甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是一类具有高效、广谱、促生的新型仿生性杀菌剂，对子囊菌纲、半知菌纲和卵菌纲等真菌引起的病害有高效的杀菌活性[1]。它对苯甲酰胺类、二羧酰胺类和苯并吡唑类农药产生抗性的菌株有效，已成为继苯丙咪唑类和三唑类杀菌剂之后极具市场的一类杀菌剂[2]。关于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的残留检测方法有气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法[3-7]。GB 23200.54—2016也使用气相色谱-质谱法测定了11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂[8]。
近年来QuEChERS方法广泛应用于食品样品的前处理和净化过程中[9-13]。许秀敏等[14]采用QuEChERS净化，超高效液相色谱-串联质谱法同时检测果蔬中35种甲氧基丙烯酸酯类和三唑类杀菌剂的残留量。在GB 23200.54—2016中前处理方法采用凝胶色谱净化，与之相比较，QuEChERS前处理技术分析速度快、有机溶剂使用量少、污染小、操作简便。本研究以QuEChERS前处理方法为基础通过正交试验优选N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)和C18以及石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)的组合用量，结合气相色谱-串联质谱(gas chromatography-tandem mass spectrometry， GC-MS/MS)建立了一种高效、快速、简便、准确测定番茄中9种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的检测方法。
GCMS-TQ8040气相色谱质谱联用仪,日本岛津公司;高速冷冻离心机,美国 Thermo Fisher公司;漩涡振荡器,上海一恒科学仪器有限公司,氮吹浓缩仪天津恒奥科技发展有限公司。
丙酮、乙腈，均为色谱级，赛默飞世尔科技有限公司;N-丙基乙二胺(40～60 μm)、C18(40 μm)、石墨化炭黑(38～120 μm)，天津博纳艾杰尔科技公司;9种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂标准品,纯度均大于99%，德国Dr. Ehrenstorfer公司。
标准溶液的配制：分别准确称取9种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂标准品各10.0 mg，用丙酮定容至100 mL，配制成质量浓度为100 μg/mL的储备液，密封后避光储存于4 ℃冰箱中，备用。
取番茄样品切碎，用捣碎机捣碎成浆状，混匀，装入样品袋，标记，密封备用。准确称取样品10.0 g，置于50 mL塑料离心管中，加入10 mL乙腈、4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠及陶瓷均质子旋涡混匀1 min，超声提取10 min，5000 r/min离心5 min，取5 mL上清液于含有900 mg MgSO4，250 mg PSA，200 mg C18，25 mg GCB的15 mL离心管中，漩涡1 min，4000 r/min离心5 min，取上清液2 mL于 40 ℃氮吹浓缩仪吹至尽干，用1 mL丙酮复溶，若溶液浑浊过0.22 μm滤膜，待上机测定。
气相色谱：进样口温度280 ℃；载气:高纯He；碰撞气:高纯Ar，纯度≥99.999%；柱流量1.0 mL/min；分流进样，分流比3∶1；色谱柱SH-Rtx-5 SilMS；毛细管柱，30 m×0.25 mm(内径)，膜厚0.25 μm。程序升温：50 ℃保持1 min，以25 ℃/min升至125 ℃，以10 ℃/min升至300 ℃，保持15 min。
质谱条件：色谱-质谱接口温度280 ℃；电离方式EI；电离能量70 e ；离子源温度200 ℃；检测器电压 0.7 k ；测定方式多反应监测模式(multiple reaction monitoring,MRM)；定量、定性离子、碰撞电压参考表1。
表1 九种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂质谱检测参数
Table 1 Mass spectrum parameters of 9 strobilurin fungicides
序号目标物质定量离子碰撞电压/e 定性离子碰撞电压/e 1啶氧菌酯145.00>102.1024145.00>115.00212E-苯氧菌酯191.00>160.109238.00>210.00153Z-苯氧菌酯196.00>77.1021167.00>139.10184嘧螨酯145.00>102.1024204.00>189.1065肟菌酯116.00>89.0012131.00>116.00186醚菌胺205.00>116.1012295.00>238.10187肟嘧菌胺132.00>77.1018205.00>116.10128醚菌酯163.00>135.109163.00>107.00189嘧菌酯344.00>329.0012344.00>183.1015
在电子轰击离子源(EI)检测模式下对9种甲氧基丙烯酸酯类化合物进行一级质谱分析(Q3Scan)，分别找到各个化合物的前体离子，设定3～45 e 的碰撞能量，对选定的前体离子峰进行二级质谱分析(产物离子扫描)，根据二级质谱图，选择合适的定量离子对和定性离子对。使用优化条件后的气相色谱采集9种化合物的MRM质谱图如图1所示。
图1 九种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂标准物质色谱图
Fig.1 Chromatograms of 9 strobilurin fungicides standard solution
目前，QuEChERS方法的吸附净化剂主要包括GCB、PSA和
可有效去除脂肪酸、有机酸、极性色素以及糖类等干扰物，同时也是很有用的螯合剂。C18可去除非极性干扰物，如酯类、花青素和蜡质等。GCB可有效去除叶绿素、叶黄素等色素。但GCB具有平面六元环层状结构，会吸附一些农残，故其用量成为去色素和提高回收率的关键[16]。本文选取无水MgSO4 900 mg，分别对石墨化炭黑、PSA和C18的加入量进行单因素试验，以空白基质加标回收率为指标，选取最佳的试剂使用量。实验结果如图2～图4所示。当GCB加入量为25 mg，PSA加入量为200 mg，C18的加入量为150 mg时单因素试验加标回收率达到最佳。
图2 GCB质量对加标回收率的影响
Fig.2 Effect of GCB addition on reco ery
图3 PSA质量对加标回收率的影响
Fig.3 Effect of PSA addition on reco ery
图4 C18质量对加标回收率的影响
Fig.4 Effect of C18 addition on reco ery
正交试验可在单因素试验的基础上，有效评估各吸附剂之间的交互作用的大小，优化吸附剂用量，提高回收率[17]。以空白基质加标回收率为指标，对GCB(A)、C18(B)、PSA(C)3个因素进行考察，各因素均确定3个水平，因素与水平见表2，正交试验结果见表3。
表2 正交试验因素与水平 单位：mg
Table 2 Orthogonal test factors and le els
水平因素A(GCB质量)B(C18质量)C(PSA质量)115100150225150200335200250
由表3可知，啶氧菌酯、嘧螨酯、醚菌酯和肟醚菌胺的最优净化组合为A2B1C3；E-苯氧菌酯、肟菌酯和醚菌胺的最优净化组合为A2B3C3；E-苯氧菌酯的最优净化组合为A2B2C3；嘧菌酯的最优净化组合为A3B1C3。其中，啶氧菌酯、嘧螨酯、醚菌酯和肟醚菌胺中虽然B1>B3，但其差值较小，而在E-苯氧菌酯、肟菌酯和醚菌胺3种化合物中，B1与B3差值较大，影响明显，故综合考虑，确定最优净化组合为A2B3C3，即净化剂的配比为GCB的质量为25 mg，C18的质量为200 mg，PSA的质量为250 mg时，9种化合物中大部分的回收率出现最大值，故确定其为最佳净化组合。
表3 L9(34)正交试验设计与结果 单位：%
Table 3 L9(34)Design and results of orthogonal test
实验ABCD啶氧菌酯E-苯氧菌酯Z-苯氧菌酯嘧螨酯肟菌酯醚菌胺肟醚菌胺醚菌酯嘧菌酯1111176.3258.0659.8651.0954.2259.3440.7650.2747.092122271.2156.9461.9748.6454.4257.5642.7348.0645.113133377.1169.1171.4056.2164.0166.0847.5853.4653.534212380.9975.2981.4664.7772.7879.2555.2561.1863.885223183.4880.0377.0462.9470.4274.2852.9757.8060.766231283.0671.3377.8159.6267.1478.0651.2454.8062.807313283.7975.2183.8259.5967.8078.1355.0159.3369.598321382.5172.0772.3355.3662.5172.3452.2152.0360.499332179.2975.0678.5058.8567.3273.3150.8752.5359.40啶氧菌酯E-苯氧菌酯Z-苯氧菌酯k174.8880.3780.6379.6961.3769.5267.1571.0554.1755.4558.0335.97k282.5179.0777.1779.3675.5569.6869.1067.8264.3858.5738.1061.20k381.8679.8281.4680.2074.1171.8374.7872.1639.9644.4962.3961.34R7.631.304.290.8514.182.317.634.3324.4214.0924.2925.37ABCABCABC嘧螨酯肟菌酯醚菌胺k151.9858.4955.3657.6357.5564.9361.2963.9960.9972.2469.9168.97k262.4455.6557.4255.9570.1262.4564.8463.1277.2068.0670.0471.25k357.9458.2359.5858.7865.8866.1667.4166.4374.5972.4872.8372.56R10.462.844.222.8312.573.716.123.3216.204.422.923.58ABCABCABC肟醚菌胺醚菌酯嘧菌酯k143.6950.3448.0748.2050.6056.9352.3753.5348.5860.1956.7955.75k253.1549.3049.6249.6657.9352.6353.9254.0662.4855.4556.1359.17k352.7049.9051.8551.6854.6353.6056.8655.5663.1658.5761.2959.30R9.461.043.783.487.334.304.502.0214.584.735.163.55ABCABCABC
基质效应(matrix effect,ME)指样品处理过程中除目标化合物外，其他组分对定量分析准确性和重现性的影响[18]。ME采用公式(1)计算：
ME=km/k
(1)
式中：km为基质匹配校准曲线的斜率;k为溶剂校准曲线的斜率。
本研究采用提取后加入法和绝对基质相应法来评价基质效应[19-20]。参照1.2提取空白番茄基质溶液。分别用丙酮和空白基质溶液配制相同浓度的工作液，按1.3条件进行分析测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制基质匹配校准曲线和溶剂校准曲线，并计算基质效应。ME值为1.27～3.02，表明存在基质效应。因此，采用基质匹配校准曲线外标法对样品进行定量分析，以减少基质效应对实验结果的影响。
如表4所示，采用优化后的提取和净化方法，将配制的工作液用处理后的空白番茄基质逐级稀释，配制成系列曲线工作液。以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制基质匹配校准曲线。9 种杀菌剂在5～800 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数为 0.993 9～0.999 5，检出限为 0.5～2.5 μg/kg，定量限为2～8 μg/kg。
表4 九种化合物线性方程，相关系数，检出限和定量限
Table 4 Linear equations, correlation coefficients，
LODs and LOQs of 9 strobilurin fungicides
目标物质线性方程相关系数检出限/(μg·kg-1)定量限/(μg·kg-1)啶氧菌酯y=575.469 4x+6 548.023 70.99741.55E-苯氧菌酯y=252.618 6x+2206.502 60.998 22.58Z-苯氧菌酯y=455.520 3x-960.467 90.999 50.52嘧螨酯y=355.260 5x+3 275.040 50.996 60.52肟菌酯y=572.643 2x+5 969.817 90.996 10.52醚菌胺y=301.010 3x+2 333.292 20.996 10.52肟嘧菌胺y=284.206 2x+1 862.776 90.997 40.52醚菌酯y=3 292.459 6x+37 112.397 70.996 60.52嘧菌酯y=349.391 8x+9 895.343 10.993 92.58
以空白基质加标回收率表示方法的准确度，以回收率的相对标准偏差表示方法的精密度。选择3个不同添加水平测定，按1.2进行样品制备，按1.3条件分析测定，并将峰面积带入工作曲线方程计算回收率和相对标准偏差,如表5所示。9种甲氧基丙烯酸类杀菌剂加标回收率为73.24%～91.38%，相对标准偏差为2.51%～10.18%。
表5 平均回收率和平均相对标准偏差(n=7)
Table 5 A erage reco eries and RSDs of 9
strobilurin fungicides
目标物质添加水平/(μg·kg-1)测得均值/(μg·kg-1)平均回收率/%相对标准偏差/%啶氧菌酯64.819 281.524.19108.338 383.383.812016.536 082.684.73E-苯氧菌酯108.256 282.566.532016.680 183.408.324034.958 587.4010.18Z-苯氧菌酯32.460 982.037.5165.050 884.185.38108.786 287.866.48嘧螨酯32.492 783.098.0365.113 885.233.98108.137 381.374.38肟菌酯32.487 982.938.1864.873 881.236.42108.557 685.585.23醚菌胺32.252 775.096.1564.687 278.127.03108.012 980.138.26肟嘧菌胺32.396 779.896.9465.124 685.415.67108.232 282.327.53醚菌酯32.197 273.243.6864.740 679.012.51108.012 980.133.89嘧菌酯108.400 484.004.962018.276 791.386.574031.981 279.958.68
本文采用了QuEChERS提取净化方式，通过正交试验优选最佳净化组合，确定以GCB的质量为25 mg，C18的质量为200 mg，PSA的质量为250 mg为最佳净化剂组合，结合GC-MS/MS方法，建立了番茄中9种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留量的测定方法，同时经基质匹配校准曲线法校正，补偿了番茄中基质效应对目标化合物的影响，满足食品安全国家标准的要求。该方法代替了国标中凝胶色谱的前处理净化过程，降低了乙酸乙酯和环己烷等有机溶剂的使用，准确度高，重复性好，操作简单，环境友好，成本低廉，为果蔬中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的分析检测提供了技术参考。
[1] 赵平,严秋旭,李新,等.甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的开发及抗性发展现状[J].农药,2011,50(8):547-551；572.
[2] 王璐芳,李春梅,许佳彬,等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定不同植被类型土壤中11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂[J].色谱,2018,36(8):730-737.
[3] 吴洁珊,冯家望,任永霞,等.气相色谱测定柑橘中多种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的残留量[J].农药,2011,50(10):754-755；766.
[4] 薄海波,王金花,郭春海,等.气相色谱/质谱法测定食品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留[J].分析化学,2008(11):1 471-1 475.
[5] 王云凤,葛宝坤,高建会,等.液相色谱-质谱法测定果蔬中8种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留量[J].食品研究与开发,2009,30(4):130-133.
[6] 张瑶,孙谦,马桂娟,等.GC/MS/MS法测定水果中10种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留量[J].环境化学,2019,38(5):1 204-1 206.
[7] 郑兆姗,寿淼钧,裴晓华,等.快速溶剂萃取-气相色谱质谱法联用测定大米中6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留量[J].分析仪器,2019(2):51-56.
[8] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,中华人民共和国农业部,国家食品药品监督管理总局.GB 23200.54-2016 食品安全国家标准 食品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留量的测定 气相色谱-质谱法[S].北京:中国标准出版社,2016.
[9] 马楠,张玉娟,张志强.QuEChERS/GC-MS法检测韭菜中19种农药残留[J].食品工业,2020, 41(1):323-326.
[10] 侯雪,韩梅,邱世婷,等.改进的QuEChERS-气相色谱-串联质谱法测定草莓中21种杀菌剂残留[J].农药学学报,2017, 19(1):46-52.
[11] 李志,冉茂乾,张馨允,等.QuEChERS-GC-MS/MS法同时测定刺梨中15种有机氯农药残留[J].中国酿造,2020,39(3):166-171.
[12] 高阳,徐应明,孙扬雄,等.QuEChERS提取法在农产品农药残留检测中的应用进展[J].农业资源与环境学报,2014,31(2):110-117.
[13] 杜磊,徐华超,周卓为,等.QuEChERS/气相色谱质谱法同时测定膨化食品中多环芳烃类物质[J].广州化学,2020,45(2):22-27.
[14] 许秀敏,龙朝阳,黄伟雄,等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时快速检测果蔬中35种甲氧基丙烯酸酯类杀和三唑类杀菌剂的残留量[J].食品安全质量检测学报,2019,10(4):1 039-1 047.
[15] 刘亚伟,董一威,孙宝利,等.QuEChERS在食品中农药多残留检测的应用研究进展[J].食品科学,2009,30(9):285-289.
[16] 黄何何, 张缙,徐敦明,等.QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法同时测定水果中21种植物生长调节剂的残留量[J].色谱,2014,32(7):707-716.
[17] 黄诚,郭梅.正交试验法优选黄瓜中拟除虫菊酯类农残检测的净化剂组合[J].中国食品卫生杂志,2012 24(5):438-440.
[18] DONG Fengshou,CHEN Xiu,LIU Xinggang,et al. Simultaneous determination of fi e pyrazole fungicides in cereals, egetables and fruits using liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr A,2012,126(2):98-106.
[19] 刘进玺,秦珊珊,冯书惠,等.高效液相色谱-串联质谱法测定食用菌中农药多残留的基质效应[J].食品科学,2016,37(18):171-177.
[20] 汪传炳,黄秀根,樊晓青,等.微量叠加定量法校准蔬菜农药残留色谱分析中的基质效应[J].上海农业学报,2013,29(4):36-41.