图1 TRIS-盐酸溶液的pH 及用量对ΔIRLS的影响
Fig.1 Effect of the pH and dosage of TRIS-HCl solution on the ΔIRLS
畜禽养殖业中，越来越多的养殖户把抗病毒药物用于预防和治疗畜禽病毒感染。中华人民共和国农业部早在2005年10 月针对抗病毒药物发布了“第 560 号”公告，明确指出，“金刚烷胺类等人用抗病毒药移植兽用，缺乏科学规范、安全有效实验数据，用于动物病毒性疫病不但给动物疫病控制带来不良后果，而且影响国家动物疫病防控政策的实施”。但近年仍有些不法商贩，为了高利润和高回报，在经济利益的驱使下，将某些人用的具有较好疗效的抗病毒药物(如利巴韦林、拉米夫定、阿昔洛韦等)非法用在畜禽动物上，由此产生的药物残留不仅影响畜禽产品质量，而且对人们的健康带来危害。对于动物源性食品中残留抗病毒药物，我国目前尚无法定检测方法。
拉米夫定检测方法主要有液相色谱-质谱联用法[1-8]和高效液相色谱法[9-15]，偶见分光光度法[16-17]和电化学法[18]。前两种方法虽有高的准确度，但存在前处理操作繁琐、重现性较差，且运行和维护费用高等不足；分光光度法虽简便，但灵敏度较低；电化学法因需特殊电极材料，条件较为苛刻；共振光散射法是新近发展起来的一种用于微量和痕量检测的高灵敏分析技术，尽管在药物分析领域应用较多[19]，但未见用于畜禽肉食中拉米夫定的药残分析。本实验研究发现，在弱碱性溶液中，用溴代鲸蜡基吡啶增敏刚果红后，与拉米夫定以静电引力结合生成的离子缔合物的共振光散射(resonance light scattering,RLS)增强强度(ΔIRLS)与拉米夫定浓度间有一定的线性关系，本研究将其用于畜禽肉中的药物残留分析。
拉米夫定(lami udine)对照品：99.7%～99.9%，批号 101007-201502，中国食品药品检定研究院；刚果红(congo red)：99%，上海宝曼生物科技有限公司；氨丁三醇(TRIS)：99%，河南天孚化工有限公司；盐酸：分析纯，重庆华东化工有限公司；溴代鲸蜡基吡啶(cetylpyridinium bromide)：99%，武汉易泰科技有限公司上海分公司；水：超纯水(自制，成都优普超纯水仪)。
猪肉(1#～3#)、鸡肉(4#)：购自当地农贸市场。
荧光分光光度计(F-2500 型)，日本日立公司(设λex=λem=220 nm，测定狭缝5.0 nm)；超声波清洗机(KQ-200 DE 型)，昆山市超声仪器有限公司；精密酸度计(pHS-3C型)，上海理达仪器厂。
拉米夫定标准溶液：精密称取拉米夫定对照品适量(准至±0.100 0 mg)，加适量水溶解完全后转移至100 mL 容量瓶中，定容，配成229.3 mg/L 贮备液，操作液为2.293 mg/L，存于4 ℃冰箱中。刚果红溶液：0.100 mmol/L 水溶液。溴代鲸蜡基吡啶溶液：500 mg/L水溶液。TRIS 溶液：200 mmol/L水溶液。盐酸溶液：100 mmol/L水溶液。TRIS-盐酸溶液：pH 3.2～9.5(用酸度计测定盐酸溶液与TRIS溶液混合液的pH 值)。
取生鲜猪肉(1#、2#和3#)及现杀鸡肉(4#)，去皮、洗净、搅成肉末。准确称取各肉末样20 g 左右(精确至±0.100 0 mg)分别置于烧杯中，加适量水，于40 ℃热水浴中超声提取30 min，取出，离心分离(4 000 r/min)，将离心液置于另一烧杯中，剩余部分重复提取1次，将2次上清液合并，加入20 mL 甲醇，在80 ℃恒温水浴中提取30 min(拉米夫定在热溶液中稳定[20]，而蛋白质变性沉淀)，离心分离，清液于通风橱内100 ℃水浴浓缩至适量，冷却后转至10.0 mL 比色管中，用水定容备用。
精密移取拉米夫定标准操作液0～1.20 mL 于10 mL 比色管中，加入0.100 mmol/L 刚果红溶液2.50 mL，pH 7.63 TRIS-盐酸溶液2.00 mL，摇匀，再加入500 mg/L溴代鲸蜡基吡啶溶液0.50 mL，摇匀后用水定容至10 mL。不断摇动，待充分反应10 min 后，在荧光仪上扫描共振光散射(RLS)光谱，测定398 nm 处的RLS 强度(IRLS)及试剂空白的RLS 强度(I0)，求出溶液的共振光散射增强强度ΔIRLS(=IRLS- I0)。
2.1.1 溶液的pH 及用量
当体系溶液中所取拉米夫定标准操作液为1.00 mL、刚果红溶液及溴代鲸蜡基吡啶溶液分别为2.00 mL和0.10 mL 时，考察了398 nm 处，pH 3.2～9.5 范围内不同pH下的TRIS-盐酸溶液对体系反应灵敏度(即ΔIRLS的大小)的影响。从图1-a可知，体系反应的适宜pH在 7.2～8.2，超出该范围，ΔIRLS值均有下降(原因：当pH<7.2，尤其溶液处于酸性范围时，反应不能完全；当pH>8.2，溶液的碱性逐渐增强时，反应也不能完全)。故实验选用pH 7.63 的TRIS-盐酸溶液。从图1-b可知，pH 7.63 溶液的最佳用量为2.00 mL。故后续选定TRIS-盐酸溶液的pH为7.63，用量为2.00 mL。
图1 TRIS-盐酸溶液的pH 及用量对ΔIRLS的影响
Fig.1 Effect of the pH and dosage of TRIS-HCl solution on the ΔIRLS
2.1.2 刚果红溶液浓度
当体系溶液中所取拉米夫定标准操作液和溴代鲸蜡基吡啶溶液与2.1.1 项相同，所取TRIS-盐酸溶液为选定的最佳条件(即2.00 mL,pH 7.63)时，考察了398 nm 处，0.50～3.00 mL 范围内的刚果红溶液对体系反应灵敏度(即ΔIRLS的大小)的影响。从图2 可知，0.100 mmol/L 刚果红溶液的最佳用量为2.50 mL，大于或小于该值，反应的ΔIRLS均有下降(原因：当刚果红溶液取量小于2.50 mL 时，因用量不足，反应不能达到完全；当刚果红溶液取量大于2.50 mL 时，因该液过量，刚果红自身的聚集也会使反应不完全)。故后续实验选择刚果红浓度为0.100 mmol/L，用量为2.50 mL。
图2 刚果红用量对ΔIRLS的影响
Fig.2 Effect of congo red dosage on the ΔIRLS
2.1.3 溴代鲸蜡基吡啶溶液用量
当体系溶液中所取拉米夫定标准操作液为1.00 mL，所取刚果红溶液和TRIS-盐酸溶液为上述选定的最佳条件时，考察了398 nm 处，0.10～0.70 mL 范围内的500 mg/L溴代鲸蜡基吡啶溶液对体系反应灵敏度(即ΔIRLS的大小)的影响。从图3 可知，溴代鲸蜡基吡啶溶液的最佳用量为0.50 mL，大于或小于该值，灵敏度均不能达最高。故后续实验选用的溴代鲸蜡基吡啶的用量为0.50 mL。
图3 溴代鲸蜡基吡啶用量对ΔIRLS的影响
Fig.3 Effect of 1-hexadecylpyridinium bromide dosage on the ΔIRLS
2.1.4 试剂加入顺序
在拉米夫定标准操作液及前述选定的TRIS-盐酸、刚果红及溴代鲸蜡基吡啶溶液的条件固定不变时，考察这几种物质在加入顺序不同时，对反应灵敏度(即ΔIRLS的大小)的影响。结果显示，体系反应最完全、灵敏度相对最高的加入顺序为：拉米夫定、TRIS-盐酸、刚果红、溴代鲸蜡基吡啶(ΔIRLS=165)。
2.1.5 反应时间
在物质的最佳加入顺序及最佳反应条件下，考察不同反应时间对反应灵敏度(即ΔIRLS的大小)的影响。结果表明，拉米夫定、刚果红及溴代鲸蜡基吡啶在弱碱性溶液中，10 min 内即可反应完全(从反应开始至10 min 内，ΔIRLS随反应时间的增加逐渐增大)，反应达10 min 时，ΔIRLS达最大；10～70 min内，ΔIRLS基本稳定；70 min 后，ΔIRLS有降低趋势。故实验选在反应10 min 后的稳定区进行。
拉米夫定、刚果红及溴代鲸蜡基吡啶的共振光散射光谱见图4。拉米夫定因分子结构上氨氮的孤对电子可接受质子，使其在溶液中以阳离子形式存在；刚果红是一种双偶氮的酸性染料，分子结构上含有2 个磺酸根，使其在溶液中以阴离子形式存在；溴代鲸蜡基吡啶是一种阳离子表面活性剂，在溶液中以阳离子形式存在。当拉米夫定与刚果红在弱碱性溶液中混合时，从结构式可知，他们可以以静电结合生成离子缔合物，但从图4的光谱曲线6 可知，该缔合物的共振光散射信号较弱(拉米夫定和刚果红自身的RLS 信号很弱，见曲线1 和曲线2)，不宜进行拉米夫定的定量分析。从曲线3、4、5可知，溴代鲸蜡基吡啶或其在弱碱性溶液中的RLS 信号很弱，刚果红的弱碱性溶液的RLS 信号也很弱，但如果将刚果红的弱碱性溶液与溴代鲸蜡基吡啶混合后，其RLS 信号将明显增强(曲线7)，这种现象说明阳离子表面活性剂溴代鲸蜡基吡啶可以增敏刚果红，并产生新的RLS 光谱，他的特征最大RLS 峰位于398 nm，在450～520 nm 范围内有多个较小的RLS 峰。从曲线7～13 可知，当在曲线7 的溶液中加入不同质量浓度的拉米夫定后，其RLS 信号随着拉米夫定浓度的增大而增强，但只有在最大峰398 nm 处，其RLS 信号与拉米夫定的质量浓度有线性关系，因此选择398 nm 作为测定波长，用于定量检测拉米夫定。
从谱线和物质结构可知，他们的可能反应机理及RLS 增强原因为：在实验条件下，带正电荷的溴代鲸蜡基吡啶以预胶束聚集态与以阴离子形式存在的刚果红分子通过静电作用生成分子体积更大的复杂聚集体，从而使共振光散射明显增强；当有拉米夫定存在时，由于分子结构上氨氮孤对电子可接受质子，于是与带负电荷的缔合颗粒(刚果红-溴代鲸蜡基吡啶)进一步以静电作用生成电中性的三元缔合物，新聚集体的摩尔质量和体积变得更大，从而使共振光散射增强。
1-拉米夫定(0.229 mg/L); 2-刚果红(0.025 0 mmol/L); 3-溴代鲸蜡
基吡啶(25.0 mg/L); 4-刚果红(0.025 0 mmol/L), pH 7.63; 5-溴代
鲸蜡基吡啶(25.0 mg/L), pH 7.63; 6-拉米夫定(0.229 mg/L)-刚果
红(0.025 0 mmol/L), pH 7.63; 7～13-拉米夫定(0.00、0.045 9、
0.091 7、0.138、0.183、0.229、0.275 mg/L)-刚果红
(0.025 0 mmol/L)-溴代鲸蜡基吡啶(25.0 mg/L), pH 7.63
图4 拉米夫定-刚果红-溴代鲸蜡基吡啶的共振光散射光谱
Fig.4 Resonance light scattering spectra of lami udine-congo
red-cetylpyridinium bromide
2.3.1 标准曲线及灵敏度
精密移取2.293 mg/L 拉米夫定标准溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL于10 mL 比色管中，按最佳加入顺序和反应条件，加入刚果红、TRIS-盐酸及溴代鲸蜡基吡啶溶液，用水定容。按照1.5 小节的方法测定标准系列溶液的ΔIRLS，做标准曲线。曲线的回归方程为ΔIRLS=-2.320 4 + 696.96 ρ，相关系数r=0.999 1，线性范围为0.006～0.28 mg/L，检出限为0.009 5 mg/kg，定量限为0.032 mg/kg。
2.3.2 选择性
按照1.5小节的方法，考察了某些共存物(无机物和有机物)对测定0.229 mg/L 拉米夫定的影响。结果表明，在相对误差≤±5% 时，200倍的麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、L-赖氨酸、L-亮氨酸、D-色氨酸、L-白氨酸、L-谷氨酸、D-苏氨酸、L-组氨酸、柠檬酸三钠
和Cl-；100 倍的D-果糖、甘氨酸、L-丙氨酸、尿素、淀粉、抗坏血酸
和
倍的阿昔洛韦和利巴韦林等不干扰拉米夫定的测定。可见，以溴代鲸蜡基吡啶增敏刚果红测定拉米夫定的方法具有很好的选择性。
2.3.3 样品测定、准确度及精密度
取1.4 小节制得的待测样液各3.00 mL(各平行5 份)，按试剂的最佳加入顺序及反应条件加入刚果红、TRIS-盐酸及溴代鲸蜡基吡啶溶液，用水定容至10 mL。按照1.5小节的方法测定ΔIRLS，再由回归方程求得待测液中拉米夫定的含量，从而求得残留于生鲜猪肉及鸡肉中拉米夫定的含量，结果见表1。同时，用另一具有较高灵敏度的吸收光谱法(简写为 IS 法)进行对照检测。结果表明，2种方法测定结果相同(均未检出残留拉米夫定，见表1，即可将其含量看作0)，由统计学检验结果可知，F<FP,f,t<tP,f，故此2种方法的准确度和精密度无显著性差异。
为了进一步判断新方法的准确度和精密度，对不同样品作低、中、高3 种加标水平(各水平做5 份平行试验)的回收试验(即准确称取空白肉末20 g 左右，加适量拉米夫定贮备液，再加适量二次水，后续处理同1.4小节，最终制得样加标待测液)。照1.5小节的方法，取样加标待测液，测定其拉米夫定总含量，再求出回收率及相对标准偏差，即可判断新方法的准确度和精密度，结果见表1。
表1 畜禽肉样的分析结果及回收试验
Table 1 Results and reco ery tests of li estock and poultry meat samples (n=5)
样品测得值/(mg·kg-1)加标值/μg测得值平均值/μg回收率/%RSD/% IS对照法测得值/(mg·kg-1)2.292.24±0.07597.83.4 1#ND1.141.10±0.03896.53.5ND0.5720.558±0.007 597.61.32.522.56±0.0531022.1 2#ND1.261.30±0.0371032.9ND0.6300.642±0.008 31021.32.062.02±0.06098.13.03#ND1.381.35±0.03597.82.6ND0.6880.676±0.007 998.31.22.522.45±0.04797.21.94#ND1.261.23±0.03597.62.8ND0.6300.610±0.01996.83.2
注：ND 为未检出
实验表明，所购生鲜猪肉及鸡肉中未检测出残留抗病毒药物——拉米夫定，说明该畜禽产品质量符合要求。
以溴代鲸蜡基吡啶增敏刚果红测定拉米夫定的共振光散射法除具有很高的灵敏度外，还有很好的选择性、良好的线性关系及较宽的线性范围，准确度和精密度满足痕量分析要求，样品处理简单、安全，成本低，适于生鲜猪肉及现杀鸡肉中拉米夫定的药残分析。
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