明胶是一种蛋白来源的生物材料,具有良好的成膜性,生物相容性和商业可获得性,用明胶制备的可食用膜具有原料来源广泛、安全性高及环境可降解的优点,成为当前食品包装领域的研究热点[1-2]。明胶膜的显著缺点是生物活性较低,阻碍了其在食品包装领域的应用,通过添加天然来源的改性剂以提升明胶膜的生物活性是一种有效的明胶膜改性方法[3-5]。精油通常提取自天然的植物和香料,被认为是食品工业中安全的食品添加剂,将精油作为明胶膜的改性剂,可以提高明胶膜的生物活性。TEIXEIRA等[5]用丁香精油、大蒜精油和牛至精油增强蛋白膜的抗氧化性和抗菌性;MARTUCCI等[6]选择牛至精油和薰衣草精油作为增强明胶膜生物活性的添加剂;TONGNUANCHAN等[7]通过添加柑橘属的精油获得明胶复合膜的抗氧化性。前期研究还发现,精油不仅能影响明胶复合膜的生物活性,同时影响明胶复合膜的物理性能,例如增强明胶复合膜的抗水性和延展性等[8]。许多研究者认为,在制备明胶膜的过程中添加精油会影响膜的气味品质,降低消费者对明胶膜的接受程度[8-10]。据我所知,目前还没有关于可食用膜气味评价的相关报道。
生姜精油、大蒜精油、肉桂精油、薄荷精油和百里香精油是常见的香料精油,它们均具有特殊的气味和较强的抗菌性。本实验的目的是在明胶膜的制备过程中添加上述5种精油,通过研究精油-明胶复合膜的抗菌性、膜厚、水蒸气透过性,机械性能,颜色,光学性能和微观结构来评价不同精油对复合膜生物活性和物理性质的影响,同时结合复合膜的感官评价,选择出最适合的精油作为明胶膜的生物改性剂。
鱼明胶,冻力为270,由中国江苏吉利鼎生物科技公司提供。
吐温80,美国Sigma公司;生姜精油、大蒜精油、肉桂精油、薄荷精油、百里香精油,中国御美化妆品公司;大肠杆菌[Escherichia coli(ATCC25922)],中国工业微生物菌种保藏管理中心;金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus(ATCC25923)],中国工业微生物菌种保藏管理中心。
质构仪(TA.XT Plus),英国Stable Micro Systems;色差仪(CR-10),日本Konica Minolta Optics;数字电子测微器(293-230),日本Mitutoyo;紫外可见分光光度计(Nanodrop200)、全反射红外光谱分析仪(Nicolet 6700),美国Thermo Fisher;扫描电子显微镜(S-3400N),日本Hitachi。
将质量浓度为80 g/L的鱼明胶在60 ℃条件下加热90 min,直至完全融化。甘油能起到塑化的作用,将10%(质量分数)的甘油加入混合液中,此混合液为A液。将精油和吐温80以1∶1(mL∶g)的比例进行混合,此混合液为B液。将B液加入到A液中进行混合,得到混合液C液,使得精油在C液中的质量浓度为10 g/L。将C液在室温下(25±2) ℃用磁力搅拌30 min。最后,将8 mL的C液浇铸在塑料培养皿上(90 mm×90 mm),直至自然风干。将取下来的膜放在温度为(25±2) ℃、相对湿度为(50±5)%的环境下进行保存[11]。复合膜的配置比例如表1所示。
表1 不同精油制备复合膜的配制比例
Table 1 The preparation proportion of composite
film incorporated with different essential oils
膜样品明胶/g甘油/g精油/mL吐温80/g去离子水/g控制组膜8.000.800.000.50100.00生姜精油复合膜8.000.801.000.50100.00大蒜精油复合膜8.000.801.000.50100.00肉桂精油复合膜8.000.801.000.50100.00薄荷精油复合膜8.000.801.000.50100.00百里香精油复合膜8.000.801.000.50100.00
选择革兰氏阴性菌E. coli和革兰氏阳性菌S. aureus对复合膜的抗菌性进行评价。在实验前,将复合膜放在紫外灯下照射3 h,其他物品均在121 ℃灭菌 20 min。选择Luria-Bertani(LB)培养基作为细菌培养基,调节细菌的初始浓度为1×105CFU/mL。用平板计数法计算培养液的细菌含量(lg CFU/mL)。将160 mg的膜样品加入LB培养基中,控制组中不添加任何膜样品。所有的样品在37 ℃条件下培养24 h[12]。所有的样品均重复3次。膜的抑菌能力通过公式(1)进行计算:
lgCFU/mLreduction=lgCFU/mLcontrol-lgCFU/mLfilm
(1)
1.5.1 膜厚
膜厚用数显电子测微器进行测量。在每个膜样中随机选择10个点进行测量,并用这10个点来计算膜厚的平均值。膜厚被用来计算拉伸强度,水蒸气透过性和不透光性[10]。
1.5.2 水蒸气透过性(water vapor permeability,WVP)
膜的水蒸气透过性是根据ASTM E96-95[13]的方法进行测量。在玻璃杯(直径为40 mm,深为25 mm)中装入干燥的CaCl2,然后用样品膜对玻璃杯进行密封。将玻璃杯放入含饱和水蒸气的密闭容器中,调节环境温度为30 ℃。每隔1 h测量1次玻璃杯的质量,直至玻璃杯的质量没有显著变化时,停止测量。膜的水蒸气透过性通过公式(2)进行计算:
(2)
式中:w代表玻璃杯增长的质量,g;l是膜的厚度,m;A是膜封口的面积,m2;t是玻璃杯质量变化的时间,s;P2-P1 是膜两侧的蒸气压差(4 244.9 Pa,30 ℃)。每个样品重复4次。
1.5.3 机械性能
参照ASTM D882[14]的方法,用质构仪对膜的拉伸强度和断裂伸长率进行测定。将膜样品裁剪成20 mm宽和50 mm长的条状,固定在仪器手柄的两端,设置手柄两端的间距为30 mm,调节测试速度为1 mm/s,促发力为5 g。每个膜样品测试10次,用以计算拉伸强度和断裂伸长率的平均值。拉伸强度(tensile strength,TS)和断裂伸长率(elongation at break,EAB)通过公式(3)和公式(4)计算:
(3)
(4)
式中:Fmax是将条状膜样品分离需要的最大负载,N;A是样品膜的切面面积,m2;L0是膜的初始拉伸长度(L0=30 mm);ΔL是膜断裂后的变化长度,mm。
1.5.4 颜色
膜的颜色用色差仪进行测量,通过L*(亮度),a*(红/绿),和b*(黄/蓝)和总色差ΔE四个参数表示颜色差异。总色差ΔE的计算如公式(5)所示:
(5)
式中: L, a和b是标准白板的参数(L=92.56,a=-0.49,b=-0.25),每个膜样品测试8次计算平均值[15]。
1.5.5 不透光性
用紫外可见分光光度计测量膜的不透光性,膜不透光性的计算如公式(6)所示:
不透光性
(6)
式中:A600是膜在波长为600 nm时的吸光度;x是膜的厚度,mm[16-17]。
1.5.6 扫描电镜分析
通过扫描电镜分析样品膜的切面微观结构,将膜样品固定在铜板上,对样品膜表面进行喷金处理,以利于导电,在20 kV的加速电压下进行拍照[18]。
将样品膜分别放在白色干净的盘子上,分别对样品膜进行编号。所有测试者的年龄均在20~63岁,对测试者进行描述性感官训练,测试者依据样品的等级给出0~8分的评价。感官评定标准如表2所示,分数越低,代表膜的性能越好。每组样品分别测试5次求得平均值[19]。
表2 感官评分标准
Table 2 Scoring criteria of sensory evaluation
感官类型感官描述0~2分3~4分5~6分7~8分视觉颜色几乎没有颜色浅黄色黄色深黄色光滑度很光滑光滑度较差轻微粗糙很粗糙透明度完全透明透明性好透明性差不透明触觉柔软度非常柔软偏软的偏硬的非常硬拉伸度容易拉伸可轻微拉伸较难拉伸不能拉伸厚度很薄的薄的厚的很厚的嗅觉气味几乎没有气味轻微精油气味精油气味强烈精油气味
用SPSS软件对数据进行分析,方差分析和多重比较分析对数据进行处理,当P<0.05被视为具有统计学意义。
添加不同精油复合膜对革兰氏阳性菌S. aureus和革兰氏阴性菌E. coli的抗菌能力如图1所示。由图1可以看出,所有复合膜对革兰氏阳性菌的抗菌性比对革兰氏阴性菌的抗菌性强;添加不同来源的精油对复合膜抗菌性的影响不同,生姜精油复合膜、大蒜精油复合膜和肉桂精油复合膜的抗菌性强于薄荷精油复合膜和百丽香精油复合膜。EL-BAROTY等[20]认为,生姜油中的β-倍半甲烯(β-sesquiphellandrene)、石竹烯(caryophyllene)和姜烯(zingiberene)是其有效抗菌成分,肉桂精油中的肉桂醛(cinnamaldehyde)和丁香酚(eugenol)是其有效抗菌成分;大蒜被证明对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和抗酸细菌都有抗菌性。SIVROPOULOU等[21]证明薄荷精油对8株革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有抗菌作用;KARAPINAR等[22]和BEUCHAT等[23]认为,肉桂精油、百里香精油对食源性微生物有广泛的抗菌性。同种精油的抗菌性会存在较大差异,这是因为提取方式差异、植物来源不同都会造成精油中有效成分的差异。因此,在明胶膜中添加以上5种精油,均能有效抑制革兰氏阳性菌S. aureus和革兰氏阴性菌E. coli的生长。精油通过破坏微生物的细胞壁,渗入到细胞内部,使细胞内部蛋白失去活性,从而导致细胞死亡。革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌多了一层脂多糖成分,这层脂多糖能阻止油性成分(精油)在细胞膜上的聚集,降低油性成分(精油)对细胞壁的渗透作用,从而使得精油对革兰氏阴性菌的抗菌能力减弱[24]。可见精油抗菌复合膜对革兰氏阳性菌的抗菌能力均强于对革兰氏阴性菌的抗菌能力。
图1 不同精油复合膜的抗菌能力
Fig.1 The antimicrobial activity of composite
film incorporated with different essential oils
注:不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)
加入不同精油复合膜的厚度如表3所示。控制组膜显示出最低的厚度,为61.00×10-3 mm;添加精油后,复合膜的厚度均有所上升,但添加等量的不同种类的精油会显示出不同的厚度,添加生姜精油、大蒜精油、肉桂精油、薄荷精油、百里香精油复合膜的膜厚分别为87.00×10-3 mm,84.00×10-3 mm,92.00×10-3 mm,103.00×10-3 mm,109.00×10-3 mm(P<0.05)。在明胶膜中加入精油会影响明胶膜的厚度,因为精油会阻碍蛋白分子间的相互作用,形成松散的结构,导致复合膜的厚度增加,而不同精油对明胶膜厚度的影响不同。AHMAD等[9]认为,明胶和精油之间的生物相容性的差异导致了复合膜厚度的差异,明胶和精油之间生物相容性好,形成的复合膜的结构越紧密,膜厚也越低。复合明胶膜根据厚度从低到高排列依次是:大蒜精油复合膜,生姜精油复合膜,肉桂精油复合膜,薄荷精油复合膜,百里香精油复合膜,由此推断精油明胶之间的相容性由好到差依次是:大蒜精油、生姜精油、肉桂精油、薄荷精油、百里香精油。膜的厚度是膜重要的基本性质,膜厚与膜的水蒸气透过性,拉伸强度和不透光性有关。
表3 不同精油复合膜的膜厚、水蒸气透过性、拉伸强度、断裂伸长率和水溶解性
Table 3 The thickness, water vapor permeability, tensile strength, elongation at break and water solubility
of composite film incorporated with different essential oils
膜样品厚度/mm水蒸气透过性/[g·(m·s·Pa)-1]拉伸强度/MPa断裂伸长率/%水溶解性/%控制组膜(61.00±3.80a)×10-3(4.21±0.31a)×10-1151.98±2.27a15.61±2.07a14.45±0.77a生姜精油复合膜(87.00±5.90b)×10-3(7.42±0.32b)×10-1125.13±2.00b72.38±5.60c16.20±0.63bc大蒜精油复合膜(84.00±5.00b)×10-3(7.16±0.25b)×10-1127.35±1.83b67.39±5.41b15.05±0.73ab肉桂精油复合膜(92.00±3.00b)×10-3(7.82±0.45b)×10-1124.88±1.88b83.21±9.86d17.08±0.77cd薄荷精油复合膜(103.00±4.60c)×10-3(9.00±0.51c)×10-1118.96±1.13c94.59±6.98e18.23±0.57de百里香精油复合膜(109.00±10.60c)×10-3(10.91±0.25d)×10-1117.51±2.07c104.69±10.41f18.70±0.52e
注:同一列不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)(下同)
添加不同精油复合膜的水蒸气透过性如表3所示。没有添加精油明胶膜的水蒸气透过性最低,为4.21×10-11g/(m·s·Pa)(P<0.05),添加1%精油后,复合膜的水蒸气透过性变低,但添加不同精油对复合膜水蒸气透过性的影响不同。复合膜水蒸气透过性的值从高到低依次是:百里香精油复合膜,薄荷精油复合膜,肉桂精油复合膜,生姜精油复合膜,大蒜精油复合膜。精油添加破坏了膜内部结构的紧实程度,使膜基质变得松散,增加了膜与水蒸气分子的接触面积,从而使膜的水蒸气透过性增加[25]。膜厚越厚,说明膜内部结构越松散,水蒸气分子越容易穿过膜,从而使膜的水蒸气透过性增加。因此,复合膜的水蒸气透过性反应了复合膜内部结构的疏松程度,且复合膜的水蒸气透过性值与膜的厚度成正比。
添加不同精油复合膜的机械性能如表3所示,膜的机械性可以通过拉伸强度和断裂伸长率2个指标来评价。没有添加精油的明胶膜具有最高的拉伸强度(51.98 MPa)和最低的断裂伸长率(15.61%);在添加了不同的精油后,复合膜的拉伸强度降低,断裂伸长率上升;而百里香复合膜的拉伸强度(17.51 MPa)最低、断裂伸长率最高(104.69%)。不同种类的精油对复合膜机械性能的影响不同。明胶膜是由长蛋白链维持其稳定结构,添加油滴会阻碍长链蛋白之间的相互作用,形成较短的蛋白链,导致膜的拉伸强度降低;同时,油滴的阻碍作用使膜形成了易于流动的区域,导致膜的断裂伸长率上升[26]。添加等量的精油制备复合膜,不同精油复合膜的拉伸强度和断裂伸长率表现出差异,这可能是精油与明胶相容性的差异造成的。当精油与明胶的相容性较好时,形成复合膜的结构较为紧密,膜的内部结构不容易发生流动,因此拉伸强度较高,断裂伸长率较低;如果精油与明胶的相容性较差,则拉伸强度变低,断裂伸长率较高。
添加不同精油复合膜的水溶解性如表3所示,控制组膜的水溶性值最低,不管添加哪种精油,都能使膜的水溶性值增大。生姜精油膜、大蒜精油膜、肉桂精油膜、薄荷精油膜和百里香精油膜的水溶性值分别为16.2%,15.05%,17.08%,18.23%,18.70%。纯明胶膜的内部结构比较紧密,不容易被水渗透,复合膜中因为添加了精油的缘故,内部结构更为松散,增加了复合膜与水的接触面积,使得复合膜的水溶性值增大[27]。
添加不同精油复合膜的颜色如表4所示。膜的颜色通过L*、a*、b*和ΔE值来表示,膜的颜色是重要的外观指标。所有薄膜的L*值没有显著差异(88.38~90.47);控制组膜具有最高的a*值(1.82),最低的b*值(-4.20);添加精油后,所有复合膜的a*值下降,b*值上升,肉桂精油复合膜具有最高的b*值和ΔE值。复合膜颜色的差异是由精油本身的颜色决定的,除肉桂精油复合膜外,所有复合膜都具有较好的亮度和外观色泽,不同精油的颜色对复合膜颜色的影响不大。
由表4还可以知道,控制组膜具有最低的不透光性,为1.06;添加精油后,所有复合膜的不透光性增加。精油的散色作用会降低复合膜的透光性,从而使得膜的不透光性增加。复合膜不透光性的强弱与精油的添加量和添加种类有关:添加量越多,散光性越强,不透光性越强;精油与明胶的生物相容性越好,精油颗粒分散越均匀,散光性增强,不透光性增强。生姜精油膜的不透光度值最高,可能是因为生姜精油与明胶的生物相容性最好,在膜中的分散得更均匀,散光性最弱,从而不透光性最强。
表4 不同精油复合膜的颜色和不透光性
Table 4 The color and opacity of composite
film incorporated with different essential oils
膜样品ΔEL*a*b*不透光性控制组膜5.07±0.19b90.13±0.13b1.82±0.12a-4.20±0.27a1.06±0.13a生姜精油复合膜3.96±0.27cd90.44±0.85b1.59±0.07b-1.62±0.13bc8.30±0.75e大蒜精油复合膜4.42±0.27c89.64±0.80b1.74±0.07a-1.84±0.11b6.43±0.46d肉桂精油复合膜6.77±0.52a88.38±0.50a1.40±0.04c2.76±0.15e4.25±0.37c薄荷精油复合膜3.92±0.34cd90.45±0.32b1.43±0.05c-1.52±0.09cd2.78±0.50b百里香精油复合膜3.51±0.31d90.47±0.61b1.40±0.07c-1.31±0.08d1.14±0.13a
添加不同精油复合膜的扫描电镜的切面图如图2所示。控制组膜显示出最紧实的切面结构,添加精油后,所有复合膜的切面呈现出不同程度的松散状态。扫描电镜切面图可以更直观地观察复合膜的内部结构,从各复合膜的切面形态可以观察到,生姜精油复合膜和大蒜精油复合膜切面的松散程度最低,而百丽香精油复合膜的松散程度最高,肉桂精油复合膜和薄荷精油复合膜的松散程度处于中间。复合膜内部结构的松散程度与复合膜的其他性质密切相关,松散程度越高,厚度越厚,水蒸气透过性越高,拉伸强度越低,断裂伸长率越高。
a-控制组膜;b-生姜精油复合膜;c-大蒜精油复合膜;d-肉桂精油
复合膜;e-薄荷精油复合膜;f-百里香精油复合膜
图2 不同精油复合膜的扫描电镜分析
Fig.2 The SEM analysis of composite film incorporated with
different essential oils
不同精油制备复合膜的感官分析如图3所示。复合膜感官评分的分值越低,说明复合膜的感官评价越好。膜厚、拉伸度和柔软度是属于触觉的感官评价,百里香复合膜在膜厚、拉伸度和柔软度的分值最高,其次是薄荷精油复合膜和肉桂精油复合膜,大蒜精油复合膜和生姜精油复合膜的分值较低。透明度、光滑度和颜色是属于视觉的感官评价,5组复合膜在透明度上的差异很小,薄荷精油复合膜和百里香精油复合膜比生姜复合膜、大蒜精油复合膜和肉桂精油复合膜的光滑度差,而肉桂精油复合膜的颜色明显比其他复合膜的颜色深,这与肉桂精油本身的颜色有关。在嗅觉感官评价中,大蒜精油复合膜和肉桂精油复合膜都有显著的精油气味,百里香精油复合膜的气味稍弱,而生姜精油复合膜和薄荷精油复合膜的气味最轻。AURELI等[28]认为:虽然大多数精油可用于抑制食物来源的微生物的生长,但是必须考虑精油气味对食物的影响。因此,对添加到明胶膜中的精油,要综合考虑对复合膜的物理性能,视觉感受和气味的影响。通过感官评价的结果可知,生姜精油复合膜的感官评价总得分最小,为16.3分,大蒜精油复合膜、肉桂精油复合膜、薄荷精油复合膜和百里香精油复合膜感官评价的分值依次为21.2分,23.77分,20.53分和27.23分。生姜精油复合膜的感官评价效果最好,因此,生姜精油最适合作为改性剂添加到明胶膜中。
图3 不同精油制备复合膜的感官分析
Fig.3 The sensory evaluation of composite film
incorporated with different essential oils
不同精油与明胶膜生物相容性的差异会导致复合膜功能性质和内部结构的差异。添加生姜精油、大蒜精油和肉桂精油制备复合膜的抗菌性较强,且膜厚、水蒸气透过性值、断裂伸长率和水溶解性较低,拉伸强度较大,不透光性较高;通过感官评价分析,大蒜精油复合膜和肉桂复合膜的精油气味较重,肉桂精油复合膜的颜色较深,均影响复合膜品质,而生姜精油复合膜的感官评价最佳。生姜精油制备的复合膜具有较好的抗菌性和物理性质,且没有突出气味,因此生姜精油是最适合的精油改性剂。
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