我国农产品资源丰富，分布广泛，已形成了不同特色的农产品加工产业，但同时也产生了大量的副产物，如玉米皮、醋糟、白酒酒糟等，均含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物和其他有效物质，主要用于饲料及发酵行业[1-10]；但用量有限，总体利用程度低下，产品附加值严重偏低，环境污染严重，缺少综合利用模式[11]。因此，变废为宝、化害为利、保护环境、节约资源，实现废弃物资源化利用是当今社会研究的热点之一[12]。
玉米皮、醋糟、白酒酒糟属于生物质材料，含有丰富的多糖类物质半纤维素，其中玉米皮中约占30%～50%[1]，醋糟干固物中约占15%～25%[13]，白酒酒糟中约占10%～12%(主要为多缩戊糖类物质)[14]。半纤维素是一类复合聚糖的总称，包括木聚糖、阿拉伯聚糖、甘露聚糖等[15-16]。相关研究表明，木聚糖和阿拉伯聚糖等糖作为功能性低聚糖，具有独特的生理功能，在食品、饲料和医药方面具有广泛的用途[17-19]，在营养与保健、畜牧养殖、植物生长调节及抗病害等方面具有极大的潜力[20]。因此，提取玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纤维素中的水解糖(聚糖)具有十分重要的研究意义。目前，国内外对提取农产品副产物半纤维素中水解糖的研究较多，但多是关于预处理工艺和水解工艺的报道，多数研究未对这些获得的半纤维素水解糖进行分离纯化。为了更深层次解析这些农产品副产物半纤维素水解糖的组成及性能，对所得到的半纤维素水解糖进行分离纯化必不可少。
在实验室前期研究中已对玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纤维素的水解方法进行了优化，本研究以这3种副产物为原料，采用优化的低浓度硫酸法水解工艺对其半纤维素进行水解，利用活性炭法对半纤维素水解糖中的色素进行脱除，进一步应用D301弱阴离子交换层析、001×7强阳离子交换层析联合D201强阴离子交换层析对所得水解糖进行分离纯化，采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)对所得高纯度水解糖单糖组成进行测定。本研究以期为玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纤维素水解糖结构解析及功能性产品的研究开发提供初步理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玉米皮,齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司；醋糟,齐齐哈尔黑龙酿造有限责任公司；白酒酒糟,北大仓集团有限公司。
D301弱阴离子交换树脂、001×7强阳离子交换树脂及D201强阴离子交换树脂,浙江争光实业股份有限公司。D(+)-葡萄糖(glucose，Glu)、D(+)-木糖(xylose，Xyl)、L-阿拉伯糖(arabinose，Ara)，山东龙力生物科技股份有限公司；NaOH、四水酒石酸钾钠、CuSO4、亚铁氰化钾、葡萄糖、浓HCl等试剂均为国产分析纯；浓H2SO4为国产色谱纯。
1.2 仪器与设备
立式压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械有限公司；布氏漏斗过滤器,蜀牛玻璃仪器有限公司；手持折光计,成都泰华光学有限公司；有机玻璃离子交换柱,江苏金三阳水处理科技江苏有限公司；BIO RAD Aminex HPX-87H色谱柱，美国BIO-RAD公司；谱锐美高效液相色谱仪,日立公司。
1.3 试验方法
1.3.1 三种副产物半纤维素水解糖粗品的制备工艺流程
将玉米皮、醋糟、白酒酒糟分别用自来水浸泡12 h、反复冲洗以去灰尘等杂质，洗净后的玉米皮、醋糟、白酒酒糟用三足离心机进行渣液分离，并置于105 ℃恒温干燥箱中烘干，干燥后用粉碎机粉碎，过 40 目筛。
1.3.1.1 玉米皮半纤维素水解糖粗品的制备
以H2SO4作为催化剂，在H2SO4质量分数1.2%、水解温度125 ℃、料液比1∶8条件下将玉米皮水解3 h，微型三足离心机3 000 r/min 离心10 min，取流出液加入0.5%质量分数的粉末活性炭，置于振荡器中75 r/min 振荡30 min脱色，4 500 r/min 离心 10 min，取上清液，即得玉米皮半纤维素水解糖液粗品，备用。
1.3.1.2 醋糟半纤维素水解糖粗品的制备
以H2SO4作为催化剂，在H2SO4质量分数1.5%、水解温度123 ℃、料液比1∶8条件下将醋糟水解2.5 h，微型三足离心机3 000 r/min 离心10 min，取流出液加入1.0%(质量分数)的粉末活性炭，置于振荡器中80 r/min振荡35 min脱色，4 500 r/min 离心10 min，取上清液，即得醋糟半纤维素水解糖液粗品，备用。
1.3.1.3 白酒酒糟半纤维素水解糖粗品的制备
以H2SO4作为催化剂，在H2SO4质量分数1.0%、水解温度123 ℃、料液比1∶8条件下将白酒酒糟水解3 h，微型三足离心机3 000 r/min 离心10 min，取流出液加入1.0%(质量分数)的粉末活性炭，置于振荡器中75 r/min振荡35 min脱色，4 500 r/min离心10 min，取上清液，即得白酒酒糟半纤维素水解糖液粗品，备用。
1.3.2 三种副产物半纤维素水解糖的分离纯化
1.3.2.1 D301弱阴离子交换层析
将 D301弱阴离子交换树脂活化后采用湿法装柱(2.5 cm×20 cm)，以2倍柱体积的去离子水进行冲洗，至水接近中性，取脱色后的半纤维素水解糖液样品，上样D301弱阴离子交换柱进行分离纯化，控制2倍柱体积的流量，用手持折光计随时测出口的可溶性固形物浓度，当出口糖液折光浓度达1 °Bx时，开始收集出口糖液；随时测出口糖液的pH，当检测到出口pH和进口pH基本持平时，说明柱子失效，停止上样；用去离子水对树脂进行冲洗，控制流速为2 BV/h，当出口糖液低于浓度1 °Bx时停止收集，收集到的出口糖液，备用。
1.3.2.2 001×7强阳离子交换层析
将 001×7强阳离子交换活化后采用湿法装柱(2.5 cm×20 cm)，以2倍柱体积的去离子水进行冲洗，至水接近中性，取经D301弱阴离子交换层析收集到的样品，上样001×7 强阳离子交换柱进行分离纯化，控制2倍柱体积的流量，用手持折光计随时测出口的可溶性固形物浓度，当出口糖液折光浓度达1 °Bx时，开始收集出口糖液；随时测出口糖液的pH，当检测到出口pH和进口pH基本持平时，说明柱子失效，停止上样；用去离子水对树脂进行冲洗，控制流速为2 BV/h，当出口糖液低于浓度1 °Bx时停止收集，收集到的出口糖液，备用。
1.3.2.3 D201强阴离子交换层析
将D201强阴离子交换树脂活化后采用湿法装柱(2.5 cm×20 cm)，以2倍柱体积的去离子水进行冲洗，至水接近中性，取经001×7强阳离子交换层析收集到的样品，上样D201强阴离子交换柱进行分离纯化，控制控制2倍柱体积的流量，用手持折光计随时测出口的可溶性固形物浓度，当出口糖液折光浓度达1 °Bx时，开始收集出口糖液；随时测出口糖液的pH，当检测到出口pH和进口pH基本持平时，说明柱子失效，停止上样；用去离子水对树脂进行冲洗，控制流速为2 BV/h，当出口糖液低于浓度1 °Bx时停止收集，收集到的出口糖液，即为精制半纤维素水解糖。
1.3.3 半纤维素水解糖的单糖组成分析—高效液相色谱法
3种单糖混合标准液配制：D-葡萄糖质量浓度为10 mg/mL，D-木糖质量浓度为20 mg/mL，L-阿拉伯糖质量浓度为10 mg/mL，置于 4 ℃冰箱中备用，使用时按体积比1∶1∶1 混合，再进行0.22 μm滤膜、超声波脱气处理。
待测样品前处理：取精制半纤维素水解糖，加入超纯水稀释，稀释至可溶性固形物浓度为10 mg/mL，再进行0.22 μm滤膜过滤、超声波脱气处理，得 10 mg/mL的样品水解糖液备用。
色谱条件：色谱柱：BIO RAD Aminex HPX-87H；流动相0.005 mol/L硫酸溶液；流速0.600 mL/min；柱温60 ℃；进样量20 μL；示差检测器温度45 ℃。
1.3.4 半纤维素水解糖相关指标测定
1.3.4.1 可溶性固形物浓度的测定
采用手持折光计法测定半纤维素水解糖液粗品、脱色后的半纤维素水解糖液、离子交换层析收集的精制半纤维素水解液糖样品的可溶性固形物浓度。
1.3.4.2 总还原糖含量测定
采用斐林试剂法测定半纤维素水解糖液粗品、脱色后的半纤维素水解糖液、离子交换层析收集的精制半纤维素水解液糖样品的总还原糖含量。
1.3.4.3 总还原糖损失率及纯度计算
总还原糖损失率及纯度如公式(1)、公式(2)所示：
糖液中总还原损失率
(1)
式中：m1,处理前糖液中总还原糖质量，g；m2,处理后糖液中总还原糖质量，g。
糖液纯度
(2)
式中：ρ1,糖液中的总还原糖质量浓度，g/100mL；ρ2,糖液中的可溶性固形物质量浓度,g/100mL。
1.3.4.4 电导率测定
采用电导率仪测定电导率。
2 结果与分析
2.1 分离纯化结果
通过活性炭脱色、D301弱阴离子交换层析、001×7强阳离子交换层析、D201强阴离子交换层析对3种副产物半纤维素水解糖进行分离纯化，获得较好的效果。半纤维素水解糖的总还原糖回收率和纯化情况如表1所示,水解得到的3种副产物的半纤维素水解糖粗品在脱色后可溶性固形物含量和电导率均有一定程度的降低，但总还原糖含量增加，说明脱色后糖液体积减少，即有一部分糖被活性炭吸附；水解糖的纯度均升高，分别升高了4.13%、4.96%、8.50%，总还原糖的损失率分别为3.21%、2.96%、3.05%。
表1 三种副产物半纤维素水解糖纯化结果
Table 1 Purification of hydrolysis sugar from hemicellulose of three by-productions
原料步骤可溶性固形物浓度/[g·(100 mL)-1]总还原糖/[g·(100 mL)-1]纯度/%电导率/(μs·cm-1)总还原糖损失率/%玉米皮低浓度酸水解9.005.5361.4423 108/活性炭脱色8.805.6363.9819 8543.21D301离子交换层析7.305.1870.9610 6232.74001×7离子交换层析6.505.0076.926172.30D201离子交换层析4.604.0487.831052.42醋糟低浓度酸水解6.003.4156.8320 320/活性炭脱色5.703.4059.6518 8932.96D301离子交换层析4.653.2870.5411 5532.67001×7离子交换层析4.002.8972.257082.45D201离子交换层析3.202.7285.001142.30白酒酒糟低浓度酸水解5.913.5259.5624 365/活性炭脱色5.643.6564.7119 9973.05D301离子交换层析4.933.4068.9712 5662.66001×7离子交换层析4.293.2174.836862.91D201离子交换层析3.282.8687.20952.67
注：“/”表示未检测
脱色后的3种糖液经D301离子交换层析后，可溶性固形物含量、电导率和总还原糖含量均有一定程度的降低，说明水解糖纯度进一步升高，分别升高了10.91%、18.28%、6.58%，总还原糖的损失率分别为2.74%、2.67%、2.66%。D301离子交换层析收集的糖液经001×7离子交换层析后，可溶性固形物含量、电导率和总还原糖含量亦均有一定程度的降低，水解糖纯度均再一次升高，分别升高了8.40%、2.42%、8.50%，总还原糖的损失率分别为2.30%、2.45%、2.91%。001×7离子交换层析收集的糖液经D201离子交换层析后，可溶性固形物含量和总还原糖含量持续降低，水解糖纯度持续升高，分别升高了14.18%、17.65%、16.53，总还原糖损失率分别为2.42%、2.30%、2.67%。
通过活性炭脱色、D301弱阴离子交换层析、001×7强阳离子交换层析、D201强阴离子交换层析进行分离纯化后，玉米皮半纤维素水解糖纯度为87.83%，纯度提高了42.95%，总还原损失率为10.67%；醋糟半纤维素水解糖的纯度为85.00%，纯度升提高了49.57%，总还原损失率为10.38%；白酒酒糟半纤维素水解糖的纯度为87.20%，纯度提高了46.19%，总还原损失率为11.29%。3种副产物的半纤维素水解糖均获得了较好的纯化效果，进一步说明分离纯化可更好的去除各种杂质，提高糖的纯度。
2.2 三种副产物半纤维素水解糖的单糖组分分析结果
糖类分析的主要目的有两类：即单糖、寡糖的组成和多糖的分子质量及其分布。糖类物质的分离可以通过HPLC在色谱柱中实现。采用 BIO RAD Aminex HPX-87H高效液相色谱法对3种副产物半纤维素水解糖的单糖组成进行分析，结果如图1～图4所示。由图1可得各标准单糖的保留时间依次为D-葡萄糖8.666 min，D-木糖9.286 min，L-阿拉伯糖10.116 min。
由图2可知，玉米皮半纤维素水解糖高效液相色谱图中出现3个峰，保留时间与前期预实验中蔗糖、乳糖、甘露糖、半乳糖、果糖、半乳糖醇、甘露糖醇、山梨醇、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇和木糖醇等11种标准品的保留时间不同，而与D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖标准品出峰保留时间一致，表明玉米皮半纤维素水解糖主要由D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖组成，其中D-木糖含量最高，各单糖物质的量比为1.00∶3.49∶1.74。赵玮[12]利用固体酸催化法对玉米皮半纤维素进行水解，HPLC分析结果表明，玉米皮水解液主要由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖3种单糖组成，其中葡萄糖28.21%，木糖58.39%，阿拉伯糖13.41%。张莉莉[20]对玉米皮渣酸水解液中单糖组成进行测定，离子色谱法分析发现，葡萄糖相对含量11.73%，木糖相对含量33.77%，阿拉伯糖相对含量20.74%，即各单糖物质的量比为1.00∶2.88∶1.77；徐梦莹[21]利用酸性电解水为催化介质，水解玉米皮半纤维素，脱色液连续两次通过阳、阴离子串联交换树脂(001×7、201×7)后，所得糖液含有35.8%L-阿拉伯糖，33.4%D-木糖和30.8%低聚糖。这些结果与本实验结果在单糖组成类型上一致，但在单糖组成比例上存在一些差异，可能是由玉米皮半纤维素水解糖的提取纯化方法、单糖测定方法不同造成的[22]。
由图3可知，醋糟半纤维素水解糖高效液相色谱图中出现的峰分别对应单糖标准品峰1、2、3，表明醋糟半纤维素水解糖主要由D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖组成，其中D-木糖含量最高，各单糖物质的量比为1.00∶2.70∶1.41。目前还未发现其他学者利用醋糟制备半纤维素水解糖的研究。由图4可知，白酒酒糟半纤维素水解糖高效液相色谱图中出现的峰分别对应单糖标准品峰1、2、3，表明白酒酒糟半纤维素水解糖主要是由D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖组成，其中以D-葡萄糖含量最高，各单糖物质的量比为1.00∶0.84∶0.16。李福佳[23]以浓香型白酒糟为原料，利用稀硫酸水解制备木糖提取液，经中和、脱色、离子交换制备还原糖，经高效液相色谱检测葡萄糖含量为10.2%，木糖含量为80.8%，阿拉伯糖含量为9.0%，木糖含量最高，各单糖物质的量比为1.00∶7.92∶0.88。该结果与本实验结果在单糖组成类型上一致，但在单糖组成比例上存在一些差异，可能是因白酒酒糟原料来源、半纤维素水解糖提取纯化方法、单糖测定方法的不同造成的。
1-D-葡萄糖；2-D-木糖；3-L-阿拉伯糖
图1 混合标准单糖高效液相色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of monosaccharide standars
1-D-葡萄糖；2-D-木糖；3-L-阿拉伯糖
图2 玉米皮半纤维素水解糖高效液相色谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of hydrolysis sugar from hemicellulose of corn husk
1-D-葡萄糖；2-D-木糖；3-L-阿拉伯糖
图3 醋糟半纤维素水解糖高效液相色谱图
Fig.3 HPLC chromatogram of hydrolysis sugar from hemicellulose of vinegar residue
1-D-葡萄糖；2-D-木糖；3-L-阿拉伯糖
图4 白酒酒糟半纤维素水解糖高效液相色谱图
Fig.4 HPLC chromatogram of hydrolysis sugar from hemicellulose of distiller′s grains
3 结论
玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纤维素水解糖经过低浓度酸法水解提取、水解糖溶液加入活性炭脱色后，再依次经过D301弱阴离子交换层析、001×7强阳离子交换层析及D201强阴离子交换层析进行分离，对分离纯化后的糖液进行收集，分别得到玉米皮精制半纤维素水解糖、醋糟精制半纤维素水解糖、白酒酒糟精制半纤维素水解糖。研究结果说明，采用D301弱阴离子交换层析、001×7强阳离子交换层析及D201强阴离子交换层析的方法可对玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纤维素水解糖起到很好的分离纯化效果。采用 HPLC对玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纤维素水解糖进行分析，通过与混标的单糖标准品色谱图进行对比分析，得到这3种原料的半纤维素水解糖均是由D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖3种单糖按照不同比例缩合而成，玉米皮半纤维素水解糖中各单糖物质的量比为1.00∶3.49∶1.74；醋糟半纤维素水解糖中各单糖物质的量比为1.00∶2.70∶1.41；白酒酒糟半纤维素水解糖中各单糖物质的量比为1.00∶0.84∶0.16。
近年来，功能糖的发展促进了农产品副产物半纤维素水解糖的研究。为进一步探索其生物学功能及作用机理，对农产品副产物半纤维素水解糖的详细结构分析(如单糖组成、糖苷键连接方式等)的研究刻不容缓。本研究对玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纤维素水解糖进行了分离纯化，对其单糖组成进行了分析，研究结果可为半纤维素水解糖的精细结构解析及进一步的开发利用奠定基础。
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