图1 酿酒酵母与非酿酒酵母生理特性比较
Fig.1 Comparison of physiological characteristics between S.cerevisiae and non-S.cerevisiae
果酒风味特性及其品质不仅受到水果种类和酿造工艺的影响，同时与所选择微生物的代谢活动密切相关。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)因其发酵力高[1]、耐受环境胁迫力强[2]，且菌种安全稳定[3]等优势，成为酿造果酒的最佳微生物，而且已经发展成为商用酿酒酵母。由于商用酿酒酵母菌的种类比较单一，形成的代谢产物相似，尤其是风味化合物，导致风味同质化现象严重，降低果酒的口感以及风味复杂度，影响果酒的潜在多样性，不能满足消费者的多样化需求[4]。此外，部分酿酒酵母会在发酵过程中生成有害代谢物如氨基甲酸乙酯，是酵母代谢产生的尿素与乙醇反应生成的致癌物质[5]。近年来，研究发现，非酿酒酵母(non-Saccharomyces cerevisiae)在果酒发酵过程中会形成更复杂的香气，达到增加果酒香气的效果，赋予果酒更复杂的香气特性，提高果酒品质。作为自然发酵的一种代替方案，非酿酒酵母与酿酒酵母的混合发酵已成功应用于改善果酒口感和风味特性，满足了消费者对于果酒多样化和多元化的需求[6-7]。混合酵母发酵方式逐渐成为果酒酿造领域的热点。本文对酿酒酵母和非酿酒酵母混合发酵果酒过程中的接种方式、两者间的相互作用、对果酒品质的影响、存在的问题等方面进行了综述，并对其未来进行了预测，以期为果酒混合酵母菌发酵体系的研究提供一定参考。
果酒发酵是一个复杂的过程，包括糖和氨基酸转化为乙醇、CO2和一系列次级挥发性代谢物。在果酒的混合菌种发酵初期可以检测到大量的非酿酒酵母，但是随着发酵的进行，发现非酿酒酵母逐渐衰亡[8]。这是因为非酿酒酵母的低酒精耐受性，使其不适应发酵中后期的高酒精浓度环境。非酿酒酵母主要包括假丝酵母属(Candida)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、毕赤酵母属(Pichia)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、德巴利酵母属(Debaryomyces)和克勒克酵母属(Kloeckera)等[9-10]。大多数非酿酒酵母发酵效率较低、对SO2和pH耐受性较低[11]，一直被认为是导致果酒风味败坏的主要原因[12]。近年来，大量研究显示，非酿酒酵母在果酒的酿造过程发挥着积极的作用，如可以生成更多的香气化合物，提高果酒的香气复杂性[13-14]；也可以生成一些有益化合物如具有抗氧化性的褪黑素，从而提高果酒的营养价值[15]。与酿酒酵母相比，非酿酒酵母胞外酶量更高，水解更多香气物质前体，释放更多的香气物质，从而提高果酒的香气复杂度[16-17]。与此同时，一些非酿酒酵母可以生成更多的酯类、高级醇、甘油等具有提高香气复杂性、降低酒精度以及丰富口感作用的代谢产物[18-19]。但大多数非酿酒酵母缺乏独自完成酒精发酵的能力，酿酒酵母和非酿酒酵母的混合发酵方式可以在提高果酒风味特性的同时完成果酒发酵过程[20]，逐渐成为发酵果酒强吸引力的解决方案(如图1)。非酿酒酵母(东方伊萨酵母)和酿酒酵母进行混合发酵，不仅可以大大减弱前者生成的醚的味道，还可以保留后者带来的花香、果香，提高果酒的品质[21]。因此，采用酿酒酵母和非酿酒酵母混合发酵方式，可以生成更多有益次级代谢产物，丰富果酒的口感和风味，从而显著提高果酒的质量和品质[22]。
图1 酿酒酵母与非酿酒酵母生理特性比较
Fig.1 Comparison of physiological characteristics between S.cerevisiae and non-S.cerevisiae
大部分非酿酒酵母缺乏独立完成酒精发酵的能力，只有在酿酒酵母的帮助下才能完成。同时，一些非酿酒酵母胞外酶(如糖苷酶、果胶酶等)含量更加丰富，水解更多香气物质前体，可以增加果酒的香气化合物[23]。因此将两种酵母菌的混合发酵应用到果酒酿造工艺中，生成更多的香气物质，或者两者的部分代谢物之间生成新的代谢物质，可以弥补彼此在香气上的不足[24]。在果酒混合发酵体系中，不同阶段的发酵液环境不同，酿酒酵母与非酿酒酵母对环境的适应能力不同[25]。所以若采用的接种方案不同，则酿酒酵母与非酿酒酵母之间的相互作用不同，从而以不同的方式提高果酒的香气复杂性。
果酒混合发酵体系酵母菌接种方案主要包括同时接种和顺序接种，两种接种方案均可以减弱由非酿酒酵母纯种发酵引起的不良风味并能保持两者的积极特性[26]。同时接种非酿酒酵母与酿酒酵母发酵果酒时，首先由非酿酒酵母进行代谢生成相关的代谢物，尤其是生成的β-葡萄糖苷酶，可以水解糖复合物前体中的糖苷键，释放更多的活性芳香化合物；然后由酿酒酵母主导完成发酵过程，从而提高果酒的品质[27-28]。但同时接种时，会出现非酿酒酵母过早死亡的现象，导致其对果酒香气的贡献有限[29]。
顺序接种又分为先接种酿酒酵母和后接种酿酒酵母两种类型，即2种酵母菌的接种时间及接种顺序均不相同。这2种顺序接种方式各有其优点，如酿酒酵母产生的异戊醇含量高于非酿酒酵母，先接种酿酒酵母，会降低异戊醇含量，减弱由异戊醇含量过高产生的指甲油味；相反，若是先接种非酿酒酵母，等其生长至对数期时接种酿酒酵母，生成的果酒拥有最丰富的香气物质。戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母顺序接种发酵，发现酒样中萜烯类、高级醇和酯类香气化合物等15种化合物含量升高[30]。与同时接种相比，顺序接种对营养物质的利用程度更高，不仅提高了果酒的品质，而且可以提高原料利用率。
综上所述，酿酒酵母和非酿酒酵母的混合发酵通过变换接种方式来改变发酵液中微生物类型及其生理活性，并作用于微生物的生长代谢，产生不同的香气物质，由这些香气物质之间的相互作用提高果酒的风味复杂性，进而提高果酒的品质。
在果酒的混合菌种发酵中，酿酒酵母可以作用于非酿酒酵母，并改变其部分特性[6]， 2种酵母菌之间的相互作用即为间接相互作用。在果酒混合酿造的过程中，会出现2种酵母菌的交替现象，研究结果发现，这种现象是由酵母菌间的代谢产物抑制、细胞接触抑制等相互作用造成的[31]。除此之外，酵母菌之间的相互作用还包括代谢物互作(累加效应、协同效应和负面效应)以及基因表达和酶活性的相互作用等[32](图2)。
图2 果酒混合酿造体系中酵母菌之间的相互作用[33]
Fig.2 Interactions between yeasts in the mixed brewing system of fruit wine
在酵母菌的生长过程中，氮源、水和维生素等营养物质缺一不可，混合发酵体系中，两种酵母菌之间会相互竞争营养物质[34]。若一种酵母菌对一种营养成分的吸收超过平均值之后，则会影响其他酵母菌对此成分的利用，从而影响其他酵母菌的生长，甚至导致其死亡。研究发现Hanseniaspora uvarum与酿酒酵母混合发酵时，会抢夺发酵液中的微量元素，导致后者的营养流失[35]。因此，部分酵母菌通过营养竞争作用于发酵过程中的微生物并改变其类型、生理活性，从而影响果酒的品质。PRIOR等[34]的研究表明，部分酿酒酵母与非酿酒酵母的氮源偏好以及氨基酸的吸收顺序不同，甚至在顺序接种时，先接种的非酿酒酵母可以提供一些含氮化合物和其他营养物质，被后接种的酿酒酵母所利用。
酿酒酵母在与非酿酒酵母的混合发酵过程中，会生成毒性代谢物、中长链脂肪酸等代谢产物，抑制非酿酒酵母菌的生长[31]；有些非酿酒酵母也会产生类似的代谢物质，对酿酒酵母的生长代谢产生影响，导致发酵过程中酵母菌的交替现象[36]。翟明昌等[37]用透析袋发酵法，证明了在混合发酵过程中，酿酒酵母会产生一些分子质量不同的代谢产物(10 kDa蛋白类物质)，正是这些物质诱导了克鲁维酵母的衰亡。与此同时，一些非酿酒酵母的部分代谢物质，如铁红梅氏酵母和葡萄汁有孢汉生酵母可以生成对酿酒酵母有益的氨基酸，促进酿酒酵母的生长[38]。在酿造果酒时，部分酵母细胞接触之后会导致致死因子的出现，从而对酵母菌株产生影响。如Torulaspora delbrueckii在与酿酒酵母接触之后衰亡，似乎是细胞间接触和可溶性致死分子释放的原因，但是这种作用的具体机制尚不清晰[32]。部分非酿酒酵母具有叠加效应，可将其与酿酒酵母对果酒发酵的积极或消极作用叠加，即通过两者间的协同作用发挥更大的影响。酿酒酵母和德尔布酵母两种酵母菌可以通过协同作用提高发酵制品中的琥珀酸、乙酸和必需氨基酸的产量[20]。HU等[39]也发现了一种有孢汉逊酵母，与酿酒酵母的协同反应可以增加中链脂肪酸乙酯的生成量。申静云等[40]研究葡萄汁有孢汉逊酵母(H. uvarum)与酿酒酵母DV10混合发酵，促进了萜烯类和酯类物质合成，其中乙酸苯乙酯提高14.6倍，增强了果酒黄油味和花果香。
综上所述，酵母菌之间的相互作用在很大程度上取决于酵母菌的种类。不同酵母菌之间的相互作用及其本身的发酵动力学均有显著差异[41]。果酒的混合菌种酿造工艺正是利用这些差异，选择不同的酵母菌株，通过它们之间的相互作用改变发酵过程中微生物的类型及其生理活性，从而生成不同的代谢产物，对果酒的品质产生不同的影响。
文献报道的关于酿酒酵母与非酿酒酵母相互作用的研究，许多是基于人工模拟果酒的自然发酵过程获得的。但参与果酒自然发酵过程的微生物较多，还存在一些未知微生物，可能与酵母菌之间存在相互作用。除此之外，混合发酵方式虽可以提高果酒的品质，但特定非酿酒酵母在混合发酵中可能会引起其与酿酒酵母的拮抗作用，积累一些不理想代谢物[42]；两种酵母菌的接种率不同也可以改变果酒的香气特性和酒精含量。所以非酿酒酵母种类、与酿酒酵母的接种比例和接种时机不当，则其与酿酒酵母的混合发酵会增加果酒的不稳定香气，甚至会引发果酒中的异味[39]。综上所述，虽然已经证实了非酿酒酵母在混菌发酵过程中的积极作用，并将其投入实践，也有研究发现了酵母菌之间相互作用的类型。但到目前为止，关于种水平上非酿酒酵母与酿酒酵母的具体作用类型，以及相互作用的分子机制，还未完全得知。并且对于已知相互作用的混菌发酵体系，未能实现酵母菌株之间的有效协调。同时，我们对非酿酒酵母的新陈代谢和生长繁殖的有限理解，仍然是妨碍充分开发利用非酿酒酵母的障碍。因此，应用酿酒酵母与非酿酒酵母混合菌种发酵果酒，需要结合现代发酵工程技术，将混合发酵体系进行系统优化。
大多数非酿酒酵母可以应用于共发酵体系，需要在分子水平上深度理解酿酒酵母和非酿酒酵母之间相互作用[43-44]。另一个重要点是菌株的特异性，因此必须开发新的高通量筛选方法，以便筛选出大量的菌株来适应特定的性状。最后，对于一些菌株，为了获得实用的商业化非酿酒酵母菌，主要的挑战是找到理想的保存条件，以获得活性干酵母或冻干菌株。近年来，关于酵母菌共培养体系研究越来越多，VAN RIJSWIJCK等[45]建立了不同酵母菌单独培养的动态模型，此模型可以用于预测酿酒酵母与非酿酒酵母共培养时的发酵性能，有望为果酒混合发酵体系提供指导。
果酒传统酿造工艺中普遍采用商业酿酒酵母发酵，但由此工艺生产出的果酒出现了风味同质化的现象。为了满足消费者的需求，人们对非酿酒酵母进行了研究，并将其应用到与酿酒酵母的混合发酵中，生产更高品质的果酒。全球气温的回升，造成酿酒葡萄的糖含量增高而酸度降低，在酿酒时需要选择低醇和增酸的菌种，来提高葡萄酒的品质。近年来，发现非酿酒酵母如伊萨酵母属、毕赤酵母属、有孢汉逊酵母属和德巴利酵母属，能够分泌丰富的糖苷酶类，将香气前体水解，增强品种香气，降低乙醇浓度和挥发酸浓度，萜烯类、高级醇和酯类香气化合物。同时发现同一属不同酵母株间，对葡萄酒香气影响存在差异，在酿酒时需要根据原料和产地选择合适的酿酒酵母和非酿酒酵母组合。但是，关于酿酒酵母和非酿酒酵母混合发酵果酒研究，大多集中在发酵工艺对果酒品质的影响，关于两种酵母菌之间相互作用尚不清晰。未来，结合现代微生物组学技术和大数据模拟计算等新型技术手段，有望揭示关于非酿酒酵母与酿酒酵母的交互作用及其作用机理。同时结合现代发酵工程技术，实现混合菌种发酵体系的理性调控，为创制新型多样化果酒奠定基础。
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