红树莓，也被称为“覆盆子”和“马林果”，柔嫩多汁、风味独特，被誉为“第三代水果”和“黄金水果”[1-2]。红树莓富含糖、苹果酸、柠檬酸、蛋白质、维生素和氨基酸等多种营养物质成分，易被人体吸收，具有改善新陈代谢的作用；还含有丰富的生物活性物质，具有抗氧化、提高免疫力、抗癌等作用[3-4]。100 g红树莓中的酚类物质高达500 mg，其中又以花色苷、树莓酮较为突出[5]。红树莓及其活性成分在食品、保健品、化妆品和医药领域具有广阔的发展前景[6-7]。
红树莓鲜果酸含量极高，导致在产品开发中存在一系列的问题，如口感不佳、发酵微生物难以生长等，因此，红树莓降酸成为亟待解决的问题[8]。生物降酸法是指微生物以有机酸为碳源，将其利用分解，从而达到降酸目的[9]。同时，微生物在降酸过程中应避免其对果汁产生负面影响，若能赋予果汁更优的品质将具有更大的意义[10]。本研究筛选鉴定了3株降酸酵母，并对比分析了3株酵母对红树莓功能饮料降酸效果和活性物质的影响，确定适宜的发酵菌株。
1.1.1 实验原料
脐橙、砂糖橙、芒果、草莓、苹果、梨采购于武汉市亲亲果园华农店；红树莓采购于湖北金莓科技发展有限公司。
1.1.2 主要培养基
液体沙氏培养基(g/L)：蛋白胨10、葡萄糖40，115 ℃，20 min高压蒸汽灭菌。
固体沙氏培养基(g/L)：蛋白胨10、琼脂16、葡萄糖40，115 ℃, 20 min高压蒸汽灭菌。
柠檬酸固体培养基(g/L)：按照固体沙氏培养基体积加入已灭菌的4.8 mL/L的20%(体积分数)柠檬酸原液混匀，调整培养基pH值约为4。
1.1.3 工具酶和试剂
TransStart®FastPfu DNA聚合酶，北京全式金生物技术有限公司产品；dNTPs和DL5000 Marker，宝生物工程(大连)有限公司；DNA回收纯化试剂盒，上海赛百盛基因技术有限公司；琼脂糖，Biowest；草酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲醇、乙腈，色谱纯；无水乙醇、异戊醇、蔗糖、液体沙氏培养基等其他普通试剂均为国产分析纯。
1.1.4 仪器与设备
Agilent Technologies 1260高效液相色谱，美国Agilent公司；Thermal Cycler (My Cycler) PCR仪，美国 Bio-Rad 公司；DYY-8C型电泳仪，北京六一仪器厂；CR21G高速冷冻离心机，日本Hitachi公司；HQL300B恒温大幅振荡摇床，武汉中科科仪技术发展有限责任公司；SKP-02.420电热恒温培养箱，黄石市恒丰医疗器械有限公司；NIKON Y-FL 081283 摄影生物显微镜，日本NIKON公司。
1.2.1 降酸菌株的筛选
取10 g轻微腐烂的水果实验原料，带皮剪碎后置于锥形瓶内，加入90 mL无菌蒸馏水，置于180 r/min、28 ℃的恒温大幅振荡摇床中，振荡1 h左右至原料混合均匀。取均匀后的样品液1 mL加入到50 mL 液体沙氏培养基内，于摇床培养至培养液浑浊，稀释涂布至柠檬酸固体培养基，28 ℃条件下培养至出现单菌落。肉眼观察菌落外观形态、含水状态、菌落颜色等，并镜检观察菌体形态和大小等特征[2]。
按照红树莓与水按质量比1∶2，打浆至浆液均匀细腻，无明显颗粒。4 000 r/min离心5 min，上清液用双层纱布过滤去籽得滤液，巴氏杀菌后备用。将初筛所得菌株经液体沙氏培养基培养12 h后，取400 μL 加入10 mL预处理过的红树莓果汁内混匀，置于180 r/min、28 ℃有氧发酵培养96 h，每隔8 h测定一次pH，选取在较短时间内将pH提升最多的菌株，即降酸能力良好的菌株[11]。
1.2.2 降酸酵母的鉴定
提取降酸能力良好菌株的DNA，以DNA为模板，采用 ITS区的引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳处理，对目的片段的产物进行片段纯化回收后测序，将测序结果在NCBI上进行分析比对，并通过MEGA 4软件构建系统进化树。
1.2.3 红树莓发酵功能饮料的制备
将冰冻红树莓室温解冻，红树莓和水按照质量比为1∶2的比例榨汁。巴氏灭菌后冷却至室温。将种子液按4%(体积分数)的接种量接种于红树莓果汁中，置于大幅振荡摇床上，在180 r/min、28 ℃的条件下发酵，发酵周期为72 h。每12 h取样一次，冷冻保藏备用，其中，以未发酵的红树莓汁作为对照进行对比分析[12]。
1.2.4 有机酸液相检测
有机酸通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)进行检测[13]。取2 mL发酵液，12 000 r/min离心2 min后，将上清液适当稀释，用0.22 μm水相微孔滤膜过滤至样品瓶中，利用HPLC检测。色谱条件：Zorbax SB-Aq色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相为 (乙腈)∶ (20 mmol/L Na2HPO4)=1∶99，磷酸调节pH至2.0；流速0.5 mL/min；柱温35 ℃；紫外检测器波长210 nm；进样量10 μL。
1.2.5 总酚的测定
总酚含量通过福林酚法进行测定[14]。向0.2 mL稀释过的样品中加入0.2 mL, 1 mol/L的福林酚试剂，反应3 min，加入0.4 mL, 1 mol/L Na2CO3溶液，室温反应90 min，加入2 mL去离子水，725 nm处测定吸光度。以没食子酸为标准品制作标准曲线，通过标准曲线计算没食子酸的浓度，红树莓发酵液中的总酚含量等价表示为mg没食子酸/L。
1.2.6 抗氧化活性的检测
红树莓功能饮料的抗氧化活性通过测试1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除率进行表征[15]，取发酵液用甲醇分别稀释10、20、30、40、50、100倍，振荡混匀。于12 000 r/min中离心3 min，吸取0.5 mL上清液，加入2.5 mL, 75 μmol/L DPPH甲醇溶液，避光室温反应90 min，于517 nm处检测吸光度。按照公式(1)计算DPPH自由基清除率：
DPPH清除率
(1)
1.2.7 数据统计分析
每组实验设计3个重复，采用SPSS 20.0进行数据统计分析，评估数据差异的显著性，计算出平均值和标准偏差，采用Origin 8.5进行图表绘制。
2.1.1 降酸菌株的筛选结果
利用1.2.1小节中所述的方法从水果中初步筛选得到了6株菌，分别命名M-1至M-6。如图1所示，进行降酸评价的6株菌中，菌株M-2、M-3、M-6 在发酵起始阶段有一定的提高，但后期又显著下降，可见这3株菌没有明显的降酸效果。而菌株M-1、M-4、M-5在发酵过程中pH有明显提高，具有显著的降酸效果。
图1 六株菌的pH变化
Fig.1 pH changes of different strains
2.1.2 降酸酵母的鉴定
菌株M-1在平板上生长时呈白色，无菌丝，湿润光滑，有较轻的酒味，味道微香甜，镜检显示菌体有椭圆形、杆状等不同的形态，可能是菌株处于不同的生长时期。菌株M-4在平板上生长时前期呈白色，培养后期菌落周围围绕一圈棕黑色，菌落形状为圆形，菌落表面湿润。菌株M-5在平板上生长时前期为玫红色，后期转化为橙红色，菌体隆起，有明显孢子，菌落为圆形。
将菌株M-1、M-4、M-5测得的序列通过NCBI的Blast程序进行同源性比对分析。其中，M-1、M-4、M-5菌株ITS测得序列长度分别为454、385和614 bp，同源性分析显示3株菌的ITS序列与发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)和近玫红锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)的相似性分别达到98.86%、98.37%和100%。进一步，基于ITS的DNA序列绘制系统进化树，进化树结果如图2所示。结合同源性分析和进化树分析，3株菌M-1、M-4、M-5分别被鉴定为发酵毕赤酵母、美极梅奇酵母和近玫红锁掷孢酵母。
图2 基于ITS序列的系统进化树
Fig.2 The phylogenetic tree bared on ITS sequence
按照红树莓与水质量比为1∶2进行红树莓发酵，对比分析酿酒酵母CICC 31001、发酵毕赤酵母M-1、美极梅奇酵母M-4、近玫色锁掷孢酵母M-5发酵过程中有机酸的变化，进一步评价4株酵母的降酸能力。3株酵母发酵红树莓果汁中均未检测到酒石酸和丁二酸(琥珀酸)，此外，发酵12 h后，4种酵母菌发酵红树莓果汁中乙酸含量均已检测不到。因此，选择发酵周期内均可检测到的草酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸这4种有机酸进行分析。
2.2.1 酿酒酵母CICC 31001发酵过程有机酸变化
红树莓果汁发酵前初始pH为3.1，发酵结束后pH为3.9，pH升高0.8。由图3可知，柠檬酸在红树莓果汁有机酸中占比最大，占有机酸总含量的90%以上。柠檬酸初始含量为8 775.24 mg/L，发酵12 h后迅速降至5 058.62 mg/L，降低了42%。发酵36 h后柠檬酸含量趋于稳定，直至发酵结束含量没有显著的变化。发酵终点时，红树莓功能饮料中柠檬酸含量为3 131.33 mg/L，较初始柠檬酸含量降低了64%。苹果酸初始含量607.29 mg/L，发酵过程中苹果酸含量逐渐降低，发酵终点含量为310.43 mg/L，比初始苹果酸含量降低了49%。乳酸和草酸在本品种的红树莓中含量本身较低，原始含量分别是33.93 mg/L和50.63 mg/L，发酵终点时含量分别为10.95 mg/L和43.23 mg/L，较初始含量分别降低了68%和15%。
图3 酿酒酵母CICC 31001发酵过程有机酸变化
Fig.3 Changes of organic acids in fermentation process by S.cere isiae CICC 31001
2.2.2 发酵毕赤酵母M-1发酵过程有机酸变化
红树莓经发酵毕赤酵母M-1发酵结束时pH为4.6，比对照升高了1.5。由图4可知，发酵前36 h柠檬酸含量减少速度较快，发酵36 h时柠檬酸含量为2 184.44 mg/L，降低了75%。发酵36～72 h中柠檬酸含量一直在下降。发酵终点时红树莓功能饮料中柠檬酸含量为1 192.23 mg/L，较初始含量降低了86%。对苹果酸来说，发酵0～48 h时苹果酸含量逐渐降低，发酵48 h时含量为352.34 mg/L，发酵48～72 h苹果酸含量有少许上升，发酵终点苹果酸含量为380.28 mg/L，较原始树莓果汁降低了37%。乳酸和草酸发酵终点含量分别是7.79 mg/L和46.62 mg/L，发酵终点乳酸和草酸含量分别比原始树莓果汁中降低了77%和8%。
图4 发酵毕赤酵母M-1发酵过程有机酸变化
Fig.4 Changes of organic acids in fermentation process by P. fermentans M-1
2.2.3 美极梅奇酵母M-4发酵过程有机酸变化
红树莓经美极梅奇酵母M-4发酵结束pH为4.3，pH升高了1.2。由图5可知，发酵24 h时柠檬酸含量为3 020.98 mg/L，与未发酵的初始含量相比降低了68%。发酵24～36 h柠檬酸含量在比较平稳的状态，发酵终点红树莓功能饮料中柠檬酸含量为2 303.67 mg/L，较初始降低了74%。对于苹果酸而言，发酵0～60 h时苹果酸含量逐渐降低，60 h时含量是168.98 mg/L，发酵60～72 h中苹果酸含量上升，达到395.99 mg/L，比原始树莓果汁降低了35%。发酵终点乳酸和草酸含量分别是6.48 mg/L和47.40 mg/L，较初始含量分别降低了81%和6%。
图5 美极梅奇酵母M-4发酵过程有机酸变化
Fig.5 Changes of organic acid in fermentation process by M. pulcherrima M-4
2.2.4 红掷孢酵母M-5发酵过程有机酸变化
红树莓经红掷孢酵母M-5发酵结束pH为3.7，pH升高了0.6。由图6可知，柠檬酸含量在发酵前12 h中柠檬酸含量迅速减少至4 714.74 mg/L，降低了46%。发酵12～36 h中柠檬酸含量较平稳，但在发酵36～48 h中柠檬酸含量有较大浮动的上升，发酵48 h后直至发酵结束柠檬酸含量又逐渐降低。发酵终点红树莓功能饮料中柠檬酸含量为3 448.61 mg/L，较初始树莓果汁柠檬酸含量降低了61%。对于苹果酸而言，发酵终点苹果酸含量是223.12 mg/L，较初始降低了63%。乳酸和草酸在发酵终点时含量分别是18.79 mg/L和73.98 mg/L，乳酸较初始降低了45%，草酸含量提高了46%。
图6 红掷孢酵母M-5发酵过程有机酸变化
Fig.6 Changes of organic acids in fermentation process by S. pararoseus M-5
总体来说，酿酒酵母CICC 31001、发酵毕赤酵母M-1、美极梅奇酵母M-4和红掷孢酵母M-5均有降酸效果，其中降酸效果最好的是发酵毕赤酵母M-1和美极梅奇酵母M-4。通过发酵毕赤酵母M-1酵母发酵红树莓果汁，柠檬酸含量为1 192.23 mg/L，较初始含量降低了86%。苹果酸含量为380.28 mg/L，较原始降低了37%。乳酸和草酸含量分别是7.79 mg/L和46.62 mg/L，降低了77%和8%。通过美极梅奇酵母M-4酵母发酵红树莓果汁，柠檬酸含量为2 303.67 mg/L，比未发酵树莓果汁降低了74%；苹果酸含量395.99 mg/L，比未发酵树莓果汁降低了35%；乳酸和草酸最终含量分别降低了81%和6%。在红树莓的降酸中具有潜在的应用效果。有机酸的组成和其含量影响红树莓功能饮料的风味和品质，有机酸的种类和浓度则调节着红树莓功能饮料的协调性和稳定性[16]。在本研究中的红树莓功能饮料，柠檬酸是最主要的有机酸，基本占据了所测定有机酸含量的90%，所以柠檬酸含量则是降酸的主要指标，过高的柠檬酸酸感较强，过低的柠檬酸会失去红树莓果汁本身的特色，而适量的柠檬酸给人一种新鲜的、清新的感觉[17]；苹果酸在口感中酸味较柠檬酸强，且有略带刺激性的酸感，在红树莓功能饮料中苹果酸含量的下降有利于降低红树莓特有的刺激性酸感[18]；乳酸的酸感较弱，但乳酸稍有锐利的涩感，故乳酸的降低可能降低了红树莓功能饮料的苦涩感；在4种红树莓功能饮料中，草酸的含量降低的最少，但由于草酸对红树莓功能饮料的口味影响甚小，故对功能饮料的酸感没有很大的影响[19]。讨论降酸效果的同时还需要讨论抗氧化活性的效果。
2.3.1 总酚含量
如图7所示，未发酵树莓果汁的总酚含量为274.78 mg/L，经酵母发酵后，红树莓功能饮料的总酚含量均有所提高。其中酿酒酵母CICC 31001红树莓功能饮料中的总酚含量达到403.11 mg/L，较对照组提高了47%；美极梅奇酵母M-4红树莓功能饮料总酚含量是4种酵母中最高的，达到505.33 mg/L，较对照组提高了84%；发酵毕赤酵母M-1红树莓功能饮料中总酚含量为379.78 mg/L，比对照提高了38%。红掷孢酵母M-5总酚含量299.78 mg/L，在4种红树莓功能饮料中总酚增加量最少。酚类物质不仅具有抗氧化、清除自由基的功能，而且影响红树莓果汁中的苦昧、涩味、颜色和香气等综合感官品质[20]。植物组织中的糖和糖苷类物质常与酚类物质形成羟基，以结合物的形式存在于组织中，微生物常可分泌多种酶类，如β-葡萄糖苷酶可水解这些结合态物质，从而释放更多的可溶性酚类物质，这可能是4株酵母导致红树莓中酚类物质提高的原因[21]。
图7 红树莓功能饮料总酚含量
Fig.7 Total phenol content of red raspberry functional drinks
2.3.2 DPPH自由基清除率分析
如图8所示，将红树莓与功能饮料稀释成不同体积分数时测定DPPH自由基清除率，表征其抗氧化活性。功能饮料体积分数在15%以上时，DPPH自由基清除率均在100%以上，且均比未发酵红树莓果汁的抗氧化活性高。体积分数在10%以下时，美极梅奇酵母M-4发酵的红树莓功能饮料抗氧化活性最高。分析其原因，可能是美极梅奇酵母M-4发酵制备功能饮料中总酚含量最高，总酚是DPPH自由基清除率的主要作用因子[8]，因此，其发酵制备的功能饮料显示出相对较高的抗氧化活性。
图8 红树莓功能饮料抗氧化活性
Fig.8 Antioxidant acti ity of red raspberry functional drinks
本研究筛选鉴定了3株具有降酸效果的酵母，分别为发酵毕赤酵母M-1、美极梅奇酵母M-4和红掷孢酵母M-5。在有氧发酵制备红树莓功能饮料的研究中，通过测定降酸能力、总酚含量及抗氧化能力，综合确定美极梅奇酵母M-4是最适合作为生产红树莓功能饮料的酵母菌种。美极梅奇酵母M-4发酵制备的红树莓功能饮料pH值达4.3，降酸效果显著，其中柠檬酸含量为2 303.67 mg/L，比未发酵树莓果汁降低了74%；苹果酸含量395.99 mg/L，比未发酵树莓果汁降低了35%；乳酸和草酸最终含量分别降低了81%和6%；总酚含量达到505.33 mg/L，比未发酵树莓果汁提高了84%，且抗氧化活性显著提高。总之，美极梅奇酵母M-4发酵制备的红树莓功能饮料综合表现最佳，降酸能力较高，酸味口感降低，总酚含量和DPPH自由基清除率提高幅度最大，在功能型保健饮品中具有重要的开发潜力。
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