果蔬极易滋生霉菌而腐烂，使用防腐剂成为缓解其腐烂最常见的措施。考虑到防腐剂对人体的危害性，一些食药同源的植物源抑菌剂近年来成为研究热点，目前已发现对食源性致病菌具有强抑制作用的植物精油主要有百里香、丁香、牛至、肉桂、大蒜等[1]，其中牛至精油是最有效的天然抑菌剂之一[2]。
牛至为唇形科植物，广泛分布在我国及希腊、土耳其、墨西哥等地[3-4]。MUNHUWEYI等[5]测试了几种植物精油对灰葡萄孢和青霉的抑制作用，抑菌效果依次为牛至>肉桂>柠檬草；ROYO等[6]利用牛至精油制备的抗菌滤纸对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有抑菌作用；AGRIMONTI等[7]发现添加牛至精油的纤维素垫对碎牛肉的嗜冷菌群具有抑菌作用；王建清等[8]制备的牛至精油涂布纸板对青霉菌等具有明显抑制作用。LEE等[9]用羟丙基甲基纤维素与牛至精油纳米乳液制备成复合膜对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均有强抑制作用。
牛至精油抑菌效果已有报道，但是关于牛至精油的活性成分未见相关深入的研究，光照、pH值等是否会影响其稳定性亦未见研究，牛至精油抗菌涂层中活性成分的释放特性也值得探索。本实验通过对牛至精油活性成分进行处理，并结合气相色谱-质谱(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS)分析和抑菌实验确定牛至精油的抑菌活性成分，研究其在光照、温度、湿度、pH值条件下的稳定性。由于瓦楞纸箱是一种常见的果蔬保鲜包装[10]，将活性成分涂布于纸箱内壁可以缓解果蔬在贮藏和运输过程中的腐烂，本实验以抗菌瓦楞纸箱为例研究抑菌活性成分的释放特性。论文研究成果可为植物源酚类抑菌剂在果蔬防腐保鲜中的应用提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
香芹酚标品(色谱纯)，上海融禾医药科技公司；牛至精油，长沙格绿生物科技公司；交链孢霉、青霉、腐霉、灰霉，天津科技大学食品学院提供；正己烷(光谱纯)，天津市江天化工技术公司。
Varian 4000MS GC-MS色谱仪，美国瓦里安公司；UV-2550紫外-可见分光光度计，GC-2010气相色谱仪，日本岛津公司。
1.2 牛至精油抑菌效果测试
参考王建清等[11]的方法测试牛至精油对4种霉菌的抑菌效果。滤纸片(直径6 mm)，玻璃培养皿(直径90 mm)、玻璃涂抹棒、镊子等160 ℃灭菌2 h密封保存备用。吸取活化后的菌悬液100 μL(浓度约1×107CFU/mL)加到PDA培养基表面，涂抹均匀，放置滤纸片，吸取10 μL牛至精油至滤纸片上，每种菌做3个平行皿。28 ℃培养48 h后测试抑菌圈直径，连续测试8 d。
1.3 牛至桂精油成分鉴定
参考王建清等[11]的方法使用GC-MS鉴定牛至精油的成分。气相色谱主要参数： VF-5 ms色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度300 ℃；分流比10∶1；色谱柱初始温度60 ℃(保持3 min)，5 ℃/min升至200 ℃，再以10 ℃/min升至300 ℃， 300 ℃保持5 min。质谱主要参数：EI离子源，阱温220 ℃，50～1 000 m/z全扫描。用正己烷将牛至精油稀释10 000倍，取1 μL进样。由于有文献[12-13]报道牛至精油主要成分为香芹酚或百里香酚，为进一步确认其主要成分，将香芹酚标品和百里香酚标品稀释10 000倍后各取1 μL进行气相色谱(gas chromatography，GC)进样分析。通过检索质谱库，比对香芹酚标品、百里香酚标品出峰时间，并参考相关文献[12-13]确认精油各成分，用峰面积占总出峰面积的百分比表示各成分相对含量。
1.4 牛至精油抑菌活性成分确定
1.4.1 香芹酚和牛至精油抑菌效果对比测试
用正己烷将香芹酚和牛至精油稀释10倍，参照1.2 的方法测定其对灰霉的抑菌圈直径。
1.4.2 牛至精油活性成分处理及GC分析
将1 mL牛至精油与200 mL 0.1 mol/L NaOH溶液充分反应，用适量的正己烷重复萃取2次，旋转蒸发仪蒸发正己烷。用正己烷(色谱纯)将NaOH溶液处理后的牛至精油和香芹酚标品稀释10 000倍，各取1 μl进行GC分析。GC条件：进样口温度250 ℃，检测器FID，柱子型号DB-17 (30 m×0.25 μm×0.25 mm)，分流比10，载气N2，柱子初始温度80 ℃，以5 ℃/min升温至最250 ℃，在250 ℃保持5 min。
1.4.3 NaOH溶液处理后的牛至精油抑菌试验
将牛至精油按1.4.2方法处理后进行灰霉抑菌效果测试(方法同1.2)。
1.5 牛至精油活性成分稳定性分析
参考刘万臣[14]的方法分析牛至精油活性成分香芹酚的稳定性。采用无水乙醇将香芹酚标品分别稀释为3×10-5、3×10-4、3×10-3 g/mL，使用紫外-可见分光光度计在200～1 100 nm进行扫描，测定最大吸收波长及其对应的吸光度值。分析光照时间、温度、不同湿度、不同pH值对香芹酚吸光度值的影响。由于精油挥发性较强，采用精油制备抗菌活性材料时一般尽可能避免高温以免造成其挥发损失，很多研究[8,15-16]制备牛至精油活性材料的温度≤60 ℃，所以本实验研究牛至精油在60 ℃处理时的稳定性。以质量浓度为3×10-5 g/mL香芹酚为研究对象，分别在如下条件测试其特征波长下的吸光度值：(1)将其在自然光下处理0～8 h，1 h测试1次；(2)将其在60 ℃水浴处理0～8 h，1 h测试1次；(3)将其置于20%、50%、90%湿度条件下放置8 d，1 d测试1次。(4)将其用HCl和NaOH溶液调成pH为2～13，测试不同pH值对吸光度值的影响。
1.6 抗菌瓦楞纸箱的制备
将 8 g β-环糊精60 ℃溶解于200 mL蒸馏水，加入牛至精油(使其质量浓度为5、10、20、30 g/L)，添加2 mL吐温-80，超声处理80 min，加入10 g壳聚糖，搅拌30 min，静置12 h备用。将牛至精油乳液涂布于A楞纸箱内壁(24 cm×20 cm×5.5 cm)制得抗菌纸箱，记为T1、T2、T3和T4(对应精油质量浓度分别为5、10、20、30 g/L)，乳液涂布量为(160±5) g/m2，自然风干。纸箱顶部加工一个直径10 mm的圆孔，粘贴硅胶板密封，空白纸箱记为CK。
1.7 抗菌纸箱内香芹酚释放测试
用气体进样针经硅胶片从纸箱内吸取10 μL气体，立即GC进样，分析条件同1.4.2，每天测试1次，连续测试5 d。将0.5 mL牛至精油置于500 mL空白试剂瓶中，自然放置12 h，使其香芹酚达到气体平衡。取试剂瓶中的气体10 μL进行GC分析，计算如公式(1)所示：
(1)
式中:Ai为各组纸箱气体在GC中的香芹酚峰面积；A0为试剂瓶中气体在GC中香芹酚峰面积；A为各抗菌纸箱内香芹酚的相对百分含量。
1.8 数据处理与分析
采用Origin 2017进行数据处理，SPSS 17.0进行数据分析，P<0.05时存在显著性差异。
2 结果与分析
2.1 牛至精油对4种霉菌的抑菌效果
牛至精油对4种霉菌的抑菌圈直径见表1。牛至精油对青霉和灰霉的抑菌圈直径在10 d以内一直为90 mm，这说明牛至精油对灰霉和青霉有很强的杀灭作用。牛至精油对交链孢霉和腐霉的抑菌圈直径在第3天为90 mm，随着时间的延长出现了降低的趋势，在第10天时对交链孢霉和腐霉的抑菌圈直径分别为80、50 mm，仍远高于强抑菌活性的标准[17]。可见牛至精油对4种霉菌均具有强抑制作用。关于牛至精油的抑菌效果此前也有研究报道，董路路等[18]采用滤纸片法测试出牛至精油对灰霉和青霉的抑菌圈直径均为45 mm。PORTILLO-RUIZ等[19]测试出墨西哥牛至精油对青霉、根霉、镰刀菌的抑菌圈直径分别为34、35、45 mm。文献中抑菌圈直径和本实验存在差异，原因可能是牛至精油的成分和使用量存在差异。植物精油抑菌的作用机制主要涉及破坏微生物的细胞壁、细胞膜、DNA、呼吸作用和能量代谢等方面[1]。OUSSALAH等[20]发现西班牙牛至精油可使大肠杆菌和李斯特菌的细胞膜通透性变大，引起细胞成分的释放，并导致细胞中ATP浓度和细胞内pH值降低。SIROLI等[21]研究了亚致死浓度的牛至精油诱导了李斯特菌，大肠杆菌和沙门氏菌的一些膜相关脂肪酸显著增加，特别是不饱和脂肪酸，反式异构体和特定释放的游离脂肪酸，并产生了挥发性化合物。由于牛至精油是一种混合物，一般认为可能是由于含有较高含量的香芹酚或百里香酚导致其具有优异的抑菌性能，但是关于牛至精油抑菌活性成分的证实工作未见相关研究或报道。
表1 牛至精油对4种霉菌的抑菌圈直径 单位：mm
Table 1 Inhibition zone diameter of oregano EO
against 4 kinds of fungi
供试霉菌培养时间/d345678910青霉 90.0±0.090.0±0.090.0±0.090.0±0.090.0±0.090.0±0.090.0±0.090.0±0.0腐霉 90.0±0.090.0±0.075.0±2.062.5±2.650.5±3.450.0±2.550.0±2.450.0±2.0交链孢霉90.0±0.090.0±0.090.0±0.090.0±0.090.0±0.085.5±3.280.5±3.080.0±2.5灰霉 90.0±0.090.0±0.090.0±0.090.0±0.090.0±0.090.0±0.090.0±0.090.0±0.0
2.2 牛至精油的GC-MS分析
通过GC-MS共鉴定出14种化学成分，其中峰面积百分比超过1%的成分有5种，出峰时间分别为7.807、14.224、14.439、14.837、19.581 min，对应的成分及含量分别为邻甲酚4.94%，百里香酚1.941%，香芹酚83.06%，3-甲基-4-异丙基苯酚1.02%，1,3-二异丙基-2-甲氧基苯6.82%。此前已有部分文献对牛至精油的成分进行了深入研究。FALCO等[12]研究了3种野生牛至精油的成分，发现牛至品种和采集时间会导致精油成分含量存在显著差异(P<0.05)。FIGUÉRÉDO等[13]研究了7种牛至精油的化学成分，不同精油之间的成分也存在明显差异，其中一种牛至精油香芹酚含量较高(香芹酚73.8%，百里香酚0.6%)，而另一种牛至精油百里香酚含量较高(香芹酚2.1%，百里香酚59.3%)。本实验中牛至精油的主要成分与上述文献中牛至精油成分基本吻合，但是也存在差异，其原因可能是由于牛至品种之间、采集季节、以及加工方法存在差异。
2.3 牛至精油抑菌活性成分的确定
2.3.1 牛至精油处理前后抑菌效果对比分析
图1为牛至精油处理前后对灰霉的抑菌效果，图2为抑菌圈照片。由图1可知，香芹酚的抑菌圈直径比牛至精油稍大，其中1/10香芹酚标品和1/10牛至精油对灰霉的抑菌圈直径分别为41 mm和38 mm，均显著高于NaOH溶液处理后的1/10牛至精油的抑菌圈直径6 mm(P<0.05)。从图2可直接看出NaOH溶液处理使牛至精油的抑菌效果显著下降，培养皿几乎长满灰霉。根据GC-MS 分析结果，牛至精油中含有83.06%香芹酚和1.941%百里香酚，而酚羟基在水溶液中存在弱酸性易电离出氢离子，极易与NaOH溶液中的氢氧根离子结合生成水，导致酚羟基上的氢离子被NaOH溶液的钠离子取代生成酚钠，这与牛至精油在碱性pH值条件下紫外吸光度值发生很大变化的实验结论相吻合。
图1 牛至精油处理前后对灰霉的抗菌效果
Fig.1 Antifungal activities of oregano EO and treated
oregano EO against Botrytis cinerea
a-空白对照；b-1/10香芹酚；c-1/10牛至精油；d-NaOH
处理后的牛至精油
图2 牛至精油处理前后对灰霉的抑菌照片
Fig.2 Photos of oregano EO and treated oregano
EO against Botrytis cinerea
2.3.2 NaOH处理的牛至精油GC分析
香芹酚标品和NaOH溶液处理后的牛至精油GC图分别见图3-a，图3-b。在图3中，第1个峰均为稀释溶剂正己烷，第2个峰(出峰时间9 min左右)均为香芹酚。香芹酚是牛至精油中的主要成分，NaOH溶液处理后的牛至精油中香芹酚出峰急剧变小至几乎没有，这说明NaOH溶液处理后的牛至精油中仅有极少量未被完全反应消耗掉的香芹酚。这说明了NaOH溶液处理可以破坏牛至精油中的香芹酚。
综合以上研究分析，香芹酚为牛至精油中的抑菌活性成分，其抑菌关键点为香芹酚的酚羟基结构，一旦酚羟基遭受破坏，牛至精油的抑菌活性将被极大地削弱。此外，牛至精油的活性成分在遭受不同条件处理时(如光照、pH值、温度等)的稳定性也值得进一步深入研究。
a-香芹酚;b-NaOH溶液处理后的牛至精油
图3 香芹酚及NaOH溶液处理后的牛至精油GC图谱
Fig.3 GC spectrum of carvacrol and oregano
EO treated with NaOH solution
2.4 牛至精油抑菌活性成分稳定性分析
2.4.1 香芹酚紫外吸收波长
香芹酚乙醇溶液在217、276 nm处有2个吸收峰。3×10-5g/mL的香芹酚稀释液在217、276 nm下的吸光度值分别为1.854和0.625。质量浓度为3×10-4、3×10-3g/mL的香芹酚稀释液在217、276 nm下的吸光度值均大于3.0，超出紫外分光光度计测试的精度范围。因此确定217、276 nm为香芹酚的紫外吸收波长，3×10-5g/mL的香芹酚乙醇稀释液为合适的紫外可见分光光度计测试用浓度。3×10-5g/mL的香芹酚乙醇稀释液的紫外可见分光光度计扫描图见图4，其中1号峰波长为276 nm，2号峰波长为217 nm。卢燕霞等[15]采用紫外分光光度计对牛至精油乙醇溶液进行全波长扫描时也得出了相似的结论，发现香芹酚在276 nm有最大紫外吸收峰，与本实验结论一致。
图4 香芹酚紫外扫描曲线
Fig.4 UV scanning curve of carvacrol
2.4.2 光照时间对香芹酚稳定性的影响
不同光照时间对香芹酚紫外吸光度值的影响见图5-a。随着光照时间的增加，香芹酚的紫外吸光度值无明显变化，光照8 h后吸光度值仍无显著变化(P>0.05)，这说明香芹酚分子结构在自然光照条件下未发生改变，也即自然光照对香芹酚的稳定性无影响。
2.4.3 60 ℃处理对香芹酚稳定性的影响
60 ℃恒温水浴处理不同时间对香芹酚紫外吸光度值的影响见图5-b。随着处理时间的增加，香芹酚吸光度值无明显变化，8 h后吸光度值仍无显著变化(P>0.05)，这说明香芹酚分子结构在60 ℃处理条件下未发生改变，也即60 ℃处理对香芹酚的稳定性无显著影响。
2.4.4 不同湿度对香芹酚稳定性的影响
不同湿度条件对香芹酚紫外吸光度值的影响见图5-c。在不同湿度条件下随着时间的延长，香芹酚的吸光度值没有明显的变化，处理8 d后，吸光度值仍无显著差异(P>0.05)。这说明不同湿度处理对香芹酚的稳定性无显著影响。
2.4.5 不同pH值对香芹酚稳定性的影响
不同pH值对香芹酚紫外吸光度值的影响见图5-d。在pH值为2～10香芹酚乙醇溶液的吸光度值无明显差异(P>0.05)，随着pH值的增加，吸光度值上升，特别是pH值达到13，吸光度值出现大幅变化。这表明香芹酚在酸性和中性条件下稳定，在强碱环境中极不稳定。这是因为香芹酚与NaOH溶液发生化学反应，破坏了香芹酚原本的分子结构，导致其紫外吸光度值发生显著变化，这一现象与NaOH溶液处理后的牛至精油GC分析结果相吻合。刘万臣[14]用不同pH值条件处理丁香酚时也发现了类似的现象，在强碱性pH值条件下丁香酚的紫外吸光度值也出现了较大变化。
a-光照；b-60 ℃水浴处理；c-不同湿度处理；d-不同pH处理
图5 不同处理条件对香芹酚稳定性的影响
Fig.5 Effect of different treatment conditions on the stability of carvacrol
2.5 抗菌纸箱内香芹酚释放特性分析
抗菌纸箱内香芹酚气体相对含量的变化见图6。试剂瓶中香芹酚在GC中出峰面积为759 598.5。各组抗菌纸箱中释放的香芹酚相对含量随着牛至精油浓度增加而增大，并随着时间的延长均出现下降趋势，在第1天时，T1、T2、T3、T4抗菌纸箱内香芹酚的相对含量分别为 2.66%、6.61%、32.17%、43.47%，在第4天时分别减少为2.02%、3.57%、6.63%、10.18%。类似的研究也有报道，如ECHEGOYEN等[22]采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术测定了2种肉桂精油活性纸释放出的肉桂醛浓度，其中基于石蜡乳液的活性纸中释放出肉桂醛12～18 μg/mL，基于固体石蜡的活性纸释放的肉桂醛约为4 μg/mL。本实验测试香芹酚释放特性采用直接从抗菌纸箱中抽取气体的方式测量，香芹酚在纸箱中会存在损失，所以测试出的香芹酚释放量与纸箱抗菌涂层中实际释放出的香芹酚存在差异。依据抗菌纸箱中的缓释曲线，该牛至精油抗菌纸箱比较适合于草莓等货架寿命比较短的果蔬等农产品的保鲜包装。在抗菌涂层中添加多孔吸附材料或对涂层配方进行改进以期获得更佳的缓释效果值得进一步深入研究。
图6 抗菌纸箱内香芹酚相对含量变化
Fig.6 Changes in relative content of carvacrol in antimicrobial carton
3 结论
本实验研究分析了牛至精油对4种霉菌的抑菌活性及化学成分组成，着重对牛至精油的抑菌活性成分进行了研究，同时探讨了光照、温度、湿度、不同pH值对活性成分稳定性的影响，并以牛至精油涂布纸箱为例研究了牛至精油活性成分的释放规律。研究表明牛至精油对灰霉等4种霉菌具有强抑制活性，其主要成分及抑菌活性成分均是香芹酚，强碱条件会影响香芹酚的紫外吸光度值并破坏牛至精油的抑菌活性，自然光照、不同湿度以及60 ℃处理对香芹酚稳定性影响不显著。香芹酚在牛至精油抗菌纸箱中的释放规律表明,3%的牛至精油抗菌纸箱中香芹酚含量高于其他组抗菌纸箱，在第4天的相对含量仍为10.18%。本研究为植物源酚类抑菌剂在果蔬防腐保鲜中的应用提供理论指导。
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