图1 糟醅取样的位置
Fig.1 Sampling positions of fermented grains
“千年老窖万年糟，酒好还需窖池老”的传统经验提示了窖池和糟醅在浓香型白酒酿造中的重要作用，因而科学地揭示糟醅与原酒质量的关系无疑对提高原酒质量具有重要指导意义。浓香型白酒酿造的核心过程是粮谷类原料经蒸煮后，在密闭的泥窖中经大曲、窖泥中复杂微生物菌群的代谢作用，产生了纷繁复杂的风味物质。多粮浓香型白酒由于采用多种粮食配方、续糟配料等工艺，糟醅经长期的循环发酵，积累了大量的风味成分以及酿酒原料分解残存物、微生物菌体自溶物及代谢产物等风味前体物质，这些物质对白酒酒体具有重要的贡献作用[1]。曾有学者提出窖池内涉及到复杂的物质能量代谢过程[2]，但迄今为止并没有更为深入的关于窖池内物质或能量的空间分布及交换规律的研究报道。
糟醅香气成分的研究中，宫俐莉等[3]利用溶剂辅助风味蒸发法(sol ent assisted fla or e aporation,SAFE)和顶空固相微萃取(head space solid-phase microextraction,HS-SPME)结合气质联用仪(GC-MS)鉴定出酒醅中挥发性风味成分120种，其中酯类66种、醇类13种、醛酮类9种、醚酚类6种以及缩醛类、脂肪酸、醚酚类、烯烃类等。郭家秀等[4]确定蒸馏-微溶剂萃取法是一种适宜萃取糟醅中低沸点成分的方法。基于高效液相色谱法分析了浓香型白酒发酵过程中香气成分动态变化,研究发现,乙酸、丁酸、己酸和乳酸的变化趋势与对应的乙酯生成趋势大体一致[5]。孙金沅等[6]利用SAFE结合GC-MS分析比较了入池和出池糟醅的39种挥发性成分，发现下层糟醅中的含量最高。赵东等[7]利用HS-SPME/GC-MS研究了不同空间层次的五粮液出窖糟醅和窖泥的香气成分，发现窖边糟中香气成分的含量显著高于中心糟。然而，对糟醅中风味成分在不同空间的分布情况并没有开展深入的研究。
本研究利用HS-SPME/GC-MS检测了不同层次糟醅不同空间位置的香气成分，系统讨论了多粮浓香型糟醅中香气成分的空间分布规律，为探讨糟醅对酒质的影响提供数据支撑。
1.1.1 样品采集
所有糟醅样品均采自宜宾五粮液股份有限公司2个酿酒车间各一口窖池，窖龄分别为30年和15年(编号分别为A和B)。
糟醅采集方法:如图1所示，将窖池中糟醅垂直中线分为3层，分别表示上层(距地面约20 cm)、中层(距黄水线上约20 cm)、下层(黄水线下10 cm)糟醅。如图1黑点所示，每层糟醅按距离窖壁0(边糟)、10、20、50、100 cm(中心糟)等5个点取样，每点采集3个平行样品，分别取500 g，混合均匀，密封袋包装，置于-20 ℃保藏待测。
图1 糟醅取样的位置
Fig.1 Sampling positions of fermented grains
1.1.2 试剂和仪器
C7-C30直链正构烷烃,美国Sigma-Aldrich公司，为GC纯；搅拌机，Philips公司；顶空固相微萃取手柄、50/30 μm CAR/D B/PDMS Stableflex纤维萃取头(1 cm)，美国Supelco公司；PAL RTC2-7890B-5977B MSD带有全自动样品前处理平台的气质联用仪，美国Agilent公司；DB-WAX石英毛细管色谱柱(30.0 m×0.25 mm ×0.25 μm)，J&W scientific，美国Agilent公司。
1.1.3 样品前处理
取100 g，-20 ℃完全冷冻样品于搅拌机中，搅拌均匀，待用。
称取1.00 g处理好的样品于20 mL顶空样品瓶中，加入定量内标(4-辛醇，5.5 mg)，置于50 ℃金属浴中平衡15 min，插入萃取头吸附45 min，随后插入GC进样口热解析3 min，分析其中香气成分[1]。每个样品2个平行测试。
GC条件：进样口温度250 ℃，载气(He)流速1.0 mL/min，不分流模式进样。升温程序：起始温度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。
MS条件：质谱EI源，电子轰击能量70 e ；离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃；质量数扫描范围m/z 35～350。
香气成分的定性方法[9]：先将化合物与NIST14标准数据库(美国Agilent公司化学工作站内置)进行比对，匹配度>800(最大值1 000)作为初步定性结果；再计算各物质的Ko ats保留指数(retention index,RI)[10]，并与文献报道的RI值进行比较。同时，与标准品在相同色谱条件下的保留时间对比，最终确定该物质的归属。
香气成分的定量采用内标法测定，参考内标质量浓度，以待测成分与内标的峰面积之比计算待测成分的半定量信息，单位以μg/g表示。
利用GraphPad Prism8和R语言工具进行不同窖池不同层次糟醅的数据分析，其中R语言进行热图绘制过程中按行进行均一化处理。
由图2可知，糟醅香气成分的总含量分布规律为下层>中层≥上层。上层和中层糟醅的香气成分平均含量分别为2 053.4和2 927.4 μg/g，而下层糟醅香气成分的平均含量是上层和中层的3～4倍，达到8 605.9 μg/g。这可能是由于糟醅发酵过程中产生的黄水[11]在重力作用下自然下渗并富集于窖池底部，使得下层糟醅中香气物质的含量较高。
同一口窖池中，不同层次窖边糟(0 cm)中各类香气含量均显著高于中心糟(100 cm)，这与先前的研究结果一致[6]。同时，糟醅中主要的2类香气成分—酯类和酸类，含量范围分别为：192.63～2 792.91 μg/g(占76%左右)和32.38～899.57 μg/g (占18%左右)，同时，这2类成分的含量在同层的分布规律为距离窖泥越近含量越高(0 cm>10 cm>20 cm>50 cm>100 cm)，这可能是由于在浓香型白酒发酵过程中，窖边糟的营养成分、香气及前体物质主要来自于与之长期接触的窖泥，进而与中心糟醅形成鲜明对比。此外，醇类、芳香族、醛酮类成分的总含量并未呈现显著的空间异质性。
a-窖池A; b-窖池B
图2 糟醅香气成分含量的空间分布规律
Fig.2 Spatial ariation of olatile compounds in fermented grains
2.2.1 酸类成分
酸类化合物除本身可作为酒体风味物质外，还是白酒中酯类生物合成的重要前体物质[12-13]。如图3所示，本研究中共检出9种酸类成分，占糟醅香气成分总含量的18.26%，其中己酸(58.31%)、乙酸(29.89%)、丁酸(8.41%)、戊酸(5.33%)、庚酸(1.12%)、3-甲基丁酸(1.05%)是糟醅中的优势成分，占酸类成分含量的99.60%。乳酸不具有挥发性，故未检出。而检出的有机酸均属于窖泥中的优势成分[1]。
各优势酸类成分含量的分布规律为下层>中层>上层，且同层糟醅中距离窖泥越近含量越高，这与YAN等[14]的研究结果一致。值得注意的是，窖泥中的主要有机酸[1]，包括己酸、丁酸、戊酸和辛酸在下层糟醅中具有明显的扩散递减现象(0 cm>10 cm=20 cm>50 cm>100 cm)，推测原因是：一方面它们主要是由窖泥中梭菌属[15]细菌代谢产生，另一方面下层酒醅在发酵过程中由于原料水解和微生物的代谢生长活动使水分含量较高而呈现半固态，窖泥中的梭菌属等微生物可以通过迁移或扩散进入酒醅[16]，但由于从窖泥迁移至酒醅中的微生物并非是同比例增加的，故造成其代谢产物的含量有明显扩散递减现象。此外，中、上层中的乙酸含量高于下层。
a-窖池A; b-窖池B、S-上层、Z-中层、X-下层
图3 酸类成分的变化情况
Fig.3 Spatial ariation of acids in ferment grains
2.2.2 酯类成分
酯类成分是浓香型白酒固态发酵酒醅中最重要的微量香味成分[17]。本研究中共检出49种酯类成分，占糟醅香气成分总含量的75.97%，其中己酸乙酯(54.48%)、乳酸乙酯(14.78%)、乙酸乙酯(12.25%)、戊酸乙酯(3.79%)、庚酸乙酯(4.70%)、丁酸乙酯(2.45%)、辛酸乙酯(1.74%)、己酸己酯(1.00%)是糟醅中的优势酯类成分，占酯类成分含量的95.19%。四大酯类和其他酯类的变化情况如图4和图5所示，四大酯占总酯类的83.96%，其中己酸乙酯占比量高，占四大酯类总含量的64.89%，这与孙金沅等[18]的研究结果一致；乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯与己酸乙酯之比分别为0.27∶1、0.04∶1、0.22∶1，符合优质白酒要求的比例范围[19]。
糟醅中(图4)的己酸乙酯和丁酸乙酯含量的分布规律为下层>中层>上层，且同层糟醅中距离窖泥越近含量越高；上层和中层糟醅以乙酸乙酯或丁酸乙酯、乳酸乙酯为主，而下层糟醅中则是以己酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯为主。
a-窖池A; b-窖池B、S-上层、Z-中层、X-下层
图4 四大酯类成分的变化情况
Fig.4 Spatial ariation of four esters in ferment grains
a-窖池A; b-窖池B;S-上层、Z-中层、X-下层
图5 其他酯类成分的变化情况
Fig.5 Spatial ariation of other esters in ferment grains
由图5可知，其他酯类成分含量的分布规律：下层≥中层>上层，同层糟醅中0 cm(窖边糟)处的其他酯类成分含量显著高于同层中的其他位点，且下层中有明显的扩散降低现象(0 cm>10 cm/20 cm>50 cm≥100 cm)，可能的原因是：一方面由于窖底泥中的酯化酶活力高和厌氧功能菌代谢更旺盛，导致窖底泥产生积累的酯类等代谢产物持续进入糟醅中，使窖池下层糟醅酯含量高；另一方面如前文所述的黄水下渗积累所致[20]。己酸己酯、己酸丁酯是窖壁窖泥中的主要特征成分[21]，其在糟醅中的变化趋势为下层>中层>上层，且在0 cm处含量最高(分别为20～77和2～50 μg/g)，其他位点存在少量(分别为0.1～15和0.02～9 μg/g)。这可能由于己酸己酯和己酸丁酯的前体成分—己酸含量较高的原因(图3)。
2.2.3 醇类成分
醇类物质是由葡萄糖和氨基酸降解产生，是酯类的前驱物质[22]。如图6所示，本研究共检出9种醇类成分(占2.19%)，正己醇是除乙醇外含量最高的成分，具有割青草气味[23]和甜味，是浓香型白酒的重要醇类物质，在糟醅不同空间位置中分布规律为在0 cm处含量最高，同层其他位点含量较低且差异不明显。值得注意的是窖池B下层中各醇类成分在0和20 cm处较高，具体原因还需进一步明确。
2.2.4 芳香族成分
芳香族成分经酵母、细菌发酵生成，赋予了酒体优雅醇厚的风味特征[24]，白酒中芳香族成分包括苯乙酸乙酯、对甲酚、苯酚等[25]。如图7所示，本研究共检出11种芳香族化合物(占3.20%)，苯乙酸乙酯(典型蜂蜜香)、对苯酚(烟熏味、苯酚味、马厩味等复合气味)、苯酚在糟醅不同空间位置的分布规律为下层>中层>上层，且在同层中0 cm处含量最高。值得注意的是，窖泥中梭状芽孢杆菌的特征产物—对甲酚和苯酚在下层窖泥中的含量最高，且同层糟醅中0 cm处的含量最高,并且呈随与窖泥的距离增加而减少的趋势，可能是由于距离窖泥位置的不同，其微生物代谢作用不同所致。
a-窖池A; b-窖池B；S-上层、Z-中层、X-下层
图6 醇类成分的变化情况
Fig.6 Spatial ariation of the alcohols
a-窖池A; b-窖池B；S-上层、Z-中层、X-下层
图7 芳香族类成分的变化情况
Fig.7 Spatial ariation of the aromatic compounds
2.2.5 醛酮类成分
醛酮类化合物对浓香型酒的香气起到一定的作用，其含量过高容易造成酒体呈苦味[26]。如图8所示，本研究共检出4种醛酮类(占0.38%)，醛酮类化合物在糟醅不同空间位置的含量较低，且无显著的增减规律性。
a-窖池A; b-窖池B;S-上层、Z-中层、X-下层
图8 醛酮类类成分的变化情况
Fig.8 Spatial ariation of the aldehydes and ketones
续糟泥窖发酵是浓香型白酒区别于其他香型白酒的本质特征之一，窖池内微生物体系的构成主要包括大曲投料、环境空气中富集以及窖泥中栖息的原位微生物，通过直接或间接利用糟醅中的营养物质以及代谢前体物质，在糟醅自身、糟醅与窖泥接触的界面乃至窖泥中产生纷繁复杂的风味成分。本研究系统分析了糟醅中主要香气成分的空间分布规律，结果表明，在黄水下渗以及糟醅与窖泥的相互接触下，各类糟醅香气成分的空间分布规律为下层>中层>上层；再次确认了同层次窖边糟中香气成分的含量高于其他位点，其中的优势组分(己酸、丁酸、己酸乙酯、丁酸乙酯等)呈现显著的扩散递减趋势；醇类、芳香族类、醛酮类成分的总含量并未呈现显著的空间异质性，但部分与窖泥风味显著相关的物质具有显著的空间分布规律。本研究揭示了多粮浓香型白酒糟醅中香气成分的空间分布规律，对全面认识糟醅在酿酒中对原酒风味的影响程度具有一定的借鉴意义。
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