 r/min，粉碎时间为40 min)，得到的超微茶粉用粒度仪测定其平均粒径为13.8 μm。
1.2.2 肌原纤维蛋白浓度的测定
用双缩脲法测定[14]：用牛血清蛋白(BSA)作为标准蛋白，用去离子水将标准的结晶牛血清蛋白溶解，配制成10 mg/mL的标准蛋白溶液。测得标准曲线：y=0.046 7x-0.004 1；R2=0.999 4。随后取1 g蛋白溶于25 mL磷酸盐缓冲盐，取3个试管分别加入1 mL样品溶液，加入4 mL双缩脲试剂，充分摇匀后在室温下放置30 min，于540 nm处进行比色测定。
1.2.3 乳化活性和乳化稳定性的测定
(1)混合溶液的配制
将MP用0.6 mol/L NaCl溶液(pH=6.5)配制成1 mg/mL溶液。添加不同质量浓度的茶粉和糯米粉至MP的混合溶液中，搅拌至均匀形成混合溶液。
(2)参考AGYARE等[15]的方法，并稍作修改，采用浊度法。将大豆油与MP混合溶液以1∶4的比例加到烧杯中，使用高速分散器高速匀浆1 min(转速为10 000 r/min)，立即从杯底0.5 cm处取出100 μL匀浆，加入5 mL 0.1% SDS溶液的试管中并进行振荡(SDS的添加是为了防止乳化后聚集体的形成)，混合均匀。测定其在500 nm处的吸光值，记为A0。10 min后，用相同方法再次于500 nm处测定其吸光值，记为A10。
MP溶液的乳化活性和乳化稳定性可通过公式(1)和(2)进行计算:
乳化活性
(1)
乳化稳定性
(2)
式中：A500表示样品在500 nm处的吸光值；ψ表示样品中油相的体积分数(ψ =0.25)；C表示蛋白质溶液的质量浓度；A0和A10分别表示0 min和10 min取得的样品的吸光值。
1.2.4 起泡性和起泡稳定性的测定
参考OGUNWOLU等[16]的方法，并有所修改。将MP溶于0.6 mol/L NaCl溶液，配制成5 mg/mL的蛋白溶液，然后添加不同质量浓度的茶粉和糯米粉至MP的混合溶液，室温下磁力搅拌30 min形成混合溶液。取20 mL溶液于100 mL量筒中，10 000 r/min转速下匀浆1 min。立刻读取泡沫的总体积，记为V0,静置30 min后再次读取泡沫体积，记为V30。起泡性和起泡稳定性可通过公式(3)和(4)进行计算:
起泡性
(3)
起泡稳定性
(4)
式中：V表示MP溶液的体积,mL；V0和V30分别表示均质后和静置30 min以后读取的体积,mL。
1.2.5 乳化液粒度和分布测定
乳化液的制备[17]：乳化液由MP、水、大豆油、不同添加量的茶粉和糯米粉制备(按质量比例，加入2%的MP，30%的大豆油，0.05%、0.10%、0.15%超微茶粉，0.30%、0.40%、0.50%糯米粉)。将MP与去离子水以1∶8的比例混合，并于室温下用磁力搅拌器搅拌3 h，制成均匀的混合蛋白溶液，然后在4 ℃下保存24h以备使用。制备好的蛋白溶液中加入大豆油并用高速分散器在15 000 r/min条件下均质90 s(冰浴)制成预乳化液，再向预乳化液加入水和相应添加量的茶粉和糯米粉，在10 000 r/min条件下均质90 s(冰浴)。
乳化液粒径的测定：通过 Masterizer2000激光粒度仪测定乳化液中油滴平均直径的大小。分散相为水，采用湿法进样模式，颗粒的折射率为1.436，吸收率为0.001。
1.2.6 乳化液微观观察
通过激光共聚焦显微镜观察乳化液中蛋白质、油滴和多糖的分布情况。将80 μL 0.01%的尼罗红染液(溶于异丙醇)、0.01%尼罗蓝染液(溶于异丙醇)、卡尔科弗卢尔荧光增白剂以1∶1∶1的体积比与1 mL上述制备的乳化液均匀混合，并立即滴加在单凹载玻片上，盖上盖玻片进行观察。样品在3个激光束下被激发，尼罗红在514 nm下被激发，尼罗蓝在633 nm下被激发，荧光增白剂在405 nm下被激发。尼罗红为油染料，尼罗蓝为蛋白染料，卡尔科弗卢尔荧光增白剂为多糖染料[18]。
1.2.7 数据分析
实验每组均采取3次重复，即n=3。采用软件SPSS 24.0进行统计分析，方差分析采用ANOVA分析，多重比较采用Duncan法，P < 0.05表示差异显著，用Origin软件进行绘图。试验数据以“平均值±标准差(Mean±SD)”来表示。
2 结果与分析
2.1 肌原纤维蛋白乳化活性及乳化稳定性
乳化活性和乳化稳定性是用于评价蛋白质的乳化性能的关键指标。EAI是指单位质量蛋白质在促进油水互溶时，稳定油水界面的大小，ESI是指维持油水混合不分离时，蛋白质抵抗外界条件的能力。
图1 茶粉和糯米粉对肌原纤维蛋白乳化活性和乳化稳定性的影响
Fig.1 Effects of TP and GRF on emulsifying activity and emulsion stability of MP
注：同一类型的不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。下同。从左至右茶粉添加量(质量分数)为：CK，0.05%，0.01%，0.15%；糯米粉添加量(质量分数)为：CK，0.30%，0.40%，0.50%。
由图1可知，TP添加量在0%～0.10%时，MP乳化活性逐渐提高，但TP添加量过大，乳化活性反而下降；TP添加量为0.10%，乳化活性达到最大值(22.02±2.02)m2/g；MP乳化活性随着GRF增加而不断提升，GRF添加量为0.50%，MP的乳化活性达到最大值(23.15±1.50)m2/g，显著高于空白对照组(P<0.05)，可能因为茶粉中的纤维在油水界面形成了较厚的界面膜，使得液滴之间产生空间位阻效应从而阻碍了液滴聚集[19]；而茶粉固体颗粒之间相互缠结形成的网络结构在一定程度上增加了乳液的稳定性。但加入过量TP会包裹蛋白质表面活性基团，使乳化膜厚度增大，导致蛋白质乳化活力降低[4]。糯米粉的添加，显著提高MP的网络结构聚集性，从而使MP的乳化活性增大[20]。
MP乳化稳定性随着TP(0%～0.05%)和GRF(0%～0.30%)添加量的增加而提高，TP添加量为0.05%，ESI达到最高值((89.6±4.02)%)，显著高于空白对照组(P<0.05)；GRF添加量为0.30%，ESI达到最大值((80.1±3.6)%)，但与空白对照组没有显著差异(P>0.05)。可能是TP添加量适量上升，TP的纤维与MP相互结合，相互作用，形成二维网络结构，阻碍脂肪在体系中扩散，使得乳化液的稳定性能够提升[21]；随着TP添加量增大，乳化液微粒间距离变小，蛋白质吸附层的黏着力减小，使得油滴聚集，稳定性降低。这可能是因为糯米粉的添加增加了体系的稠度，阻碍了油滴的聚集，提高了体系的乳化稳定性[4]。当添加量过多时，乳化液微粒粒度变大，使得油滴聚集，而且过多的淀粉易发生沉降而不能在溶液体系中起到作用[22]。
2.2 肌原纤维蛋白起泡性及起泡稳定性
由图2可知，TP添加量为0%～0.10%时，MP的起泡性逐渐提高，最高值为(23.3±2.3)%，显著高于对照组(P < 0.05)；当TP添加量持续增加，MP起泡性逐渐降低。蛋白质起泡性由蛋白质分子扩散、界面张力及疏水基团含量和分布等决定，TP添加量低，蛋白质与多糖相互作用阻止气泡粗化，溶解度上升，起泡性增强；但茶粉添加量过多会包裹蛋白质，蛋白质和水界面上的蛋白量较少导致起泡性的降低。GRF添加量为0%～0.50%时，MP的起泡性不断增加，最高值为(29.0±2.0)%，且与对照组有显著差异(P < 0.05)。蛋白起泡性的提高可能是因为水研磨的糯米粉含有大量支链淀粉，其溶于水，能增加该MP的拉伸性，气泡形成能力提高，糯米面粉中还含有一定量的蛋白质，也使得起泡性增加[23]。
图2 茶粉和糯米粉对肌原纤维蛋白起泡性和起泡稳定性的影响
Fig.2 Effects of TP and GRF on foaming ability and foam stability of MP
注：从左至右茶粉添加量(质量分数)为：CK，0.05%，0.10%，0.15%；糯米粉添加量(质量分数)为：CK、0.30%，0.40%，0.50%。
TP添加量为0.0%～0.05%时，MP起泡稳定性逐渐增加，最高值为(78.0±4.6)%，较其他添加组有显著差异(P < 0.05)。泡沫的稳定性与蛋白的溶解性柔韧性等有关，起泡稳定性提高可能因为低添加量TP能改善蛋白的溶解性，但过多TP会降低蛋白之间的相互作用，使泡沫稳定性降低[24]。MP的起泡稳定性随GRF添加量的增加而降低，与对照组有显著差异(P<0.05)。可能是体系的黏度随着粒子浓度的增加而增加，阻碍了均质过程中粒子的移动以及在油水界面的吸附，并且淀粉的聚集作用使得蛋白泡沫发生聚集和破裂，从而使起泡稳定性降低。
2.3 茶粉和糯米粉对肌原纤维蛋白乳化液粒径的影响
由表1、表2和图3、图4可知，随着TP添加量的增加乳化液粒度变小，TP添加量为0.15%时，液滴的粒度最小，此时平均粒度为(28.515 μm)。可能是由于多糖与蛋白质的协同作用，与蛋白质通过氢键作用和疏水作用在乳化体系中均匀分散开[25]。因为多糖减少了液滴和连续相之间的密度差异，能显著改善连续相的黏度并使液滴的尺寸减小，使得乳化液更加稳定。也可能是茶粉中的多酚导致乳化液颗粒变小，WANG等[25]发现α -乳清蛋白与 EGCG 共价结合能提高其抗氧化能力并降低了乳化液的粒径。GRF添加量为0%～0.40%时，液滴平均粒度随GRF添加量的增加而减小，但GRF添加量为0.50%时，粒度反而增大，可能是由于GRF过多，导致连续相中的多糖过多使得液滴之间的间隙变小，发生絮凝和沉淀等现象，吸附在液滴表层的蛋白被排挤出来，液滴凝集而使粒度增大。
图3 茶粉对乳化液粒度的影响
Fig.3 Effect of TP on the particle size of emulsion
图4 糯米粉对乳化液粒度的影响
Fig.4 Effect of GRF on the particle size of emulsion
表1 添加茶粉的乳化液液滴平均粒度
Table 1 Average droplet size of emulsion droplets added to tea powder
茶粉添加量CK0.05%0.10%0.15%平均粒度/μm38.542±1.464a34.387±1.329b32.440±0.862c28.515±1.592d
注：不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)。下同。
表2 添加糯米粉的乳化液液滴平均粒度
Table 2 Average droplet size of emulsion droplets added with glutinous rice flour
糯米粉添加量CK0.30%0.40%0.50%平均粒度/μm38.542±1.464b37.308±0.869b25.441±1.587c41.225±1.118a
2.4 茶粉和糯米米粉对肌原纤维蛋白乳化液微观状态的影响
激光共聚焦显微镜是研究蛋白质和多糖实际分布和相互作用的重要工具，成像显示了肌原纤维蛋白、大豆油、茶粉和糯米粉在乳化液中的分布及相互作用。由图5、图6可知，脂肪颗粒多呈现球状或者近似球状，MP包裹在这些大小不一的脂肪球表面，使得乳化体系更加稳定[27]。当乳化液中不添加茶粉和糯米粉时，乳化液的液滴分布密集混乱，大小不一，随着茶粉和糯米粉的添加，液滴分散且颗粒均逐渐变小，但茶粉对乳化液液滴大小的影响力更大。可能是外源性添加物中的多糖物质与蛋白的协同作用，改善乳化液的黏度，吸附在油脂表面形成空间阻碍防止油滴聚集，从而使乳化体系稳定。由图6可知，由于GRF中支链淀粉含量高，支链淀粉与肉类蛋白的相互作用，随着糯米粉添加量的增加，絮凝开始增加。这可能归因于未吸附的淀粉引起的絮凝作用，导致高添加量糯米粉增加了乳液粒度。
a-CK；b-0.05%TP；c-0.1%TP；d-0.15%TP
图5 茶粉对乳液液滴分布的影响
Fig.5 Effect of TP on emulsion droplet distribution
a-CK；b-0.30%GRF；c-0.40%GRF；d-0.50%GRF
图6 糯米粉对乳液液滴分布的影响
Fig.6 Effect of GRF on emulsion droplet distribution
3 结论
研究表明，适当TP和GRF的添加可以改善MP的乳化特性。与对照组相比，添加0.05%、0.10%的TP，能够提高蛋白的乳化活性、乳化稳定性、起泡性和起泡稳定性，但加入量过高，反而会使蛋白的乳化活性和乳化稳定性都降低。而糯米粉中含有大量支链淀粉，提升了蛋白的持水能力和保油能力，易形成稳定的乳化体系，因此添加了GRF的蛋白乳化活性和起泡性都有所提高。从乳化液的微观结构可看出，TP和GRF会使液滴的粒度减小，分布更加均匀，因此乳化体系更加稳定。总的来说，向肌原纤维蛋白中添加适量的TP和GRF，肌原纤维蛋白的乳化特性得到改善；因此，TP和GRF在乳化肉制品加工中有较好的应用前景，对生产新型功能性乳化性肉制品提供了较好的思路。
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