不同发酵菌种及发酵时间对蛋酪风味成分的影响

本研究的“蛋酪”，是指以鸡蛋为原料，采用了类似奶酪的乳酸菌发酵工艺和类似腐乳的霉菌发酵工艺制作的“发酵蛋制品”。

我国现有的发酵蛋制品有发酵蛋奶饮料[1]、发酵型全蛋饮料[2]、蛋乳发酵酸奶[3]、臭蛋制品[4]，霉菌发酵蛋制品[5]。霉菌发酵可以使蛋制品中的蛋白质大分子分解成氨基酸和肽的小分子营养物质，更易于吸收。现国内研究多是用单一菌或是霉菌与霉菌混合复配来发酵蛋制品，少有研究利用霉菌与酵母菌混合复配来发酵蛋制品。沙菲[6]研究了一种新型鸡蛋发酵食品——蛋腐乳，是用王致和五通桥毛霉、米根霉和混合复配菌种作为前酵菌种进行发酵，但是发酵风味有待改善。酵母细胞中含有丰富的蛋白质、维生素和多种酶系[6]，是发酵调味品的香气主要来源之一，也是提高腐乳风味的互补菌种。本研究在蛋酪已有的工艺基础上为改善风味对菌种及其发酵时间进行优选，为风味优化打下良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

德清源A+鲜鸡蛋，北京德清源农业科技股份有限公司；全蛋粉，北京金健力蛋粉厂；蛋清粉，北京金健力蛋粉厂；卡拉胶，国药集团化学试剂有限公司；嗜热链球菌，陕西森弗天然制品有限公司;安琪酵母Saccharomycescerevisiae),安琪酵母股份有限公司;通桥毛霉(Mucor wutungkiao)，米根霉(Rhizopus oryzae),保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

QZK28-A02高档嵌入式蒸汽烤箱，佛山市雷哲电器有限公司；Gray50/30μm DVB/CAR/PDMS顶空固相微萃取头，美国Supelco公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；QP2010Plus气相色谱-质谱联用仪，日本Shimadzu公司；Heracles Ⅱ超快速气相电子鼻，法国Alpha M.O.S公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋酪制作方法

用搅拌机将全蛋液打均匀，将蛋液用不锈钢超细过滤网过滤以滤除蛋白膜、蛋壳和卵黄系带；添加5 %(质量分数)的全蛋粉、5 %的蛋清粉和0.5 %的卡拉胶经巴氏杀菌,再添加1 %的嗜热链球菌，37 ℃发酵4 h，将发酵后的蛋液于室温下用旋转蒸发仪旋蒸10 min除去气泡，85 ℃蒸汽烤箱蒸制40 min，取出冷却，表面均匀喷洒菌液，28 ℃、相对湿度80%～90% RH发酵20～40 h后搓毛，作为本研究的样品。

本试验用毛霉、米根霉、毛霉复配安琪酵母、米根霉复配安琪酵母(复配菌液均以1∶1的体积比混合制成复配菌种悬浮液)，对照组为未接菌蛋坯。

1.2.2 感官评价标准

发酵后的蛋酪从色泽、形态、气味、口感以及组织形态5个方面评定，按照表1的指标和特性进行评定，评定的最终得分以平均值计算。

1.2.3 气相电子鼻检测参数

样品使用全自动超快速气相色谱电子鼻Heracles Ⅱ进行检测分析，分析参数如表2所示。

1.2.4.1 顶空固相微萃取条件

准确称量5.0 g样品，置于15 mL的螺口样品瓶中，将螺口样品瓶密封，放在80 ℃的恒温水浴锅中水浴平衡10 min，将SPME萃取头插入瓶中，使之处于样品上方一定距离，避免萃取头接触到样品，推出纤维头在选定的温度条件下顶空吸附40 min，然后将萃取头插入气相色谱质谱联用仪，在250 ℃温度条件下解吸5 min[7]。

1.2.4.2 色谱-质谱条件

色谱条件：色谱柱HP-5MS(0.25 mm×30 m，0.25 μm)弹性石英毛细管柱；升温程序：起始柱温50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min上升至160 ℃，不保留；以6 ℃/min上升至270 ℃，保持12 min。载气为He气，载气流量1.2 mL/min；恒压40 kPa，不分流，进样口温度与接口温度均为250 ℃，检测温度200 ℃。

质谱条件：电子轰击为EI离子源；离子源温度200 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围(m/z)：50～500 amu。

试验数据由计算机谱库NIST、Wiley进行检索与分析，确定全蛋凝胶中各个挥发性物质。半定量分析：采用峰面积归一化法计算样品中各个组分的相对含量,如公式(1)所示[8]:

式中：M为单组份风味成分的峰面积；N为总峰面积。

2 结果与分析

2.1 菌种及发酵时间对蛋酪风味的影响

表3为毛霉、米根霉、毛霉复配安琪酵母、米根霉复配安琪酵母及其不同发酵时间(10、20、30、40、50 h)蛋酪样品感官评价结果，当发酵时间相同时，根据不同菌种的对比，米根霉复配安琪酵母组的风味最好，毛霉组风味较差。当发酵菌种相同时，随着发酵时间的增加，感官评价分值先增加后降低，其中毛霉、毛霉复配安琪酵母、米根霉复配安琪酵母这3种菌发酵时间为20 h时感官评价的分值最高，米根霉在发酵时间为40 h时感官评价的分值最高。每种菌发酵20 h与发酵40 h具有显著性差异。结果显示复配菌发酵的效果优于其单一菌发酵。

2.2 电子鼻测定结果

为进一步探讨不同发酵菌种及发酵时间对蛋酪风味的影响。根据感官评价结果，对每种菌发酵时间为20、40 h的蛋酪及未接菌的蛋坯进行电子鼻检测和GC-MS分析。试验设计方案见表4。

对表4中的蛋酪样品利用电子鼻进行检测，并进行了主成分分析(principal component analysis，PCA)和(discriminant factor analysis,DFA)分析。PCA是使用正交变换将一组可观相关变量的观测值转换为一组主成分的线性不相关变量值[9]。判别因子分析DFA是在PCA分析数据基础上扩大组间差距, 缩小组内差距, 以更加直观的形式体现不同样品间差异的分析方法[10]。由图1的PCA图谱可知第1主成分贡献率为 99.006%，第2主成分贡献率为0.297 2 %，两种主要成分累积贡献率为99.303 2 %，表明此图谱能够较好地反映出所测样品中气味数据的完整性。同时，判别指数(discrimination index, DI)是数据统计软件分析PCA时用于表征样品之间区分度的体现[11-12]。DI值在80～100表示该数据区分分析结果为有效结果,DI值越大效果越佳[13-14]。图1中PCA的判别指数为90，表明此样品间的区分效果为有效区分。通过比较各个样品的横纵坐标发现，B-米根霉复配安琪酵母20 h、G-米根霉复配安琪酵母40 h和H-米根霉40 h发酵后第1主成分差异不大，说明这3组样品风味较为接近。A-米根霉20 h、E-毛霉40 h和F-毛霉20 h,发酵后第1，2主成分差异不大，说明这4组样品风味较为接近。而I-毛霉复配安琪酵母20 h与C-未接菌以及其他7种发酵蛋酪第1、2主成分差异较为大，说明I-毛霉复配安琪酵母20 h与C-没接菌发酵后蛋酪的风味与其他7种蛋酪发酵后风味差别较明显。

由图2的DFA图谱可知第1主成分贡献率为45.784 %，第2主成分贡献率为38.051%，两种主要成分累积贡献率为83.835%，表明此图谱能够较好地反映出所测样品中气味数据的完整性。从样品的分布来看，9种样品互不重叠，区别明显，说明DFA能够很好地区分不同菌种发酵后蛋酪样品的挥发性风味。从样品间的距离来看D-毛霉复配安琪酵母40 h、E-毛霉40 h和F-毛霉20 h在第1，2主成分差异不大，说明3组样品风味较为接近。A-米根霉20 h、B-米根霉复配安琪酵母20 h、G-米根霉复配安琪酵母40 h和H-米根霉40 h在第1主成份上差异不大，但是在第2主成分上差异较大，说明这4组样品风味有差异。其他蛋酪样品之间风味差异也较为明显。

2.3 不同菌种和时间发酵蛋酪后挥发性风味物质的GC-MS分析

2.3.1 挥发性风味物质GC-MS分析

采用顶空固相微萃取的方法结合GC-MS分析结果见图3和表5，9种不同蛋酪挥发性风味物质种类共鉴定出98种成分，主要有醛类、烃类、酸类、酯类、醇类、酮酚类及其他化合物。其中B-米根霉复配安琪酵母20 h、D-毛霉复配安琪酵母40 h和I-毛霉复配安琪酵母20 h醇类物质所占比例最高，相对含量分别为36.17%、38.02%、37.1%。A-米根霉20 h、E-毛霉40 h、F-毛霉20 h、G-米根霉复配安琪酵母40 h以及H-米根霉40 h酸类物质所占比例最高，相对含量分别为48.5%、32.93%、44.66%、31.47%、41.37%。C-没接菌醛类物质所占比例最高，相对含量为28.74%。根据A-米根霉20 h与B-米根霉复配安琪酵母20 h比较后发现，在相同的时间下，单一菌种发酵后挥发性成分均以醛类、烃类以及酸类所占比例较大且种类较多，复配菌种发酵后挥发性成分则以醇类和酯类所占比例较大，且醛类、烃类以及酸类明显减少。根据B-米根霉复配安琪酵母20 h与G-米根霉复配安琪酵母40 h比较后发现，这两种样品挥发性成分均以酸类、酯类以及醇类所占比例较大，其成分相似。这与电子鼻PCA和DFA结果相符。

2.3.2 醛类化合物

醛类化合物是食品中起关键作用的风味物质之一, 其阈值通常比其他化合物的阈值低, 可能来源于不饱和脂肪酸氧化后形成过氧化物的裂解[15]。相对含量的不同往往使得产品风味差异较大, 从而影响不同风味的形成[16]。本试验共检测出13种醛类 (表5)，其中苯甲醛、壬醛、辛醛含量较高。苯甲醛产生臭味或苦杏仁味[17]，壬醛是油酸氧化的产物，具有脂肪味、鱼腥味、鲜青草味，辛醛也具有鲜青草气味[18]，它们是不良风味中的重要组分，而且壬醛及烯醛被认为是动物性产品土腥味的重要来源[19]。9种蛋酪中醛类相对含量较高的样品为C-没接菌(28.74%)、D-毛霉复配安琪酵母40 h(18.7%)、E-毛霉40 h(20.31%)和F-毛霉20 h(31.56%)，说明这4种样品不愉悦风味较为明显且其感官评价评分较低，而B-米根霉复配安琪酵母20 h和G-米根霉复配安琪酵母40 h含醛类物质较低，其相对含量分别为3.32%、2.27%，且在这2个样品中未检测到苯甲醛和辛醛这两种不良风味，总体呈现香气更愉悦，感官得分高。

2.3.3 酯类化合物

酯类化合物是原料加工中产生的醇与脂肪酸发生酯化反应产生，呈果香味，风味影响较大[20]。短链酸形成的酯具有水果香味, 而长链酸形成的酯具有轻微的油脂味[21]。本试验共检测出15种酯类，其中棕榈酸乙酯、十四酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯含量较高。乙酯类物质赋予产品果香味和奶油香味[22], 是促进蛋酪风味形成的重要物质。例如，棕榈酸乙酯具有芳香味[23]，十四酸乙酯具有果香味[24]，油酸乙酯具有具有花香、果香以及油脂气息[25]。9种蛋酪中酯类相对含量较高的样品为B-米根霉复配安琪酵母20 h(25.55%)、G-米根霉复配安琪酵母40 h(29.37%)和H-米根霉40 h(25.68%)，说明这3个样品具有强烈的酯香味且其感官评分较高。C-没接菌、D-毛霉复配安琪酵母 40 h、E-毛霉40 h和F-毛霉20 h含酯类物质较低，其含量分别为4.47%、4.71%、7.93%、1.46%，说明这4个样品愉悦风味不明显且感官评分较低。

2.3.4 醇类化合物

醇类物质主要是由酵母菌发酵产生，虽然其阈值较高，但与香气的组成关系密切，且能与有机酸形成酯类，故醇类物质的存在对赋予产品醇香和促进脂肪酸酯化的作用是显著的[26]。本试验共检测出10种醇类，其中苯乙醇在全部样品中均有检出。在4个复配菌样品(B-米根霉复配安琪酵母20 h、D-毛霉复配安琪酵母40 h、G-米根霉复配安琪酵母40 h和I-毛霉复配安琪酵母20 h)中检测出苯乙醇含量比其单一菌有明显的增多，其相对含量分别为36.06%、35.65%、22.37%、35.14%。苯乙醇具有玫瑰丁香花香气，有先苦后甜的桃子样味道[26]。说明增加了酵母菌对蛋酪的风味有明显的改善，且感官评价结果显示在发酵时间相同时，复配菌种风味优于单一菌种。

2.3.5 烃类、酸类、酮酚类以及其他化合物

根据资料显示，烃类化合物可能是烷基自由基脂质自氧化或类胡萝卜素降解产生的[27], 所以大部分烃类物质香气较弱或无气味。本试验共检测出烃类化合物32种，其中C-没接菌的相对含量最高(24.92 %)。酸类物质是合成酯类化合物的前体物质之一，可由微生物发酵及化学反应产生，如长链脂肪酸可直接来源于原料的酶解，低级酸类主要由微生物代谢或氨基酸降解后经氧化或还原作用产生，也可能由饱和脂肪酸本身氧化降解产生[27]。本试验共检测出酸类化合物9种，每种样品中棕榈酸的相对含量最高。酮类化合物的来源途径主要是多不饱和脂肪酸的氧化或热降解、氨基酸降解或微生物氧化。多数的酮类物质具有清香气味，有花香和果香，香味优异持久。本试验共检测出酮酚类化合物11种，其中A-米根霉20 h的相对含量最高(6.46%)。A-米根霉20 h、B-米根霉复配安琪酵母20 h、G-米根霉复配安琪酵母40 h和H-米根霉40 h均检测到丁香酚，其具有丁香花香[28]，含量分别为6.3%、1%、3.29%、4.03%。有研究表明，2-戊基呋喃是亚油酸的氧化产物，阈值相对较低，与腐臭味有较强的相关性[29]，其中只有B-米根霉复配安琪酵母20 h和G-米根霉复配安琪酵母40 h未检测出2-戊基呋喃，综合说明这2个样品没有产生不愉悦风味，这与感官评价结果相一致。

3 结论

人工感官评价结果表明,米根霉复配安琪酵母菌发酵20 h时蛋酪风味最佳。利用电子鼻的PCA和DFA分析得出，电子鼻能够有效地区分不同菌种发酵后蛋酪样品的挥发性风味，其中DFA比PCA更好地分辨出蛋酪风味物质的变化。HS-SPME-GC-MS 联用仪鉴定出苯甲醛、辛醛、壬醛、棕榈酸乙酯、十四酸乙酯、油酸乙酯、苯乙醇、丁香酚、2-戊基呋喃等主要特征挥发性物质。其中对蛋酪产生愉悦风味的主要物质是棕榈酸乙酯、十四酸乙酯、油酸乙酯、苯乙醇、丁香酚，不愉悦风味的主要物质是苯甲醛、辛醛、壬醛、2-戊基呋喃。通过综合比较分析可以发现，B-米根霉复配安琪酵母20 h占愉悦风味物质种类及含量最多，且不愉悦风味物质种类及含量最少，总体呈现的香气更愉悦，这一结果与感官评价结果相一致。结果表明，复配菌种发酵的效果优于单一菌种。

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