益生发酵酸乳由于具备调节人体肠道菌群、缓解乳糖不耐症、降胆固醇以及延缓衰老等功效[1]而深受消费者青睐。一般情况下，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混合菌株是酸奶发酵常用的主要菌种。发酵的过程中也可以添加双歧杆菌、乳酸链球菌、干酪乳杆菌等[2]菌种。由于对干酪乳杆菌的研究不断加强，人们也发现了其对人体健康的有益功效。比如对人体的免疫调节，在食品行业形成了重要地位。由于干酪乳杆菌具有耐酸、耐胆盐能力强的特点，也常常单独用于食品发酵中，其中发酵类乳制品较多[3]。如DIMITRELLOU等[4]在苹果片和酪蛋白中添加冻干固定化干酪乳杆菌，将其接种到酸奶中发酵，这种新型的功能性酸奶产品在保藏的过程中保持了干酪乳杆菌的活力，酸奶的香气和风味也得到了明显的改善。又如，胡风林发现用青春双歧杆菌和干酪乳杆菌发酵剂以2∶1接种，即可得到富硒酸奶[5]。
多数实验用混合益生菌株来发酵酸乳，而用单一益生性干酪菌株发酵的较少。所以本研究采用已证明的具有益生特性的单一干酪乳杆菌，根据其耐热、耐盐性、最适温度、产酸能力、产黏能力、后熟情况、最终所需求的发酵乳的特性等来确定选择标准[6]。本实验室对从湖南南山牧场牛奶中分离的,经以往的实验验证为益生菌的1株干酪乳杆菌LC-7进行了研究，以确定其生物活性。且对该菌株的长期发酵特性进行了研究，得出了该菌株在功能性乳品开发中的重要结论，为开发功能性乳制品提供了科学依据。
干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei) LC-7，为湖南农业大学实验室筛选保藏，经以往的实验验证，具有益生特性。MRS肉汤固(液)体培养基，广东环凯微生物科技有限公司；20%(质量分数)脱脂牛乳培养基(配制方法为：将20 g的脱脂乳粉溶于80 g去离子水中，于115 ℃条件下高温灭菌20 min，灭菌后置于34 ℃条件下保存3 d，确认无菌后使用)；脱脂奶粉，澳优-澳优乳业(中国)有限公司。
GZ-400-S恒温培养箱，韶关市广智科技设备有限公司；SW-CJ-2D双人单面垂直净化工作台，苏州净化有限公司；BKQ-B7511压力蒸汽灭菌器，山东博科生物产业有限公司；FB224、NDJ-8S型黏度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；pH计，上海般特仪器有限公司；UV-1600PC型分光光度计、GCMS-QP2010型气质联用仪，岛津企业管理(中国)有限公司。
1.3.1 干酪乳杆菌的活化
在已灭菌好的MRS液体培养基中接种干酪乳杆菌种子液，于37 ℃条件下培养24 h并活化2次。
1.3.2 菌株的生长特性
1.3.2.1 干酪乳杆菌生长曲线的测定
将2%活化好的干酪乳杆菌接种于60 mL的MRS液体培养基中，试管分为5组，每组12支，分别间隔0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、24 h，并分别于32、34、37、40、42 ℃下培养，培养过程中按编号上的对应时间将试管取出，使用紫外分光光度计测出的OD600nm值绘制生长曲线。
1.3.2.2 菌株耐盐性测定
将活化的对数相菌液按2%的接种量(每组3个)接种于质量分数为0%～7% NaCl的MRS液体培养基中，培养24 h。用紫外分光光度计测定OD600nm值，评价菌株的耐盐特性[7]。
在800 g去离子水中加入200 g的脱脂乳粉，高温灭菌20 min，温度设定115 ℃，灭菌后于34 ℃条件下保存2 d，确认无菌后分装到试管内，按2%的接种量将LC-7菌液接种到装有20%(质量分数)脱脂牛乳的试管中，混匀后于34 ℃条件下培养。
按照1.4制备发酵乳，分别在0、8、14、20、24 h取样测定其 pH值、滴定酸度、黏度、活菌数、稳定性等指标(每组做3个平行)，发酵后的乳样在4 ℃冰箱中保存24 h，分别在放置0、8、14、18、20、24 h测定上述指标。
1.6.1 测定酸乳pH值
利用pH计测定酸乳在不同发酵时间、贮藏时间下的pH值，并绘图。
1.6.2 测定酸乳滴定酸度
参照GB/T 12456—2008测定酸乳在不同的发酵时间、贮藏时间下的滴定酸度，并绘图。
1.6.3 测定酸乳黏度
利用 NDJ-8S 型数显黏度计测定酸乳在不同的发酵时间、贮藏时间下的黏度，并绘图(参数为1～2×106 mPa·s)。
1.6.4 测定酸乳活菌数
将酸乳样品利用无菌生理盐水(质量分数0.85% NaCl)稀释得到7个梯度(10-1～10-7)，并对后3～4个梯度进行活菌数的测定，每个梯度平行3次。
1.6.5 测定酸乳稳定性
参考刘素纯等[8]关于测定酸乳离心沉淀率的方法来判断酸乳的稳定性。酸乳通过3 min的离心操作(8 000 r/min)后，移除上清液，酸乳的稳定性即为沉淀物质量与样品质量的比值如公式(1)所示：
沉淀率
(1)
1.6.6 测定酸乳蛋白水解酶活性
将1%(质量分数)的脱脂奶粉加入平板计数琼脂中，在7 ℃条件下培养10 d后，进而在37 ℃下孵育48 h，形成透明成晕的菌落的蛋白水解酶活性记为阳性。
1.6.7 干酪乳杆菌LC-7发酵乳挥发性风味物质的分析
参照雷文平等[9]测定发酵椰奶风味物质的方法以气质联用分析发酵乳挥发性风味物质成分。将已灭菌好的脱脂乳分成等量的2份，一份加入3%(质量分数)的普通酸奶发酵剂，另一份加入1.5%(质量分数)的普通酸奶发酵剂和1.5%(质量分数)的干酪乳杆菌LC-7混合发酵。24 h后取出，分别放入气质联用仪测定其挥发性风味物质成分。
样品预处理:在15 mL萃取瓶内称取1 g发酵好的酸乳样品，将提取瓶的盖子拧紧，并在50 ℃下处理30 min。老化后，萃取头在70 ℃下吸附45 min。然后用气质联用仪进样口解吸1 min。
气相色谱条件:DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);入口温度为250 ℃;柱箱升温程序:初始温度35 ℃、3 min, 3 ℃/min升温至200 ℃，20 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min。载气为氦气，流速为1 mL/min。通过分流比10∶1的自动注射分流进行。
MS条件:电磁电离源，离子源温度250 ℃；界面温度200 ℃；检测电压1 kV，质量扫描范围m/z为35～400。
绘制L. casei LC-7 的生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为发酵液OD600nm值。结果如图1所示，在42 ℃条件下，菌株生长规律不明显，在32、34、37、40 ℃时菌株的生长趋势相似，菌体浓度0～3 h生长迟缓，此时菌株进入生长的延滞期，此时菌株处于进入新环境后的适应阶段；菌体浓度在3～20 h进入对数生长期，进行快速生长繁殖；菌液浓度在20～24 h进入稳定期，并缓慢上升，培养环境中的营养物质积累达到最高峰，24 h后菌液浓度保持稳定，即将进入衰亡期。在这4组温度间，菌株在34 ℃的生长状况优于其他4组。在生长速度最快的8 h，发酵液的OD600nm值分别为0.476(34 ℃)、0.451(37 ℃)、0.373(42 ℃)；在24 h菌株达到稳定期间，发酵液的OD600nm值为0.802(32 ℃)、0.813(34 ℃)、0.713(37 ℃)、40 ℃和42 ℃的OD600nm值还不到0.500。34 ℃时，菌株生长速度相对于比其他温度快，34 ℃细菌生长延滞期短、指数期较快，稳定后的菌液浓度也高于其他温度。因此，可以确定该株菌的最适生长温度为34 ℃。
图1 不同温度下L. casei LC-7 发酵液OD600nm值的变化
Fig.1 Changes of OD600nm value of L. casei LC-7 fermentation broth at different temperatures
较高的盐浓度会使微生物的渗透压升高，水分活度降低，结果微生物的血浆壁分离死亡，因此益生菌的主要特征之一是耐盐性。由图2可知，菌株对盐浓度较为敏感。NaCl质量分数<3%时，对L. casei LC-7 的生长影响可以忽略不记，当NaCl质量分数达到7%时，LC-7的生长速度受到很大影响。
图2 不同质量分数NaCl对干酪乳杆菌LC-7生长的影响
Fig.2 Effects of different NaCl concentrations on the growth of L. casei LC-7
2.3.1 L. casei LC-7 酸奶在发酵以及贮藏过程中pH值的变化
发酵过程中，菌体代谢将乳糖转化为乳酸，使牛乳变酸，pH值下降，同时与牛乳中的凝乳酶的共同作用，使牛奶凝固，并产生特定的风味，也可防止杂菌污染[10]。如图3所示，对脱脂乳中发酵的干酪乳杆菌LC-7的酸度变化进行了测定。在发酵过程中pH值缓慢下降，14 h时肉眼可见酸乳逐渐变为半固体，开始凝乳转变为乳酸，24 h时pH值达到了4.67。而酸乳在贮存期间pH值变化幅度较小，基本趋于稳定。因此，干酪乳杆菌LC-7具有良好的乳品发酵性能。
图3 L. casei LC-7 pH值随发酵时间与贮藏时间的变化
Fig.3 L. casei LC-7 pH value changes with fermentation time and storage time
2.3.2 L. casei LC-7 酸奶在发酵以及贮藏过程中滴定酸度的变化
菌体发酵产酸的结果控制着滴定酸度的变化。测定干酪乳杆菌LC-7在脱脂乳中发酵的酸度，以此评价菌种产酸作用强度。图4显示了随着发酵时间的延长滴定酸度逐渐升高，滴定的酸度为40.4 °T。滴定酸度变化不明显是在酸乳贮藏期间，一般保持在80～110 °T。由此可以确定其发酵酸乳具备产酸能力。
图4 L. casei LC-7滴定酸度随发酵时间与贮藏时间的变化
Fig.4 Changes of L.casei titrated acidity with fermentation time and storage time
2.3.3 L. casei LC-7 酸奶在发酵以及贮藏过程中黏度的变化
黏度是评价酸奶口感及质量控制的重要指标之一，若控制不好，会产生乳清析出，或出现豆腐样结构，影响其商业价值和食品安全[11]。由图5可知，发酵开始时0～14 h发酵乳黏度变化较慢，增长幅度较小。14 h时开始发酵乳黏度增加；在20 h之后，发酵乳黏度增长迅速。这时发酵结束的酸奶中蛋白酶继续发挥作用，催化底物蛋白水解，改变酸奶中微小蛋白质亚胶体分子团的状态，使得他们之间的亲合作用减弱，进而引起酸奶胶体的刚性降低和胶体分子团聚集成的蛋白质网络松散的结果[12]，在酸乳贮藏时期，前期随着时间延长，酸奶的黏度总体呈先上升，后期略微下降的趋势，搅拌和均质酸奶结构遭到破坏，可能导致酸奶在贮藏期间黏度不稳定，有部分乳清析出。
图5 L. casei LC-7黏度随发酵时间与贮藏时间的变化
Fig.5 The L.casei viscosity changes with fermentation time and storage time
2.3.4 L. casei LC-7 酸奶在发酵以及贮藏过程中活菌数的变化
图6为发酵过程中活菌的变化。前期活菌变化较小，发酵14 h后活菌变化增大。干酪乳杆菌LC-7的活菌数在整个发酵过程中呈上升趋势，且呈正相关。发酵后，活菌总数达到6.2×107 CFU/g。贮藏前期活菌数下降趋势不明显，后期下降趋势明显增加。24 d后的活菌数为4.3×107 CFU/g。
图6 L. casei LC-7活菌数随发酵时间与贮藏时间的变化
Fig.6 The number of L.casei viable bacteria changes with fermentation time and storage period
2.3.5 L. casei LC-7 酸乳在发酵以及贮藏过程中的稳定性
由图7可知，发酵酸乳的稳定性在0～14 h呈缓慢上升趋势，且稳定性较高，14 h过后，酸奶开始凝乳，在发酵中后期，酸乳稳定性急剧下降，但在贮藏阶段，酸乳的稳定性基本保持在55%～65%。这是由于酸奶在发酵期间酸度升高，而在贮藏期间酸度逐渐降低, 当达到酪蛋白的等电点时，酪蛋白胶粒会聚集沉降[13]，这两方面会引起酸乳中微小蛋白质的胶体分子团发生变化，使它们之间的亲合作用减弱，使酸乳胶体的刚性降低和胶体分子团聚集成的蛋白质网络松散，导致酸乳的稳定性下降[14]。
图7 L. casei LC-7酸乳稳定性随发酵时间与贮藏时间的变化
Fig.7 The stability of yoghurt L.casei changed with fermentation time and storage time
2.3.6 L. casei LC-7 酸乳在发酵以及贮藏过程中的蛋白水解酶活性
因为蛋白质被乳酸菌利用的能力差异较大，由于细胞内蛋白酶的活性不同，所以有的蛋白质被分解，还有一些只能利用胨、肽和氨基酸。在酸奶加工中，蛋白质水解酶发挥重要作用。包括乳蛋白酶能释放不同的肽和游离氨基酸，进而影响酸奶的物理结构，同时会释放功能肽，影响酸奶的风味[15]。
由表1可知，发酵酸乳在0～18 h均未出现透明圈，蛋白水解酶活性为阴性，20 h以后，在脱脂牛乳平板上出现透明圈，24 h透明圈较为明显。蛋白水解酶活性为阳性。干酪乳杆菌LC-7具有水解蛋白的能力，但其水解活力较弱，再利用其发酵性质时较为缓慢，但对于其风味的产生有益。
表1 L. casei LC-7发酵酸乳蛋白水解酶活性检测结果
Table 1 Results of proteolytic enzyme activity in L. casei LC-7 fermentation yoghurt
时间/h0814182024蛋白水解酶活性----++
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性
2.3.7 L. casei LC-7酸乳挥发性风味物质分析
风味物质中主要成分包括非挥发性酸、挥发性酸、羰基化合物及挥发性酯类等。而发酵乳风味的主要来源离不开其中的挥发酸和羰基化合物。产品的优良性质与这些风味物质的含量有着密切关系[16]。由表2可知，干酪乳杆菌LC-7发酵酸乳的风味物质占比较大，其中含有6种醇类、6种酸类、6种酯类、1种酚类和2种酮类物质。
酸类物质决定发酵酸乳的滋味，对比普通发酵酸乳与混合发酵酸乳中酸物质的相对含量，发现车叶草苷酸和3-丁炔酸只在混合发酵酸乳中检测到；苯甲酸与乙烯基癸酸在二者中均存在且相对含量较高，可见以上4类物质是影响发酵酸乳的重要风味成分。
酮类物质存在于混合发酵酸乳中，是酸乳中的重要风味物质之一。其中2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮和3-甲基-3-吡唑啉-5-酮的相对含量分别为为1.08%和0.186%。酮类挥发性化合物一般呈奶油味或果香味[17]，相比于普通发酵酸乳，其风味更加醇和。
酯类物质也是酸乳中重要的风味物质，普通发酵酸乳和混合发酵酸乳酯类含量都比较高，棕榈酸乙烯酯、十八酸乙烯酯和甘油三酯在混合发酵乳中的相对含量最高，分别达到19.364%、32.835%和35.975%，但相比于普通发酵酸乳，酯类含量明显降低，减少了酸乳的油腻感，使酸乳的口感更加清淡绵柔。
通过实验可以看出，普通发酵剂发酵出的酸乳风味成分较为单一，相比于普通酸奶而言，干酪乳杆菌LC-7的挥发性风味物质更丰富，尤其是在酸类和酮类物质中较为明显。且比普通酸乳多了酸味和果香味，使酸乳的口味更佳。
作为益生菌之一的干酪乳杆菌，不仅对人体无任何毒害作用，而且还可以对其宿主营养、免疫、防病等具有显著的益生功效[12]。本实验对现有保藏的1株经验证后具有潜在益生特性的干酪乳杆菌LC-7的最适生长条件和发酵特性进行研究，综上实验可以得出，干酪乳杆菌LC-7的最适生长温度为34 ℃，且在人体一定盐浓度环境下可以存活，具备较好的耐盐性能；34 ℃条件下24 h基本进入稳定生长期。其发酵性能良好，14 h基本凝乳，发酵结束时pH值为4.67，滴定酸度为86.6 °T，黏度基本维持在189 mPa·s。4 ℃贮藏时其稳定性基本保持在55%～65%。挥发性风味物质优于普通发酵酸乳。总之, 本试验为干酪乳杆菌在今后开发利用上提供了重要理论研究，但对于其确切的功能性质以及制作乳制品发酵剂还需要动物模型实验进行进一步的验证，后续工作仍有待考究。
表2 不同样品挥发性成分
Table 2 Volatile components of different samples
类别化合物名称保留时间/min相对含量/%普通酸乳混合发酵酸乳普通酸乳混合发酵酸乳醇类3-丁炔-1-醇4.0144.0191.7250.633糠醇4.3364.57511.6190.4563-呋喃甲醇-4.86100.7431-二十二醇-35.83900.405胆固醇49.24549.26814.5232.532二十八烷醇47.428-0.9680酸类车叶草苷酸-4.73200.203苯甲酸13.32513.5272.1790.253辛酸13.437-2.3603,丁炔酸-22.91400.068肉豆蔻酸25.9440.7260乙烯基癸酸56.95656.9682.8440.9294-甲基-6-叔丁基苯酚-38.43003.36酯类4-甲基-2-戊酸甲酯-4.67500.236邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯40.446-2.1790邻苯二甲酸二十三酯-40.44800.743棕榈酸乙烯酯-46.825019.364十八酸乙烯酯46.83847.96558.45732.835甘油三酯-51.642035.975酮类2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮-12.73701.083-甲基-3-吡唑啉-5-酮-14.23600.186
注：“-”表示样品中该风味化合物未检测出
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