图1 9-氯甲酸芴甲酯与氨基酸反应式
Fig.1 Reaction formula of 9-chlorofluorene methyl ester and amino acid
牛磺酸可以作为人生命活动的润滑剂，参与人体内必要的生理活动，帮助人体维持和调节正常的生命状态[1-2]，尤其是在促进婴幼儿大脑和神经中枢系统的发育方面作用比较明显[3]，在增强钙的吸收和心血管功能方面也发挥了重要作用，是婴幼儿配方奶粉中重要的营养成分。
牛磺酸是一种在常温下呈无色、四面针状的晶体，微酸，易溶于水，难溶于乙醚、无水乙醇等有机溶剂。牛磺酸是一种含硫氨基酸，分子质量125.15，熔点300 ℃，稳定性强，具有一定的抗氧化能力，能够作为生化试剂和润滑剂被使用[4]。牛磺酸结构中存在氨基和磺酸基，在体内以酸碱两性离子存在，解离常数比蛋白氨基酸都小，具有较强的酸性。牛磺酸广泛存在于自然界中，尤其是在海洋生物体内大量存在，其在生物体内具有重要的作用，溶解后是小分子化合物，不容易通过细胞膜，没有抗原性[5]。
牛磺酸具有很强的生物学功能，它是以游离的方式大量存在于肌肉、心脏和大脑中，是重要的营养素[6-7]。人体自身只能合成较少量的牛磺酸，人类需要通过食物来补充足够的牛磺酸。目前，牛磺酸已被添加到食品中，比如保健食品和作用饮料，以此来提高食品的营养价值，尤其是在婴幼儿配方奶粉中，牛磺酸起到了促进大脑发育的重要功能[8-10]。在国标GB10765《食品安全国家标准婴儿配方食品》中明确规定牛磺酸的添加量上限值为3 mg/100kJ[11]。在欧盟《Commission Directive 2006/141/EC 婴儿配方食品和较大婴儿配方食品》和美国的《CFR Title 21-Part107婴儿配方食品》也有对牛磺酸的明确规定[12-13]。目前，国内外已报道了许多牛磺酸分析方法，但皆有各自的局限性。本文对牛磺酸的检测方法进行详尽阐述与分析，以期为相关从业人员提供一定的理论指导。
牛磺酸是一种极性化合物，当它在被检测的物质中时，并不以结合态的形式存在，一般用水作为提取试剂完全能够提取出样品中的牛磺酸，随即稀释即可。如果被检测的样品中含有太多的大分子蛋白质和一些其他的极性干扰物质，用水溶解样品则不能够完全溶解蛋白分子和极性物质，最终形成半乳状溶液，无法上机检测。奶粉样品中含有的大量蛋白质给牛磺酸的检测分析带来了困难，所以在分析检测前要去除样品中含有的蛋白质和极性物质[14]。含有蛋白质的样品可以使用有机溶剂沉淀法和固相萃取法来分离蛋白质。固相萃取通过固相色谱柱中的固定相保留样品中的牛磺酸，蛋白质流出，从而达到分离的目的。该方法虽然分离的效果好，但是萃取柱的成本高，分离过程较繁琐。有机溶剂沉淀法是一种利用与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低而沉淀的方法。有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因是加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低，从而增加了2个相反电荷基团之间的吸引力，促进蛋白质分子的聚集和沉淀，其成本较低、方便、快捷。
黄金凤等[15]在测定婴幼儿配方奶粉中牛磺酸时，利用亚铁氰化钾和乙酸锌作为蛋白沉淀剂沉淀蛋白质，回收率在87.5%～102.4%，检测效果良好。CHEN等[16]对比了乙腈、硫酸锌、亚铁氰化钾与乙酸锌的混合试剂沉淀婴幼儿配方奶粉，结果发现亚铁氰化钾与乙酸锌的混合试剂效果最好。牛磺酸不溶于乙腈，会随着蛋白质一同沉淀，硫酸锌在沉淀含糖量高的样品时，效果并不理想。还有学者利用其他试剂作为蛋白质沉淀剂，效果也很好。刘旭辉等[17]利用0.2%的盐酸和乙醇来沉淀婴幼儿配方奶粉中的蛋白质，结果发现回收率在99.6%～101.5%，准确而灵敏。综上所述，亚铁氰化钾，盐酸、乙醇、乙酸锌、乙腈等溶液能作为很好的蛋白质沉淀剂[18]。
现在大多数企业、检测机构都使用丹磺酰氯柱前衍生法或者是邻苯二甲醛柱后衍生高效液相色谱法。高效液相色谱丹磺酰氯柱前衍生法原理是牛磺酸在碱性条件下与丹磺酰氯衍生化反应。通过测定衍生物含量来测定牛磺酸含量。此方法在加入丹磺酰氯溶液后要室温避光反应2 h，衍生化反应时间较长，延长了整个检测过程的时间。邻苯二甲醛柱后衍生高效液相色谱法的原理是牛磺酸与邻苯二甲醛在碱性条件下生成具有强荧光的物质，通过测定衍生物含量来测定牛磺酸含量，离子交换柱为钠离子交换柱，该方法具有灵敏度高，定量准确等优点，但分离所需的钠离子交换柱价格昂贵，给测定方法的推广应用带来了困难。
近年来，衍生法在高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中的牛磺酸含量中得到了充分的应用，发展比较快。在采用高效液相色谱法的检测中，衍生化的目的是将可见强吸收的功能基团引入被检测的对象或是将其转变为荧光衍生物，来提高检测的灵敏度，提高对分析样品的分离和可选择性[19-20]。选择不同的衍生化试剂、C18色谱柱、柱前柱后衍生化方法已经成为牛磺酸的主要检测方法[21]。牛磺酸检测常用的柱前衍生化试剂有邻苯二甲醛、异硫氰酸苯酯、丹磺酰氯、9-氯甲酸芴甲酯等。其中，9-氯甲酸芴甲酯与氨基酸衍生反应如图1所示。
图1 9-氯甲酸芴甲酯与氨基酸反应式
Fig.1 Reaction formula of 9-chlorofluorene methyl ester and amino acid
王晓莺等[22]采用9-氯甲酸芴甲酯作为衍生试剂，与奶粉中的牛磺酸进行衍生化反应，利用反相高效液相色谱法测定奶粉中牛磺酸的含量。以甲醇-0.025 mol/L磷酸盐缓冲溶液为流动相(pH=8.0)，C18柱为分离柱，用二极管阵列检测器(265 nm)检测，相对标准偏差为3.38%，加标回收率为82.8%～96.7%，检出限为46 ng/mL[22]。异硫氰酸苯酯与氨基酸反应生成苯氨基硫代甲酰胺的衍生物如图2所示。
图2 异硫氰酸苯酯与氨基酸反应式
Fig.2 Reaction formula between phenyl isothiocyanate and amino acids
赵超敏等[23]采用异硫氰酸苯酯和三乙胺来进行衍生化，异硫氰酸苯酯和三乙胺在室温下衍生反应1 h，最后加入正己烷终止衍生化，利用外标法进行定量。检测结果显示回收率为90%～108%，相对标准偏差为1.16%～2.24%。该方法准确、可靠，能够满足牛磺酸含量的有效确定，特别适用于婴幼儿配方奶粉中牛磺酸含量的检测。YUAN等采用丹酰氯、9-氯甲酸芴甲酯和邻苯二甲醛3种不同的衍生化试剂测定婴幼儿配方奶粉中的牛磺酸，结果表明3种方法均适合检测婴幼儿配方奶粉中的牛磺酸，成本低、准确度高[24]。综上所述，高效液相色谱衍生化方法精确度和灵敏度较高，需要衍生化反应，耗时较长，操作复杂，该方法更适用于对微量、痕量牛磺酸的检测分析。
近年来，人们越来越重视检测分析方法的创新和效率，检测分析的速度、灵敏度以及仪器的自动化程度均已达到了一个较高的水平，氨基酸分析仪检测也发展成为一种具有广泛适应性的分析方法[25]。氨基酸分析仪不用柱前衍生，直接上样进行分析，操作步骤简单，是迄今氨基酸定性、定量分析中应用最广泛的方法之一[26]。蒲云月建立了一种用氨基酸自动分析仪测定婴幼儿配方奶粉中含硫氨基酸的的分析方法，利用氧化水解法来处理蛋白质，这种方法准确可靠、重现性好，分析样品花费时间少，比较适合大量常规样品和未知复杂样品中含硫氨基酸的分析检测[27]。刘常凯等将样品经0.01 mol/L盐酸溶液溶解，并用106 g/L亚铁氰化钾溶液和219 g/L乙酸锌沉淀蛋白质后，经过10 000 r/min离心10 min取出上清液，定容后，用氨基酸分析仪钠系统进行程序洗脱，LCA K06/Na色谱柱进行分离，茚三酮溶液衍生显色，在570 nm波长下测得牛磺酸色谱峰，用外标法定量，在牛磺酸质量浓度为5.544～110.880 μg/mL时有良好的线性关系(r=1.000 0)，回收率为101.47%，相对标准偏差为1.6%(n=9)[28]。
氨基酸分析仪法灵敏度与精确度比较高，重现性比较好，氨基酸分析仪检测法是最常用的方法，其自动化程度较高，适合大批量的常规样品的检测。但此方法的选择性较差，仪器设备也比较昂贵，给方法的推广带来难度。
液相色谱和质谱联用法测定牛磺酸时不需要衍生化，可直接测定[29]，根据牛磺酸极性和水溶性的特质，有大量报道显示，色谱和质谱联用技术已经用于牛磺酸的检测。陈稚等利用高效液相色谱与电喷雾电离质谱联用技术对婴幼儿配方奶粉中的牛磺酸进行分析，结果线性关系良好(r=0.999 6～0.999 9，最低定量限10 μg/L)，回收率为99.1%～101.7%[30]。牛磺酸在亲水体系中，水作为强洗脱溶液，有机溶剂具有弱洗脱强度，能起到增加有机相比例的作用，提高在质谱中的挥发性，改善分离度。ZHANG等建立了高效液相色谱-四极/静电场高分辨质谱法测定奶粉中牛磺酸的方法，并采用该方法的正离子模式分析和同位素内标法进行定量，结果表明，内标法测定牛磺酸线性关系为0.5～10 μg/L(r=0.999 8)，检测限为0.2 μg/kg，3个级别(2、5、10 μg/kg)牛磺酸的回收率从79.9%降至94.4%，相对标准偏差为4.7%～6.9%(n=5)[31]。该法准确、简便、快速，精密度、准确度、灵敏度均能满足婴幼儿配方奶粉中牛磺酸的测定要求。
液相色谱-质谱联用法不仅操作简单，检测时间也较其他方法大大缩短。CHEN等采用高效液相色谱-质谱联用技术直接测定婴幼儿配方奶粉中牛磺酸的含量，采用外标法定量，整个分析过程8 min即可完成，方法的回收率为72%～97%，相对标准偏差为2.16%～3.33%[32]，方法简便、快速、低基质效应、灵敏。
液相色谱质谱联用法检测奶粉中的牛磺酸能够达到欧盟及我国乳粉中牛磺酸的检测要求，其操作简单，精密度、灵敏度高，分离能力好，选择性高，样品无需衍生化，适用于对检测含量有严格要求的微量和痕量检测。
毛细管电泳法可以测定一些复杂生物基质中的牛磺酸，可用于检测婴幼儿配方奶粉中游离的牛磺酸，具有简单、高效、准确、成本低等特点，在氨基酸的分离和分析中得到较为广泛的应用，但应用于牛磺酸检测的报道较少。毛细管电泳法是根据氨基酸不同的电离方式基础上进行氨基酸分离[33]，虽然该方法具有分离效率高，试剂消耗少，不需要梯度洗脱的特点，但较少用于比较复杂生物基质中的牛磺酸测定[34]。KLAMPFL等采毛细管电泳-电喷雾质谱法测定婴幼儿食品中游离氨基酸，该方法的灵敏度和线性度足以在一次运行中分析所有感兴趣的溶质[35]。权菲菲研究表明，毛细管电泳是以毛细管为分离通道，高压直流电场为驱动力的液相分离技术，分离分析效率高，试剂和样品消耗少,它是发展较快的分离分析技术之一[36]。电容耦合非接触式电导检测利用缓冲液与样品之间的电导差别进行检测，比较适合分析检测光学吸收弱和无光学吸收的化合物。毛细管电泳-电容耦合非接触式电导检测法检测技术成功应用于毛细管电泳中，成为一种很有潜力的检测器[37]。
薄层色谱法操作便捷，不需要昂贵的仪器和特殊的试剂，适合在基层推广使用，样品牛磺酸经过离子交换柱，被提纯后经薄层色谱法定性、定量。此方法灵敏度低，因受到薄层厚度、薄层板制备、点样技术等条件难以保持恒定，定量的准确性不够稳定[38]。气相色谱法测定牛磺酸以及氨基酸已经得到了广泛应用，气相色谱法的准确度和灵敏度都较好，但样品在衍生化方面的要求较高，利用磺酸基生成挥发性的衍生物进行测定[38]。分光光度法准确度和灵敏度都低，设备廉价，操作方便快捷，但是试剂毒性大，只能检测出一种或一类氨基酸的总量，用于氨基酸的总量测定[39]。红外光谱分析法准确度和灵敏度都比较高，快速无损、环保无污染，但是需要结合统计学方法建立定量分析模型才能很好地应用[40]。
目前，能够检测婴幼儿配方奶粉中牛磺酸可行的方法有很多，主要方法比较如表1所示。
表1 婴幼儿配方奶粉中牛磺酸可行的检测方法
Table 1 A feasible method for the detection of taurine in infant formula
项目优点不足研究方向资料来源氨基酸分析仪检测方法分析周期短,适合快速检测,自动化,程序化方法选择性差,受到分析物的种类和数量限制程序改进[18]毛细管电泳检测方法适合氨基酸的手性分离,分离效率高无需梯度洗脱不适合生物基质发杂的牛磺酸检测检测器开发和利用[34]分光光度法设备廉价、操作快捷灵敏度、准确度低,只能检测出一类氨基酸的总量对检测物质的分离和抗干扰[39]红外光谱分析法准确度、灵敏度较高,快速,环保需要结合统计学方法建立定量分析模型新算法和模型建立[40]液相色谱检测方法灵敏度、准确度较高需要衍生化处理,衍生时间较长高灵敏度和特异性新的衍生化试剂的开发[41]液相色谱和质谱联用检测方法无需衍生化,灵敏度、准确度高仪器昂贵对色谱及质谱参数、样品提取时间、沉淀提取溶剂的优化[42]薄层色谱法操作简单,不需要特殊仪器和试剂灵敏度较低、准确度较低展开剂、点样技术的研究[43]
由表1可知，婴幼儿配方奶粉中牛磺酸可行的检测方法均有其特点及局限性。目前液相色谱检测方法适合检测少量样品，氨基酸分析仪检测方法适合单个种类的分析物，液相色谱和质谱联用检测方法适合测定大批量样品，毛细管电泳检测方法适合检测生物基质简单的样品，薄层色谱法适合不需要精准定量的样品，分光光度法适合检测某一类氨基酸总量的检测，红外光谱分析法适合测定不含水的样品，多用于定性分析。
牛磺酸在食品、医药等领域发挥着重要的作用，牛磺酸快速、安全的检测分析方法一直都是从业者研究的热点，尤其是对于婴幼儿配方奶粉中牛磺酸的检测，关乎婴幼儿的营养健康问题。氨基酸自动分析法已经成功应用于牛磺酸的检测分析，但仍存在一定局限性；液相色谱法是目前检测婴幼儿配方奶粉中牛磺酸实际应用最多的一种方法，主要受到衍生物的稳定性、分析时间、反应副产物等因素的影响，该方法需要在高灵敏度和特异性的新衍生化试剂开发方面做进一步的研究。随着新仪器、新技术的广泛应用，不需要衍生化、能直接对牛磺酸进行测定的液相色谱-质谱联用技术将成为婴幼儿配方奶粉中牛磺酸检测分析的主要方法，得到广泛的应用。
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