汞是自然界中一种常见的污染物,在自然界中主要以无机汞和有机汞的形态存在。汞化合物的毒性依赖于其化学形态和浓度,甲基汞是毒性最强的汞化合物之一,并通过食物链富集可对人体中枢神经系统造成不可逆的损害[1]。基于汞形态毒性的差异,仅测定食品中的总汞含量已不能满足评价汞毒性的需求,因此采用高灵敏度的形态分析测定方法测定食品中的汞含量对食品安全具有积极的意义[2]。野生食用菌为一类珍稀名贵的食材,富含蛋白质、氨基酸、多糖、维生素及多种矿物质元素,因其味道鲜美,营养丰富,深受国内外消费者喜爱。野生食用菌重金属含量与土壤、水分、大气等生长环境因子具有密切联系。多数对重金属 Hg、As、Cd、Pb有很强的富集能力,尤其是汞含量超标问题凸显,对消费者身体健康造成威胁[3]。因此,研究汞元素的化学形态对正确认识野生菌中汞元素对人体的危害具有重要意义。
目前汞形态分析主要有高效液相-紫外检测器联用法(high performance liquid chromatography-ultraviolet ,HPLC-UV)、气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry ,GC-MS)、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)、液相色谱-原子荧光光谱法(liquid chromatography - atomic fluorescence spectrometry ,LC-AFS)[4]等方法。但是GC-MS法需要将汞衍生化处理成气态化合物,经过萃取才可上机测定,过程繁琐[5]; HPLC-UV 对流动相要求较高,灵敏度较低,不适合低含量的样品分析;而LC-AFS虽然使用成本较低,但是由于汞灯的不稳定,造就分析时基线漂移,稳定性欠缺。HPLC-ICP-MS 具有检出限低,精密度高,和分离效果好等优点被广泛应用[6]。本文采用微波萃取并结合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术,建立了快速、准确测定食用菌中不同形态汞元素的方法,检测前处理简单,线性范围宽,检出限低,为全面客观评价野生食用菌中汞元素的危害提供了方法依据和基础数据。
黄牛肝菌、黑牛肝菌、松茸、青杠菌、黑虎掌菌、黑松露、葱菌、鸡枞菌、羊肚菌、鸡菇,四川川野食品有限公司。
iCAP RQ型电感耦合等离子体质谱仪、U3000型HPLC高效液相色谱仪(色谱柱Thermo C18-5 μm, 4.6 mm×150 mm),赛默飞世尔;超纯水仪,德国密理博公司;分析天平,瑞士梅特勒-托利多公司;微波消解仪,安东帕;甲基汞(metHg,(65.5±2.5) μg/g)、乙基汞(etHg,(76.4±2.8) μg/g)、苯基汞(phHg,纯度 98.0 %)、二价汞(Hg2+,10 μg/mL)标准物质,国家标准物质中心;乙酸铵(色谱纯)、 L-半胱氨酸(优级纯)、氨水,天津科密欧化学试剂有限公司;甲醇(色谱纯),赛默飞世尔。实验用水均为去离子水;实验中所用器材均用25%的HNO3溶液浸泡过夜,去离子水冲净晾干备用。
1.3.1 溶液的配制
无机汞(Hg2+)标准储备溶液:取适量标准溶液,用2% HNO3逐级稀释成质量浓度为10 μg/mL的标准储备液,避光保存于4 ℃冰箱中[7]。甲基汞(metHg)、乙基汞(etHg)、苯基汞(phHg)标准溶液储备液:标准溶液分别转入10 mL容量瓶配制成10 μg/mL的标准溶液(以Hg计),避光保存于4 ℃冰箱中。混合标准溶液:分别移取无机汞、甲基汞、苯基汞和乙基汞标准储备液用流动相(20 mmoL/L乙酸铵+1.0 g/L L-半胱氨酸+5%甲醇)逐级稀释成质量浓度为0.00、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0 μg/L的汞形态混合标准系列溶液,现用现配。
1.3.2 仪器条件
色谱条件:色谱柱Thermo C18 (4.6 mm×150 mm),5 μL流速1.0 mL/min,进样量20 μL,柱温35 ℃,流动相:5%甲醇+20 mmol/L乙酸铵+1.0 g/L L-半胱氨酸。ICP-MS工作参数:射频功率1 550 W,采样深度5 mm,半导体制冷温度 -5 ℃,检测器电压(计数) 1 037.5 V,检测器电压(模拟):-1 787.5 V,冷却气流量14 L/min,Hg质量数202,检测模式KED,采样锥和截取锥为铂锥,载气为≥99.999%高纯氩。
1.3.3 样品前处理
1.3.3.1 微波萃取-酸提取
准确称取制备混匀的样品约0.5 g于微波消解罐中,加入10 mL 6 mol/L的盐酸溶液,静置30 min后在85 ℃、功率为1 000 W的条件下微波消解15 min。冷却后将提取液转移到离心管,用少量超纯水转移消解罐的残渣,逐滴缓慢加入NaOH溶液(6 mol/L),使样液pH 为5~7,然后于4 ℃,8 000 r/ min离心15 min。转移全部上清液于25 mL容量瓶中, 再加入1 mL L-半胱氨酸溶液(25 g/L),用超纯水定容至刻度,最后用0.45 μm滤膜过滤后分析测定[4],同时做试剂实验。
1.3.3.2 超声辅助-酸提取
准确称取制备混匀的样品约0.5 g于50 mL塑料离心管中,加入10 mL,6 mol/L的HCl溶液,放置过夜。室温下超声水浴提取60 min,期间振摇数次,将提取液转移到离心管[8-9]。下同微波萃取-酸提取方法。
1.3.3.3 碱-甲醇溶液提取
准确称取制备混匀的样品约0.5 g于50 mL 塑料离心管中,加入10 mL 25%氢氧化钾甲醇溶液,旋涡混匀,于90 ℃水浴2 h,冷却至室温后,甲醇补充至10 mL,离心后取其中1 mL用流动相稀释至10 mL,使用6 mol/L HCl调节pH为5.0~7.0, 0.45 μm滤膜过滤后测定[10-11],同时做试剂实验。
所有测量数据均重复测定3次,结果以平均值±标准偏差表示,采用 Origin 8.0 绘图软件绘图,实验数据采用Excel软件进行统计分析。
定量分析汞形态时,汞化合物的提取是关键,本文取松茸和牛肝菌为基质比较微波萃取-酸提取、碱-甲醇溶液提取、超声辅助-酸提取3种不同的汞形态提取方法。通过加标回收实验(以甲基汞计)比较不同前处理方式的提取效果,见表1。
表1 前处理方式对汞化合物(以甲基汞计)提取率的影响
Table 1 Effect of pretreatment methods on extraction rate of mercury compounds (metHg)
样品前处理方式微波萃取-酸提取碱-甲醇溶液提取超声辅助-酸提取松茸加标量/(mg·kg-1)0.050.250.050.250.050.25回收率/%79.1~112.282.5~104.353.2~73.658.3~76.959.8~83.460.4~84.6牛肝加标量/(mg·kg-1)0.050.250.050.250.050.25菌回收率/%78.7~109.378.5~98.952.8~69.749.9~79.761.3~79.558.8~75.8
由于干制野生食用菌的特殊性,水分含量少,含有丰富的蛋白质、氨基酸、粗纤维、多糖等,特别容易因为样品前处理方式不当提取不完全,回收率低[12]。通过试验发现,碱-甲醇溶液提取容易引入复杂成分,干扰测定结果,导致检测结果不稳定,并且处理过程复杂,而且回收率低;酸提取基体干扰较少,过程简单,但比较微波萃取-酸提取和超声辅助-酸提取2种方法,后者因为提取条件相对温和,无法完全破坏干制食用菌的有机成分,使提取效率和回收率达不到实验要求。而微波萃取-酸提取方式则能很好的破坏其有机质,回收率为78.7%~109.3%,既节省时间提高了效率又能保证提取效果,因此本实验用微波萃取-酸提取对样品进行前处理。
2.2.1 流动相中甲醇浓度优化
经实验发现流动相中加入适量的甲醇会改善汞的形态分离效果[13]。实验研究不同浓度甲醇(2%~10%,体积分数)对分离效果的影响,结果表明,甲醇浓度增加,4种汞形态的保留时间逐渐变小,分析时间变短。仪器响应值也会随着甲醇浓度的增加变强,但超过5%会使仪器的雾化器的雾化效率,仪器的灵敏度降低。超过8%后会使等离子体熄火。综合考虑,选择甲醇浓度为5%(体积分数)。
2.2.2 L-半胱氨酸的浓度优化
由于汞元素的特殊性,在测定汞时会有较强的记忆效应,特别是汞形态分析时,目标物在进入检测器前会通过长的管路,特别容易形成记忆效应[14-15]。通常考虑加入合适的络合剂避免汞化合物在管路、色谱柱、矩管、采样锥和截取锥中富集[16]。常见的络合剂多为含硫化合物,如2-巯基乙醇,L-半胱氨酸,同型半胱氨酸等,考虑L-半胱氨酸的亲水性较强,与汞形成的络合物在C18柱上保留较弱,即可降低记忆效应,又能缩短检测时间,故实验选用L-半胱氨酸作为络合剂[17-18]。形成的试验发现不加入L-半胱氨酸时,汞形态不能很好地分离,而加入L-半胱氨酸可以正常实现分离。流动相中L-半胱氨酸质量浓度分别为0.4、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L时,用20 μg/L的混合标液分别进样10次,看基线强度变化情况。研究发现L-半胱氨酸质量浓度为1.0 g/L时,分离效果及峰型均有所改善,仪器响应值较好,而且汞的化合物洗脱完全,基本消除汞的记忆效应。继续增加其用量没有明显变化。
用HPLC-ICP-MS分析测定干制野生食用菌中汞的形态,结果表明,方法在1~50 μg/L线性良好,无机汞、甲基汞、苯基汞和乙基汞相关系数分别为0.999 2、0.999 6、0.999 3、0.999 5,甲基汞含量测定的线性方程为y=3 549 345x-806 689,乙基汞含量测定的线性方程为y=3 093 569x+462 418,无机汞汞含量测定的线性方程为y=2 359 142x-756 262,苯基汞含量测定的线性方程为y=2 986 272x+382 461。选择流动相组成(5%甲醇+20 mmol/L乙酸铵+1.0 g/L L-半胱氨酸),采用等度洗脱的方式,色谱峰分离效果图见图1。根据检出限的方法,测定无机汞、甲基汞、乙基汞和苯基汞的检出限。结果见表1。按照前处理方式称样量为0.5 g,定容量为25 mL,计算该方法无机汞、甲基汞、乙基汞、苯基汞定量限分别为0.009、0.024、0.018、0.024 mg/kg。
图1 汞形态分离效果图
Fig.1 Diagram of mercury speciation
表2 MetHg、etHg、phHg、Hg2+方法测定低限 单位:μg/L
Table 2 MetHg、etHg、phHg、Hg2+ method to determine the low limit
元素空白测定值(n=11)X±S检出限定量限R值metHg0.2520.2510.2430.2840.2450.2470.253±0.0180.0530.1770.999 60.2500.2410.2380.2450.292etHg0.4190.3150.3940.4360.3260.4050.379±0.0490.1460.4880.999 30.3250.4130.3120.4220.406Hg2+0.2980.2860.2810.2790.2330.2800.270±0.0370.1110.3690.999 20.2870.1970.2220.2830.323phHg0.5630.4680.5310.4480.5010.5160.502±0.0470.1420.4710.999 50.4720.4810.5470.5680.427
注:x±s表示平均值±标准差
在实际产品中不容易找到同时存在4种汞化合物的样品,本实验混合标准溶液(2.0 μg/L)上机进行测试7次,结果见3。甲基汞质量浓度平均值为2.12 μg/L,相对标准偏差为6.1%,乙基汞质量浓度平均值为1.99 μg/L,相对标准偏差为7.5%,无机汞质量浓度平均值为1.92 μg/L,相对标准偏差为9.9%,苯基汞质量浓度平均值为1.90 μg/L,相对标准偏差为5.5%。
表3 精密度实验 单位:μg/L
Table 3 The precision test
实验编号汞形态Hg2+metHgetHgphHg11.862.162.181.8521.922.281.851.9631.732.032.092.1342.152.132.162.0552.222.261.951.8461.762.031.831.9971.831.931.882.07平均值1.922.121.991.98标准偏差0.190.130.150.11RSD/%9.96.17.55.5
选取牛肝菌、松茸、羊肚菌3种干制野生食用菌做加标回收实验,分别向其中添加3个水平(0.04、0.25、0.50 mg/kg)的汞形态混合标准溶液,分析结果见表4。由表可知,4种汞形态的加标回收率分别为81.6%~117.5%, 81.8%~93.6%,83.0%~99.4%,77.5%~92.5%。满足GB/T 27404—2008标准给定的方法回收率。由此可见,在本实验选定的实验条件下,研究选用的仪器条件和实验方法的可靠性较高。
表4 不同样品中4种汞形态的加标回收率
Table 4 The recoveries of four mercury species in different samples
样品汞形态Hg2+metHgetHgphHg本底值/(μg·L-1)6.622.150.000.00牛肝菌加标值/(μg·L-1)0.805.0010.000.805.0010.000.805.0010.000.805.0010.00测定值/(μg·L-1)7.5610.7615.672.886.7611.510.754.479.190.734.378.35回收率/(μg·L-1)117.582.890.591.292.293.693.889.491.991.287.483.5本底值/(μg·L-1)0.2810.1560.000.00松茸 加标值/(μg·L-1)0.805.0010.000.805.0010.000.805.0010.000.805.0010.00测定值/(μg·L-1)1.054.679.760.894.419.260.684.159.370.624.259.03回收率/(μg·L-1)96.187.894.891.885.191.085.083.093.777.5.85.090.3本底值/(μg·L-1)0.0420.000.00T0.00羊肚菌加标值/(μg·L-1)0.805.0010.000.805.0010.000.805.0010.000.805.0010.00测定值/(μg·L-1)0.724.129.350.664.098.960.714.978.860.744.018.79回收率/(μg·L-1)84.881.693.182.581.889.688.899.488.692.580.287.9
注:甲基汞、乙基汞、无机汞、苯基汞加标量(20 μL,0.25 mL,0.50 mL,1 mg/L)
用本实验建立的方法对标准物质GBW10029和Tort-3进行汞化合物测定,验证方法的准确性,结果见表5,标准物质平行样测定结果在标准值范围内,说明在本实验选定的实验条件下,研究选用的仪器条件和实验方法的准确度较高。
表5 标准物质中汞形态的测定结果 单位:mg/kg
Table 5 results of determination of Mercury speciation in reference materials
标准物质Hg2+metHgetHgphHg标准值测定值标准值测定值标准值测定值标准值测定值GBW10029无0.0140.84±0.030.82无ND无ND0.0120.81NDNDTort-3无0.0850.137±0.0120.129无ND无ND0.0870.141NDND
注:“ND”为未检测(下同)
应用本文建立的方法对黄牛肝菌、黑牛肝菌、松茸、青杠菌、黑松露、葱菌、鸡枞菌、羊肚菌、滑子菇、鸡菇、黑虎掌菌的干制样品进行测定(表6)。结果表明,汞的形态主要以无机汞(Hg2+)的形式存在,其中牛肝菌、青杠菌、松茸、鸡枞菌、黑虎掌菌含有少量甲基汞,乙基汞、苯基汞均为未检测。
表6 样品中不同价态汞的含量 单位:mg/kg
Table 6 Contents of different valence states of mercury in samples
样品名称汞形态Hg2+metHgetHgphHg黄牛肝菌0.760.12NDND松茸0.430.08NDND黑牛肝菌0.680.18NDND黑虎掌菌0.140.03NDND黑松露0.11NDNDND葱菌0.16NDNDND鸡枞菌0.210.04NDND羊肚菌0.05NDNDND鸡菇0.16NDNDND滑子菇0.11NDNDND青杠菌0.590.17NDND
注:ND为未检测
HPLC-ICP-MS联用技术分析测定不同汞形态是目前较为先进的检测技术。本文通过优化流动相的组成,较好地解决了汞测定时的富集效应和记忆效应。而由于干制食用菌样品的特殊性,通过比较微波萃取-酸提取、碱-甲醇溶液提取、超声辅助-酸提取3种不同的汞形态提取方法,最终选择了借助微波酸萃取的方法。建立了微波萃取结合HPLC-ICP-MS联用技术测定干制野生食用菌中汞形态的方法,在12 min内实现了甲基汞、乙基汞、无机汞、苯基汞4种汞的形态分离。根据建立的方法和优化的条件,以牛肝菌、松茸、羊肚菌3种基质样品进行加标回收实验,四种汞形态的加标回收率分别为81.6%~117.5%,81.8%~93.6%,83.0%~99.4%,77.5%~92.5%,采用标准物质GBW10029和Tort-3验证了方法的准确性,满足分析,方法定量限分别为0.009、0.024、0.018、0.024 mg/kg,精密度良好。此方法前处理简单、样品提取效率高,分离效果好,准确度高,适用于干制食用菌中汞形态的定量分析,为食用菌中汞形态测定分析研究提供了一种方法依据。
[1] 王贤波,刘军波,余霞奎,等.微波萃取液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用测定水产品中甲基汞、乙基汞和无机汞[J].安徽农业科学, 2014( 8) :2 438-2 440.
[2] 刘娜,张兰英,杜连柱.高效液相色谱电感耦合等离子体质谱法测定汞3种形态[J].分析化学,2005,33(8):1 116-1 119.
[3] 刘丽萍,吕超,王颖.液相色谱-电感耦合等离子质谱联用技术测定水产品中汞化合物形态分析方法探讨[J].分析测试学报,2010,29(8):767-771.
[4] 张兰,陈玉红,王英峰,等. 微波辅助萃取-高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法联用测定生物样品中的汞形态[J].环境化学,2013,32(11): 2 219-2 222.
[5] 李妍,刘书娟,江冬青,等 .气相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术应用于水产品中汞形态分析[J] .分析化学,2008,6(6):793-798.
[6] 陈玉红,米健秋,张兰.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用测定环境水样中的二价汞、甲基汞、乙基汞与苯基汞[J]. 环境化学, 2011, 30(4): 893-896.
[7] GB 5009.17—2014 食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定 [S].北京:中国标准出版社,2014.
[8] 樊祥,张润何,刘博,等.高效液相色谱-原子荧光光谱法测定水产品中不同形态汞含[J].食品安全质量检测学报,2017,8(1) :76-81.
[9] LEOPOLD K, FOULKES M, WBRSFOLD P J. Methods for the determination and speciation of mercury in natural waters-A review [J]. Anal Chim Acta, 2010, 663(2): 127-138.
[10] 梅光明,郭远明,张小军,等. 浙江沿海海产品中汞形态分析测定与分布特征[J].食品科学, 2015, 36(24): 229-234.
[11] 祖文川,汪雨,李冰宁,等.ICP-MS相关联用技术在食品元素形态分析中的应用及进展[J].质谱学报,2013,34(4): 247-256.
[12] 毛永杨,杨桐,苏涛,等. 高效液相色谱-原子荧光光谱联用法测定牛肝菌中无机汞、甲基汞、乙基汞的不确定度评估[J].食品科学,2017,38(24): 272-276.
[13] KIM K H,KABIR E,JAHAN S A.A review on the distribution of Hg inthe environment and its human health impacts[J].Journal of Haz-Ardous Materials, 2016,306: 376-385.
[14] 刘庆阳,何滨,胡敬田,等. 高效液相色谱与原子荧光光谱联用分析海产品中的甲基汞[J].分析试验室,2009,28(5):41-44.
[15] BROMBACH C C, GAJDOSECHOVA Z, CHEN BIN, et al. Direct online HPLC-CV-AFS method for traces of methylmercury without derivatisation: A matrix.independent method for urine, sediment and biological tissue samples [J]. Anal Bioanal Chem, 2015, 407: 973-981.
[16] BATISTA B L,ODRIGUES J L,SOUZA S S D,et al. Mercury speciation in seafood samples by LC-ICP-MS with a rapid ultrasound-assisted extraction procedure: Application to the determination of mercury in Brazilian seafood samples[J].Food Chemical,2011,126(4) :2 000-2 004.
[17] 曹小丹,秦德元,郝伟,等.低压液相色谱-原子荧光快速测定鱼肉和土壤样品中的汞形态[J].分析化学,2017, 42 (7):1 033-1 038.
[18] SHAQ A Q, KAZI T G, BAIG J A, et al.Simultaneously determination of methyl and inorganic mercury in fish species by cold vapor generation atomic absorption spectrometry[J]. Food Chemistry,2012,134(4):2 345-2 349.