雪梨具有调节人体新陈代谢、促进血液循环、保护心脏、降低血压等多重功效[1],但其存在不耐储藏、附加值低等问题,利用发酵工艺对雪梨进行深加工,不仅能解决这些问题,还能丰富果酒种类,满足人们对于营养保健食品不断增加的需求。梨酒风味独特,清新淡雅,带有梨的特征香气,酒体颜色晶莹剔透,营养丰富。
目前,国内外研究者对特定种类的果酒进行了大量的研究,如葡萄酒[2-3]、苹果酒[4-5]、桑葚酒[6-8]等,但针对梨酒的研究较少,且主要集中在发酵工艺的优化[9-10]及菌种筛选[11]等方面,而针对雪梨酒的研究主要集中在复配发酵底物来丰富雪梨酒的类型[12-14]。初步实验研究发现,发酵周期对梨酒口感有重要的影响,且发酵周期短的甜型梨酒口感更好,因此,研究梨酒的关键质量参数随发酵时间的变化规律对于优化发酵工艺具有重要的意义,而相关研究目前尚无文献报道。
本研究对甜型梨酒发酵过程中的理化指标(总糖、总酸、酒精度、干浸出物等)和挥发性组分进行了动态跟踪分析,结合感官评价,获得梨酒品质随发酵时间的变化规律。本研究结果对梨酒发酵过程的工艺优化与控制提供了参考。
材料:河北赵县雪花梨。
试剂:葡萄酒果酒专用酵母(SY),湖北宜昌安琪酵母股份有限公司;NaCl、NaOH、NaHSO3,成都科隆化学品有限公司;盐酸、次甲基蓝、葡萄糖、(NH4)2SO4、CuSO4、酒石酸钾钠,成都金山化学试剂有限公司;果胶酶制剂(LALLZYME EX- ),法国拉曼公司;其他未说明试剂均采购自阿拉丁。
JYZ-E19原汁机,九阳股份有限公司;CeraMem-0025陶瓷膜小试设备(配备0.45 μm陶瓷膜),厦门福美科技有限公司;CS501超级恒温水浴锅,上海浦东荣丰科技仪器有限公司;BS100S分析天平,赛多利斯科学仪器有限公司;CX31显微镜,日本奥林巴斯有限公司;FEB-85恒温磁力搅拌器,上海双捷有限公司;DZS-708多参数分析仪,上海仪电科学仪器股份有限公司;IR200型手持式折光仪,上海仪迈仪器科技有限公司。
1.3.1 雪梨酒的制备
工艺流程:河北雪梨→洗净榨汁(加SO2)→酶解→添加营养物→接种酵母→(20±1)℃发酵→倒罐/微滤→雪梨酒。
基本操作步骤:选择成熟度较为一致,健康无病斑的新鲜雪梨,去梗流水冲洗干净,带皮切块榨汁,添加70 mg/L SO2杀菌并防止氧化,加入40 mg/L果胶酶制剂提高果实出汁率,室温酶解24 h。根据目标酒精度添加所需白砂糖,以200 mg/L的接种量接种酵母,启动发酵,温度控制在(20±1) ℃。发酵结束后,使用陶瓷膜过滤不同发酵时间醪液除菌中止发酵,即可得发酵各阶段雪梨酒。
1.3.2 理化指标的测定
总糖(斐林试剂直接滴定法)、总酸(电位滴定法)、干浸出物(密度瓶法)、和酒精度(酒精计法)测定方法依据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》;pH值由pH计测定;可溶性固形物由手持式折光仪测定;酵母菌数由显微镜血球计数板计数。
1.3.3 挥发性组分的测定
参考XIONG等[15]、GOU等[16]及NIU等[17]的方法。准确量取1.00 mL梨酒样品于装有磁力搅拌棒的25 mL顶空瓶中,加入1.00 mL蒸馏水及过量的NaCl使溶液饱和,以促进挥发性组分的挥发。加入10 μL辛酸甲酯(0.007 6 g/100 mL)和2-辛醇(0.007 1 g/100 mL)混合溶液。将顶空瓶置于60 ℃水浴中,预平衡15 min;插入固相萃取针,并将微萃取头(D B/CAR/PDMS,50/30 μm)伸出暴露于顶空瓶上空,于60 ℃吸附萃取45 min。
GC-MS配备条件:Thermo Fisher Electron公司出品的Trace GC Ultra DSQ II气相色谱偶联质谱仪配备HP-INNOWAX(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱,对挥发性组分进行分离与检测。
分离条件:进样口温度250 ℃;以高纯氦气为载气,流速设为1.00 mL/min,以分流模式进行,分流比为10∶1;色谱柱温度以程序性进行升温,40 ℃为起始柱温,在此温度下维持5 min,然后以5 ℃/min升温至220 ℃并维持5 min。质谱条件:电离方式EI,电子强度70 e ,离子源和转换线温度分别为200和250 ℃。色谱扫描范围m/z为40~400 amu。
感官评价小组由15名年龄在20~30岁的学生组成。由专业的果酒品评师按照GUCHU等[18]的方法进行训练。在无异味、安静、光线充足、25 ℃、相对湿度45%~55%的标准环境下进行品评。将待测样品撕去标签,随机摆放,将酒样均匀倒入国际标准化品尝杯中,每个样品的体积为30 mL。邀请评测人员通过眼、鼻、口等对发酵梨酒进行感官分析,根据评分标准,对梨酒色泽、甜香、果香、酸香、风格、口味6项指标进行打分评价。感官评价按0(差)到10(好)的标准进行评分。最后,通过绘制雷达图给出评价结果。
数据以平均值±标准偏差的形式表示(n=3)。采用Origin 9.0为作图软件,使用SPSS 21.0软件单因素方差分析(One-way ANO A)中的Duncan’s 功能进行显著性分析(P<0.05),使用simca 14.1对风味进行主成分分析(principal component analysis, PCA)。
果酒发酵过程中的酵母生长曲线如图1所示。发酵1 d时酵母数为3.95×106 CFU/mL,随发酵过程的进行酵母数不断上升,在发酵3 d时达到3.23×107 CFU/mL。发酵初期营养物质充分,酵母繁殖速率旺盛,酵母数量迅速上升。随后在发酵达到中后期时,底物被消耗,酵母的代谢和繁殖速度下降,酵母增长变缓。
图1 发酵过程中梨酒酵母菌数和主要理化指标的变化
Fig.1 E olution of yeast count and main physicochemical indexes of pear wine during fermentation
由图1可知,在梨酒发酵1 d时,酵母大量繁殖产生少量酒精,发酵1 d后酵母消耗糖类产生酒精。发酵2 d时酒精度达到5.4% ol,且随着发酵的进行,总糖减少速率趋于平缓。发酵第5天,酒精度和总糖水平趋于稳定,此时营养物质浓度的降低及高浓度的酒精抑制了酵母代谢。发酵第6天时,总糖质量浓度为29.34 g/L,而酒精度已达到13.1% ol,终止发酵。同时,随发酵的进行,可溶性固形物(total soluble solid,TSS)含量逐渐降低,这与发酵过程中总糖的变化一致;进入发酵中后期,梨酒的TSS含量逐渐趋于稳定。干浸出物是果酒非挥发性物质的总和,包括游离酸及盐类、单宁、色素、果胶、矿物质等,其含量决定着果酒的主体风味,干浸出物含量较高则酒体醇厚丰润,相反,则酒体单薄寡淡[19]。在梨酒的发酵过程中,干浸出物含量不断升高,第2天至第3天增长速率最大,可能是由于发酵前期营养物充分,酵母代谢旺盛,酵母将营养物代谢为多种物质,通过干浸出物得以表征,故而其含量大幅上升。进入发酵后期,糖类物质减少,在发酵结束时干浸出物达到最大值为35.66 g/L。
总酸是果酒发酵中的重要理化指标,对酵母菌的生长、成品酒的酒体和风味起着重要作用[20]。由图1可知,随着发酵的进行,酵母代谢旺盛,将糖类物质代谢转化为酸类等物质,总酸增加,但是增加幅度在逐步减少,在第5天到第6天趋于稳定(增幅0.08 g/L)。雪梨汁在补加糖及营养剂后接种发酵,pH显著下降至3.01。整个发酵过程pH是趋于稳定但有小幅度波动。酵母在发酵前期主要为有氧呼吸,繁殖迅速,代谢产生了一系列有机酸导致pH降低,而并未通过无氧呼吸生成大量酒精及CO2[21]发酵中后期,酵母主要进行无氧呼吸,产生的醇类和酸类因酯化消耗,pH基本稳定。
挥发性成分是构成和影响果酒品质及典型性的主要因素之一, 也是衡量果酒质量的重要指标[22]。通过顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术对梨酒不同发酵阶段的酒样进行挥发性组分鉴定,共检出挥发性组分34种,其中酯类12种,醇类物质7种,醛酮类物质4种,酸类4种,酚类3种,其他4种,各类物质的总量及所占比例如图2所示(详细数据见表1)。
梨酒挥发性组分的含量随发酵时间不断升高(图2-a)。挥发性物质总量在第5天和第6天增加显著,主要体现在醇类、酸类及酯类物质的增加。相比第3天,发酵第4天的挥发性物质总量变化较少。
醇类物质是果酒中主要的香气组分,由原料中的蛋白质、氨基酸和糖类在发酵过程中产生,香气主要表现为甜香、花果香[23]。本研究共检出7种醇类,分别为异丁醇、异戊醇、正己醇、顺-3-己烯-1-醇、芳樟醇、α-松油醇、苯乙醇。酒样中含量最高的为异戊醇、其次是苯乙醇,它们共同贡献梨酒香气中的茉莉花香、玫瑰香和果香[24],占醇类物质总量的92%以上,是构成梨酒的醇类风味主要物质。
a-发挥性组分质量浓度;b-各组分占比
图2 发酵过程中梨酒挥发性组分的变化趋势
Fig.2 E olution of olatile components in pear wine during fermentation
果酒中的酸类物质是由发酵初期酵母细胞繁殖代谢以及中后期醇类物质氧化产生的[25]。酸类物质不仅参与酯的形成过程,且对果酒的香气有着不可忽视的调节和平衡作用[26]。实验共检出酸类组分4种:己酸、辛酸、正癸酸、(±)-3-羟基月桂酸。梨酒发酵前期,酵母细胞繁殖较快,代谢产酸,发酵过程中部分积累的酸与糖代谢产生的醇类物质发生酯化反应,发酵后期各类香气组分大量积累,部分酸依然作为中间产物向其他物质转化。其中,辛酸是梨酒中含量较高的有机酸,低浓度时具有水果香、花香味,但是高浓度时具有油脂腐败味和涩味[27],该酸含量在发酵第4天时最低,而发酵第5、6天有较大程度的升高,可能对果酒风味有不利影响。
表1 梨酒样品中挥发性组分含量(n=3) 单位:μg/L
Table1 arieties and contents of olatiles in pear wine samples
化合物名称CAS#发酵时间/d3456酯类(12种) 乙酸异戊酯123-92-2264.05±26.29c489.72±100.75b547.68±30.22ab645.53±82.29a 正己酸乙酯123-66-066.45±9.60c119.79±28.11b169.37±24.23a136.31±21.60ab 乙酸己酯142-92-721.06±2.24c26.98±6.88bc56.35±4.02a31.00±2.55b 辛酸乙酯106-32-195.12±10.73c227.45±47.88a159.98±32.90b137.71±9.89bc 甲酸庚酯112-23-2nd24.16±4.76c58.14±10.52b76.35±2.86a 癸酸乙酯110-38-319.75±2.84c33.21±5.74b62.14±7.46a25.28±1.75bc 乙基9-癸烯酸酯67233-91-414.23±0.80c46.93±8.02b65.09±11.48a57.97±2.96ab 乙酸苯乙酯103-45-783.97±12.84c64.91±18.89c445.20±84.84a260.50±26.23b 2,2,4-三甲基,3-羧异丙基戊酸异丁酯nd15.79±1.43abnd12.38±2.48b18.30±4.42a 棕榈酸乙酯628-97-7117.41±58.49a90.03±30.46a23.27±6.63b18.14±1.92b 2-己基-1,1-双环丙烷-2-辛酸甲酯56687-68-410.70±3.89b30.27±8.27a21.30±13.86ab22.74±4.24ab 甘油亚麻酸酯18465-99-129.34±13.19andndnd酯总计737.87±11.07c1 153.46±236.50b1 620.90±186.13a1 429.83±77.22ab醇类(7种) 异丁醇78-83-175.10±7.52b81.21±14.98b93.59±23.99b176.46±28.88a 异戊醇123-51-31 545.97±243.05c1 792.93±97.55bc2 426.08±821.51b3 597.60±211.17a 正己醇111-27-384.61±11.51b74.47±12.04b116.52±15.82a121.68±7.20a 顺-3-己烯-1-醇928-96-116.35±3.56b14.17±1.71b26.28±3.97a25.70±1.99a 芳樟醇78-70-630.59±10.11ab23.83±3.69b41.79±1.32a38.63±4.24a α-松油醇98-55-57.96±0.55c4.42±0.00d10.98±0.00b20.56±2.07a 苯乙醇60-12-8918.49±107.22b946.46±220.87b1 247.38±103.17b2 782.70±290.39a醇总计2 679.07±382.00c2 937.48±348.93bc3 962.61±914.83b6 763.33±485.60a酸类(4种) 己酸142-62-194.75±13.74c84.72±16.98c169.85±17.60b216.52±39.96a 辛酸124-07-21 421.69±230.00b1 026.99±234.66b1 544.66±320.24b2 444.12±597.78a 正癸酸334-48-5217.09±38.72b87.50±24.65b1007.37±225.45a318.08±78.62b
续表1
化合物名称CAS#发酵时间/d3456 (±)-3-羟基月桂酸1883-13-239.26±5.82c35.67±9.89c192.85±36.06b237.57±22.97a酸总计1 772.79±286.06b1 342.37±109.11b2 914.73±298.64a3 216.28±737.51a酚类(3种) 4-乙烯-愈创木酚7786-61-014.58±2.24b10.63±2.58b17.25±2.92ab25.38±7.38a 2,4-二叔丁基酚96-76-4462.25±119.22a446.10±90.83a540.01±137.55a515.74±86.16a 4-乙基-愈创木酚2785-89-913.87±5.23a8.21±0.00bndnd酚总计490.69±117.51a464.94±92.71a557.26±135.58a541.12±92.92a醛酮类(4种) 对甲基苯甲醛104-87-015.72±4.89a13.31±3.71a11.63±2.04a14.31±3.74a 3,4-二甲基苯甲醛5973-71-724.65±7.78a28.92±5.13a27.24±12.27a29.03±8.41a 大马酮23696-85-710.93±3.89b5.82±1.78b10.70±2.81b21.59±2.99a 香叶基丙酮3796-70-1nd5.27±0.00b11.99±3.20a15.20±2.09a醛酮总计51.30±9.77b53.32±10.26b61.57±16.79ab80.13±15.16a其他类(4种) 癸烷124-18-5113.40±12.63a113.53±29.25a119.29±10.21a117.20±25.07a 8-丙氧基柏木烷19870-75-811.37±0.53b8.36±2.73b13.42±6.16b20.90±2.94a 紫罗烯475-03-627.68±8.57b23.41±9.94b38.14±35.12b85.00±15.49a 十一烷1120-21-420.99±1.23a18.41±7.60a18.31±0.00and其他总计173.45±11.62a163.71±48.18a189.16±47.55a223.09±8.50a总计(34种)5 905.17±789.68c6 115.27±749.86c9 306.23±1402.01b12 253.77±1273.67a
注:nd为没有或未检出;不同小写字母代表显著性差异(P<0.05)
酯类物质是酵母代谢产生的醇与积累的酸发生酯化反应生成的[28],是梨酒香气组分中最为重要的种类之一,大多数酯类具有特别的花果香气,对成品梨酒的风味贡献最大[29]。本研究共检出12种酯类,含量最多的3种分别是乙酸异戊酯、辛酸乙酯和正己酸乙酯,呈现出梨子香、甜香、水果香和水果糖香[27],以及癸酸乙酯(梨和白兰地香[30])、乙酸苯乙酯(愉悦的花香[31])和其他7种脂类物质。由图2-a可知,酯类物质含量随发酵的进行有显著增加,在第5天含量达到最高,随后略有下降。
如表1所示,酚类物质含量略有变化,活性物质4-乙基-愈创木酚只在第3、4天检出,而4-乙烯-愈创木酚基本无变化。醛酮类和其他类物质类似,只有小范围波动。
梨酒发酵过程中,挥发性组分的含量总体增长,而各类组分的增长率有差异,因此,各组分占比有较大变化,以酯类、醇类和酸类的变化最为明显(图2-b)。发酵第4天,酯类物质比例增加,酸类占比降低,发酵梨酒被赋予更多的花香和果香,风味开始凸显。发酵第5天,酯类和酸类组分继续富集,导致醇类组分的占比下降,酯-醇-酸的比例达到一定程度的平衡,酒体较为协调。发酵第6天,醇类组分含量增长显著,其占比较第5天有较大程度提高,并压缩了酯类和酸类组分的占比,影响了酒体的协调性。
为了更好的分析发酵阶段对梨酒风味物质的影响,对4个发酵时间的梨酒样品及检测到的34个风味物质成分进行主成分分析。以第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)建模作载荷、得分双标图如图3所示。其中PC1和PC2累积贡献率为85.80%,模型可靠。由图3可知,发酵第3、4、5和6天的酒样分别在4个象限,风味差距明显。由图3-a可知,棕榈酸乙酯(10)、甘油亚麻酸酯(12)、4-乙基-愈创木酚(26)和对甲基苯甲醛(27)是发酵第3天酒样的特征组分;发酵第4天,各类组分大量转化;在发酵第5天的梨酒中,酯类构成了其主要特征组分;发酵第6天则是醇类和酸类为主要成分。气味活度值(odor acti ity alue,OA )聚类结果(图3-b)则表明,第5天有3种特征物质OA >1、4种特征物质1>OA ≥0.1,风味特征明显。而第6天的特征物质仅芳樟醇OA >1,其余3种物质OA 均为0.1~1。
a-风味组分;b-OA
图3 基于风味物质的梨酒主成分分析图
Fig.3 Principal components analysis based on the
olatiles in different pear wine
注:3rd、4th、5th、6th为发酵时间(d);1~34为化合物序号(同表1)
根据PCA结果,可作如下推测:发酵第5天的梨酒中由于以酯类物质为主的特征组分丰富,且富集了绝大多数梨酒中OA >1的香气组分,因而具有更丰富的果香,且更具典型性。为了验证此推测,对不同发酵时间的酒样进行了感官评价。
a-感官评价雷达图;b-感官评价总分
图4 梨酒样品的感官评价得分。
Fig.4 Sensory e aluation scores of pear wine samples
不同发酵阶段梨酒的感官分析统计结果如图4所示。在梨酒发酵过程中,糖、酸、风味组分等物质时刻发生变化,因此,发酵程度对梨酒品质的影响显著。发酵第3天,梨酒甜味突出,具有丰富果香味,但酸香和甜香不足,是因为梨酒的特征风味组分尚未全部生成,在典型性方面欠缺。因此,在此发酵阶段的梨酒风味寡淡,酒香不突出。发酵第4天,总糖含量仍然较高,甜度酸度较为协调,酒体相比第3天获得了一定的风味层次感,但果香减弱,风格并不突出。发酵第5天,总糖含量降低,甜香和酸香均得以体现,酸甜协调、果香浓郁、有层次感,在此发酵阶段酒样获得了较为典型的甜型梨酒风格。发酵第6天时,醇香浓郁、果香味寡淡、酸味突出、略带涩味,感官评价得分较第5天有所降低,这可能与其酯类占比下降、醇类占比反弹有一定的关系,可见挥发性组分总量的增高并不一定提升梨酒的整体风格。在酒体色泽方面,发酵第3天呈浅黄色,第4~6天的样品酒体均呈现优雅的金黄色,未表现出显著差异。
发酵第3~6天梨酒样品的感官评价表明,随着梨酒发酵的进行,酒精度升高的同时果香味也随之变淡,果香和酸香在发酵的第5天达到比较平衡的状态,此酒样在感官评价中的得分最高,结合梨酒理化指标及挥发性组分的分析,建议发酵5 d为雪梨酒的最佳发酵时间。
本研究通过对发酵过程中理化指标和挥发性组分等进行跟踪分析,揭示了甜型梨酒品质随发酵时间的变化规律。结果表明,酒精度、总糖、总酸、干浸出物等理化指标和挥发性组分,对发酵梨酒品质的影响显著。随着发酵的进行,糖不断消耗,酒精度、干浸出物不断升高,挥发性组分及其含量也不断增加,而比例则不断变化。相比之下,发酵第5天的梨酒具有更加协调的品质,如继续发酵导致酯类组分比例的降低和醇类组分比例的升高,从而影响梨酒口感,因此,对于雪花梨,梨酒的最佳发酵饮用时间建议为第5天。
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