大豆富含多种营养物质，其中蛋白质含量高达40%，是理想的蛋白质食品。大豆发芽后，蛋白质被豆内生物酶分解，氨基酸得以积累，部分油脂被分解，这些变化使营养物质更易被人体消化吸收[1-2]。据报道，发芽能改变大豆中某些化学成分(蛋白质、抗营养因子等)的组成，消除肠胃胀气的同时促进肠道吸收[3-5]，丰富 γ-氨基丁酸、异黄酮、VC等功能成分[6-7]。
乳酸菌是公认的益生菌，具有改善肠道微生态、利于消化吸收、抑制有害微生物等生理功能[8]。研究发现植物乳杆菌(来源于泡菜)用于发酵豆乳具有良好的生长及稳定特性[9]；罗伊氏乳杆菌易定植肠道调节后者免疫系统[10]，其发酵液具有抑菌效果，且未见到用于发酵豆芽乳的报道。乳酸菌能有效地将大豆异黄酮(soybean isoflavone，ISO)转化为更容易被肠道吸收的大豆异黄酮苷元。后者是常用的营养保健品，能有效预防心血管疾病、恶性肿瘤和骨质疏松症[11]。此外，豆乳制品不含胆固醇和乳糖，其发酵产品可作为动物乳制品的替代物，缓解乳糖不耐症[12]。研究乳酸菌发酵豆芽乳饮料，充分利用我国大豆资源，发挥乳酸菌发酵特有的作用，解决豆芽货架期短的问题[13]，获得接受度好的豆芽乳产品，具有良好的市场开发前景。
1 材料与方法
1.1 材料
大豆，市售；藕粉，云南德春绿色食品有限公司；食品级柠檬酸，吴江市恒达精细化工有限公司；大豆异黄酮标准品，上海伊卡生物技术有限公司；食用白砂糖、食用NaHCO3和食用葡萄糖,均从当地市场购买。
1.2 菌种
植物乳杆菌(CICC 20265)、罗伊氏乳杆菌(FS002)，来自实验室分离；嗜热链球菌(CICC 20174)、保加利亚乳杆菌(CICC 20358)，市售。低温保藏的菌种用MRS琼脂培养基复壮3代，获得生长旺盛的发酵菌种。
1.3 仪器与设备
CB-A360B型豆芽机，佛山市顺德区嘉壕实业有限公司；JM-130型胶体磨，廊坊市冠通机械有限公司；GJJ-0.03/60型高压均质机，上海台驰轻工装备有限公司；TSX-5005PD 型4 ℃冰箱、XR1型台式高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；DW-HL538型-80 ℃超低温冰箱，中科美菱低温科技有限责任公司；BPH9082型恒温生化培养箱，海博讯实业有限公司医疗设备厂；1260 infinity型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；VCX130型超声波破碎仪：美国Sonics。
1.4 工艺及优化方法
1.4.1 工艺流程
凝固型发酵豆芽乳制作工艺流程如下：
大豆芽→磨浆→过滤→去腥味→调配→均质→杀菌→冷却→接种→发酵→后熟→成品
大豆发芽48 h，NaHCO3去除涩味。均质[14]：混合液均质时间3～5 min，压力25～30 MPa。巴氏杀菌并冷却至40 ℃，接菌。
1.4.2 发酵菌种的筛选
以植物乳杆菌∶罗伊氏乳杆菌为2∶2、1∶2、2∶1、1∶1进行实验[15-16]，乳酸发酵剂(嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌=1∶1)为1%[17]，分别记为A、B、C、D组，E为只含1%发酵剂的对照组。测定发酵完成时样品的pH值，菌落总数和时间，结合感官评价，确定乳酸菌菌种配方。
1.4.3 发酵条件优化
(1)糖的添加量
固定蔗糖添加量为原料液质量的5%[15]，葡萄糖的添加量(质量分数)分别为0%、1%、2%、3%、4%进行发酵，记录样品的pH，结合感官评价得出添加糖的比例。
(2)豆芽与水的比例
为了获得组织均匀、黏稠的凝固型发酵乳，豆芽与蒸馏水分别以1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8 (g∶mL)送入胶体磨(记为A、B、C、D、E、F组分)，120目滤布过滤后称量滤渣质量，测定发酵乳黏度、pH和感官评价。
(3)稳定剂的添加
为了解决发酵豆芽乳稳定性问题，首次尝试以藕粉作为单一稳定剂。并以添加量(质量分数)为0%，1%，2%，3%，加入到豆乳中发酵，结合pH，持水力和感官评价结果得出藕粉的添加量。
(4)发酵温度的确定
为了确定乳酸菌的最适发酵温度，以温度为唯一自变量，记录凝固时间和pH值，结合感官评价确定最佳温度条件。样品分别置于35、36、37、38、39、40、41 ℃的恒温生化培养箱内发酵。
(5)最佳发酵工艺确定
分别以葡萄糖添加量，豆水比例，稳定剂添加量，发酵温度为因素，采用L9(34)表做正交实验(见表1)。根据凝固时间和pH，结合感官评价确定最佳发酵条件。
表1 正交实验因素水平表
Table 1 Table of orthogonal experimental factors
水平因素葡萄糖质量分数(A)/%豆∶水(B)稳定剂质量分数(C)/%发酵温度(D)/℃121∶5135231∶6237341∶7339
1.4.4 方法
(1)乳酸菌活菌数测定：参照文献[18]方法测定。
(2)pH值：采用FE20型pH计进行测定。
(3)黏度：采用黏度计在室温下对样品黏度进行测定。先用蒸馏水标定，再用待测样品进行测量，记录数据。
(4)持水率：样品置于离心管中称重，记为样品净重m1，g；总质量为m2，g；以5 000 r/min离心30 min，去除上清液且倒置离心管10 min，称重记为m3，g；计算持水率，如公式(1)，结果取正值。
持水力
(1)
(5)ISO含量：根据CHUN等[19]的方法用乙醇提取，C18-H柱(250 mm×4.6 mm)检测大豆发芽及发酵对异黄酮含量的影响。样品冰水浴超声10 min，离心收集上清液，通过0.22 μm滤膜过滤后用于高效液相色谱鉴定。检测波长为254 nm，样品以10 μL进样。
(6)感官评价：根据GB 19302—2010方法进行感官评价[20]。
表2 乳酸菌发酵豆芽乳感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard for lactic acid
bacteria fermented bean sprout milk
指标评价内容分值/分色泽均匀一致,呈乳白色或微黄色15～20色泽(20)色泽不均,呈微黄色或灰色9～14色泽灰暗或出现其他异常颜色<9凝乳均匀细腻,无气泡,允许有少量黄色脂膜和少量乳清15～20组织状态(20)凝乳不均匀也不结实,有乳清析出9～14凝乳有气泡,乳清分离,瓶口及酸奶表面均有霉斑<9有清香,纯正的发酵与豆香味15～20气味(20)香气平淡或有轻微异味9～14有腐败味,霉变味,酒精发酵及其他不良气味<9有纯正的发酵豆芽乳味,酸甜适口,回味有轻微涩味30～40滋味(40)酸味过度、不足,涩味较大或有其他不良滋味15～29入口有涩味,苦味或其他不良滋味<15
2 结果与分析
2.1 乳酸菌的影响
由图1可知，C组乳酸菌组合经4 h发酵完成，产酸量多于其他组合，活菌数为3.6×108 CFU/mL，感官评分最高；A组感官评分与C组合一致，菌种添加量最多；E组耗时最长为8 h，乳酸菌活菌数最低。因此选择C组合作为乳酸菌的配方，即植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和发酵剂分别为2%、1%、1%。
图1 发酵菌种组合及添加量
Fig.1 Different combination and addition under bacterial
for fermentation
注：A-2%植，2%罗，1%发酵剂；B-1%植，2%罗，1%发酵剂；
C-2%植，1%罗，1%发酵剂；D-1%植，1%罗，1%发酵剂；
E-1%发酵剂
2.2 豆芽乳发酵条件的确定
2.2.1 葡萄糖的影响
由图2可知，发酵乳的酸度随葡萄糖量增加而增加，无添加葡萄糖的发酵乳发酵不足，口感一般；葡萄糖添加量(质量分数)达3%时，发酵乳感官评分为92分；葡萄糖添加量4%的发酵乳产酸量最多，感官评分降低。因此，葡萄糖添加量应为3%。
图2 葡萄糖添加量对发酵豆芽乳的影响
Fig.2 Effect of glucose addition on fermented
bean sprouts milk
2.2.2 豆水比的影响
由图3可知，发酵乳的黏稠度随含水量增加而降低。实验组D中原料的含水量为80%，其酸度稍高，黏稠度较高；E组含水量为83.3%，黏度迅速降低，乳质地均匀不分层，细腻爽口；F组含水量高达85.7%，豆芽滤渣最少，黏度值最低，乳中有少量乳清析出，酸甜合适，口感细腻柔和，因此豆水比1∶6为佳。
图3 原料含水量对发酵豆芽乳的影响
Fig.3 Effect of water addition of raw materials on
fermented bean sprouts milk
注：A-豆水比1∶3；B-豆水比1∶4；C-豆水比1∶5；
D-豆水比1∶6；E-豆水比1∶7；F-豆水比1∶8
2.2.3 稳定剂的影响
莲藕在我国种植范围广泛[21]，由莲藕加工而成的藕粉是食品加工业的重要原辅料[22]。藕粉与其他淀粉配合成稳定剂使用已有报道[23]，但单独使用较少见。本研究以藕粉作为稳定剂，结果由图4可知，藕粉添加量(质量分数)为2%时，发酵乳持水率最高，产酸最多，感官评分最高，故选择添加量为2%的藕粉作为稳定剂。这表明，藕粉可以单独作为食品稳定剂添加，且发酵乳的组织及风味都达到标准。
图4 稳定剂添加量对发酵乳的影响
Fig.4 Effect of stabilizer addition on fermented soymilk
2.2.4 发酵温度的影响
由图5可知，当发酵温度为37 ℃时，豆芽乳的凝固时间最短为4 h，可节约生产成本；在37 ℃时，豆芽乳产酸最多，感官评分最高，因此选择37 ℃为发酵温度。
图5 温度对豆芽发酵乳的影响
Fig.5 Temperature effect on fermented soymilk
2.2.5 豆芽乳的最佳发酵条件
由表3可知，A2，B1，C2，D3条件综合得分最高，发酵乳色泽、组织形态、风味等的综合评定结果最好。由极差分析R值A>C>B>D可知，对发酵豆芽乳的影响为葡萄糖>稳定剂(藕粉)>豆水比例>温度；所以凝固型豆芽发酵乳的最佳工艺配方为葡萄糖添加量3%，稳定剂藕粉添加量2%，原料豆水比为1∶5，39 ℃发酵。以该条件进行发酵验证，所得发酵乳pH 4.2，活菌数为3.6×108CFU/mL，发酵乳品质达到标准。
表3 正交试验结果
Table 3 Orthogonal test results
实验编号因素ABCD得分/分1111187.62122290.13133388.44212393.65223190.56231289.47313286.38321384.79332187.2K188.789.1787.288.4K291.1788.490.388.6K386.0788.388.488.9R5.10.873.10.5
2.3 大豆异黄酮的分析
通过乙醇提取，高效液相色谱定量分析，经发芽及发酵处理ISO含量变化如表4所示。
表4 发芽与发酵处理对异黄酮的含量影响 单位：mg/mL
Table 4 Effect of germination and fermentation on the
content of isoflavone
检测成分大豆异黄酮初始大豆豆芽调配豆芽乳发酵乳大豆苷0.45±0.01b0.61±0.02a0.37±0.03c0.31±0.03d黄豆黄素0.75±0.12b0.62±0.16b1.47±0.05a1.64±0.07a染料木苷0.28±0.07a0.30±0.12a0.27±0.06a0.32±0.01a大豆苷元44.33±1.67c58.49±1.58a58.32±1.35a52.23±0.98b黄豆黄素苷元82.83±66.77a44.33±2.16a6.04±0.37a8.07±0.2ba染料木素48.31±7.6b61.74±1.28a4.52±0.43c7.60±0.91c
注：分析的值表示为平均值±标准偏差(n=3);同一行中不同的上标小写字母表示显著差异(P<0.05)
发芽与发酵一定程度的促进了大豆异黄酮含量的变化。发芽处理显著增加了大豆苷(34.1%)、大豆苷元(30.2%)和染料木素(59.4%)的含量；发酵处理的大豆苷和大豆苷元含量变化显著(P<0.05)，黄豆黄素苷元和染料木素含量增加，但与未发酵乳差异不显著；该过程染料木苷与黄豆黄素苷元的变化均不显著，进一步表明异黄酮有一定的稳定性。此外，染料木素具有抗肿瘤、抗氧化及抑菌作用[24]，与大豆苷和黄豆黄素苷元在发酵乳中含量较高，表明乳酸菌发酵可能促进了ISO向活性更高的苷元转化[25]，利于肠道对ISO的高效吸收。
3 结论
以发芽大豆为原料，得出配方(均为质量分数)植物乳杆菌(2%)、罗伊氏乳杆菌(1%)与发酵剂(1%)混合使用增加益生菌活性，延长发酵乳货架期；优化的葡萄糖量为3%，原料乳含水量83.3%，发酵温度为39 ℃，藕粉添加量2%，藕粉单独作为稳定剂能提高发酵乳的稳定性；柠檬酸为0.02%，柠檬酸可改善发酵乳口感。本研究发现，发芽处理促进功能因子大豆异黄酮积累，乳酸菌发酵使其发生一定程度的水解，补偿了发酵乳中的大豆异黄酮苷元。综上所述，通过优化豆芽发酵乳工艺条件，获得了高活性的大豆异黄酮，丰富了发酵乳的功能因子，因此，本文最佳工艺发酵的豆芽乳可作为良好的功能性发酵乳制品。
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