图1 不同硅素比例的大鲵皮明胶复合液外观照片
Fig.1 Photo of giant salamander skin gelatin incorporated with different level of silicon
大鲵(Andrias davidiauns)，俗称“娃娃鱼”，是世界上现存最大的两栖动物，素有“活化石”之称[1-2]。目前，大鲵人工养殖已在陕西汉中、湖南张家界、河南洛阳、贵州、四川、重庆等地实现了产业化，大鲵分割及深加工产品开发已经成为产业转型发展的必然要求[3-7]。大鲵全身是宝，其皮肤、皮肤分泌物、肌肉、骨骼含有很多生物活性物质，具有较高的营养和药用价值[8-10]。
明胶是一种通过胶原蛋白热变性、部分水解获得的高分子质量水溶性蛋白，被广泛应用于改善食品结构、提高食品保水性和稳定性[11-12]。近年来，有关明胶改性的研究较多，如通过向明胶溶液引入多酚类物质[13]、糖醇类物质[14]以及通过糖基化、磷酸化等手段[15-16]，可以获得特定性能的明胶衍生产物。大鲵皮肤厚实，胶质含量丰富，是胶原蛋白及明胶的潜在来源之一。前期研究表明[17-18]，大鲵皮明胶性能介于哺乳动物明胶和鱼皮明胶，具有较好的界面性质，然而改性处理可提升明胶部分功能特性，进而拓展其在工业中的应用范围[13-14]。
硅是维系人类健康重要的微量元素之一，甚至关系到人类起源和进化。水晶石经过1 700 ℃高温煅烧、浓缩抽提后，可获得水溶性硅素[19]。水溶性硅素在食品、化妆品领域已成为风靡东南亚的一款特殊功能产品，由于具有较强的渗透性、乳化性、抗氧化性和抗菌性能，硅素聚合物表面活性剂的研究越来越多[19-20]。研究表明，硅素在体内可与胶原蛋白发生作用，促进再生和稳定性，对于骨骼、皮肤发育具有重要影响[21-22]。然而，有关体外硅素与胶原蛋白、明胶之间的相互作用及其功能性质研究，尚未见相关报道。基于此，本研究向6.67%(质量分数)大鲵皮明胶溶液中，加入不同比例食品级硅素，探究含不同硅素的大鲵皮明胶pH值、色泽、凝胶强度、流变性、红外光谱以及乳化活性的变化，为明胶-硅素功能性复合液相关应用开发提供参考。
试验材料：大鲵皮明胶根据前期实验室提取流程制备[13]，冷冻干燥成粉末(粗蛋白含量 89%，Bloom 值216 g)，-20 ℃低温贮藏。
主要试剂：Umoplus食品级硅素浓缩液(含硅素9 000 mg/L)，日本大阪株式会社；十二烷基磺酸钠和KBr，生工生物工程(上海)有限公司。
MCR302型高级流变仪,奥地利安东帕公司；pHS-3C型精密pH计,上海雷磁仪器厂；NR145精密色差计 深圳三恩时科技有限公司；FA320413型电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；LGJ-10B型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司；CT3型质构仪,美国Brookfield公司；Avatar 360红外光谱仪，美国尼高力公司；Evolution 201型紫外可见分光光度计,美国Thermo公司。
1.3.1 含硅素的大鲵皮明胶复合液制备
精确吸取5 mL Umoplus 硅素浓缩液，稀释100倍备用(按照使用说明)。精确称取大鲵皮明胶，配成质量分数为6.67%的标准明胶溶液[12,14]，置于50 ℃恒温磁力搅拌水浴锅搅拌至完全溶解。将硅素稀释溶液分别加入至大鲵皮明胶溶液中，继续搅拌至体系完全混合均匀，制备得到含硅素稀释液分别为0%(对照)、10%、30%和50%的大鲵皮明胶-硅素复合液，50 ℃恒温磁力搅拌1 h，得到如图1所示各组复合液。
图1 不同硅素比例的大鲵皮明胶复合液外观照片
Fig.1 Photo of giant salamander skin gelatin incorporated with different level of silicon
1.3.2 复合液pH测定
各组样品pH值采用精密 pH 计测定，使用前经过两点校正后分别读取，每个样品平行测量 3 次，取平均值。
1.3.3 复合液色差测定
各组样品色差采用NR145精密色差仪测定，以D65为光源，以仪器白板为标准
测定各组复合膜液的亮度L*，红度a*和黄度值b*。每个样品平行测定5次，取平均值。
1.3.4 复合液凝胶强度测定
利用CT3质构仪压缩模式，测定各组样品的凝胶强度[13]。分别取各组样品液15 mL，置于20 mL小玻璃瓶，4 ℃冷藏过夜。参数设置如下：选用TA5探头，压缩距离10 mm，触发点负载5.0 g，测试前速度1.0 mm/s，测试后速度1.0 mm/s，数据频率10个/s。凝胶强度定义为探头压缩至目标距离的最大负载,g[13]。每组样品平行测定3次，取平均值。
1.3.5 复合液流变性测定
样品液流变学特性采用MCR302高级流变仪测定。仪器开机后，经初始化，选取直径40 mm锥板(2°)，取适量样品液置于样品台上，设置测试温度为25 ℃，在剪切速率范围0～100 s-1进行表观黏度测试。然后，在0.1～10 Hz频率下进行频率扫描，测定储能模量和损耗模量的变化。
1.3.6 复合液红外光谱测定
参考实验室前期方法[13]，将各组样品液冷冻干燥后，称取少量样品和 100 mg KBr 颗粒混合研磨、压片。采用红外光谱仪对冻干的各组样品进行红外光谱扫描，扫描范围为 4 000～400 cm-1扫描 32 次。
1.3.7 复合液乳化活性测定
采用乳化活性指数(emulsifying activity index，EAI)和乳化稳定性指数(emulsifying stability index,ESI)为指标，评价各组样品液的乳化活性，具体实验方法和EAI和ESI计算公式参考实验室前期文献[17-18]。
数据采用SPSS进行统计分析，结果以平均值±标准差(n≥3)表示，t检验进行差异显著性分析。数据图采用OriginPro 8.5进行绘制。
随着硅素比例的增加，复合溶液色泽逐渐变为淡乳白色。利用校正的精密色差计对各组复合溶的亮度值L*，红度值a*和黄度值b*进行测定，结果如表1所示。由表1可以看出，硅素添加量对明胶复合溶液色差值有一定的影响。大鲵皮明胶溶液中引入硅素后，L*值显著上升(P<0.05)，a*值和b*值呈现下降趋势，但是仅50%硅素的大鲵皮明胶组差异显著(P<0.05)。在茶多酚改性大鲵明胶的过程中，也导致了色差值发生变化[13]，本研究中可能是由于硅素溶液自身色泽以及硅素与明胶相互作用造成，这与外观照片结果基本一致。
向6.67%(质量分数)大鲵皮明胶溶液中，加入不同比例的硅素溶液，复合溶液的pH值变化结果如图2所示。
图2 硅素比例对大鲵皮明胶溶液pH的影响
Fig.2 Influence of silicon level on pH of giant salamander skin gelatin solution
注：不同小写字母代表各组间存在显著差异(P<0.05)
由图2可知，硅素对大鲵明胶溶液pH有一定影响。本试验配制的6.67%(质量分数)大鲵皮明胶溶液pH值为5.86，为弱酸性溶液。加入不同比例的硅素溶液后，大鲵皮明胶溶液的pH值呈现升高的趋势。添加10%、30%和50%(体积分数)硅素后，大鲵皮明胶溶液pH值分别为6.13，6.38和6.76。与未加硅素对照组(0%)相比，pH分别升高了4.61%，8.87%和15.36%(P<0.05)。究其原因可能是由于硅素溶液呈现弱酸性[20]，随着添加比例的增加导致大鲵皮明胶溶液pH值升高。
表1 硅素比例对明胶复合液色差的影响
Table 1 Color of composite liquids with different levels of silicon
硅素比列(体积分数)L*a*b*0%17.49±0.70d1.91±0.14a0.97±0.06a10%18.94±0.21c1.84.±0.07a0.91±0.05a30%20.67±0.42b1.81±0.04a0.88±0.07a50%24.28±0.30a1.40±0.10b0.82±0.06b
注：同一列不同小写字母代表各组间存在显著差异(P<0.05)
向6.67%(质量分数)大鲵皮明胶溶液中，加入不同比例的硅素溶液后，利用质构仪获得了复合溶液的圧缩曲线以及凝胶强度的变化，结果如图3所示。
①-硅素比例0%，凝胶强度(142.70±12.10) g；②-硅素比例10%，凝胶强度(70.16±4.2) g；③-硅素比例30%，凝胶强度
(37.85±2.31) g；④-硅素比例50%，凝胶强度(13.90±3.47) g
图3 硅素比例对大鲵皮明胶凝胶性质的影响
Fig.3 Influence of silicon level on the gel properties of giant salamander skin gelatin solution
由图3的压缩负载-时间曲线可看出，硅素对大鲵皮明胶凝胶性质有较大的影响。随着探头压缩的推进，负载逐渐增大直至凝胶破裂，将压缩过程中正向最大负载定义为凝胶强度。由图3可看出，6.67%(质量分数)大鲵皮明胶凝胶强度为142.70 g。加入10%、30%、50%不同比例(体积分数)硅素后，大鲵皮明胶凝胶强度分别下降了55.78%、74.25%和90.57%(P<0.05)。这可能是由于硅素的渗透及其与明胶功能基团发生相互作用，破坏了凝胶网络所致[20]。
向6.67%(质量分数)大鲵皮明胶溶液中，加入不同比例的硅素溶液后，利用流变仪研究了复合溶液的剪切流动性质、储能模量和损耗模量的变化规律，结果如图4所示。
A-表观黏度; B-储能模量; C-损耗模量
图4 硅素比例对大鲵皮明胶流变性的影响
Fig.4 Influence of silicon level on the rheological properties of giant salamander skin gelatin
由图4-A可知，随着剪切速率从0.1 s-1增加到100 s-1，以及随着硅素添加比例的增加，复合液表观黏度呈现出下降趋势，说明硅素的引入导致复合液流动性增强。各组复合液均呈现出了非牛顿流体的剪切稀变现象，是由于复合液中分子间的内摩擦力随着剪切速率的增加而减少所致[23-24]。图4-B和4-C动态流变频率扫描结果显示，大鲵皮明胶溶液引入不同比例硅素，对复合液储能模量和损耗模量产生了较大影响，各组复合液整体呈现出储能模量大于损耗模量。通常储能模量占主导时，说明聚合物呈现出一定类似固体的弹性行为，其流动性相对较弱，属于弱凝胶[24-25]。由图4-B和4-C可看出，随着向大鲵皮明胶溶液加入10%和30%硅素(体积分数)，复合液储能模量和损耗模量明显高于未添加组(0%)，而加入50%硅素后，储能模量和损耗模量明显低于未添加组和10%和30%复合液组。这说明加入10%和30%的硅素改善了大鲵皮明胶水凝胶的黏弹性质，而加入50%硅素会破坏大鲵皮明胶复合液水凝胶的黏弹性质。
红外光谱常用于反映蛋白质等生物大分子结构特征，本研究对含不同硅素比例的大鲵皮明胶复合液的红外光谱进行表征，结果如图5所示。由图5可看出，大鲵皮明胶引入不同比例硅素后，复合液红外光谱特征吸收峰发生了一定的变化。一般来说，明胶的酰胺A带吸收峰在3 400 cm-1左右，大部分是由O—H和N—H基团的伸缩振动产生，反映了基团间氢键相互作用强度。明胶的酰胺I带、II带和III带分别由C
O的伸缩振动、N—H 弯曲振动和C—H的伸缩振动引起，其吸收峰分别在1 640、1 550和1 240 cm-1左右[11, 14, 26]。
图5 硅素比例(体积分数)对大鲵皮明胶红外光谱的影响
Fig.5 Influence of silicon level on infrared spectra of giant salamander skin gelatin
表2显示了未添加硅素组(0%)和含不同比例硅素的复合液，红外光谱的酰胺A带、酰胺I带、II带和III带的特征吸收波数位置。由表2可知，6.67%(质量分数)大鲵皮明胶(含硅素0%)红外光谱的酰胺A带在3 420.01 cm-1处，添加10%、30%和50%(体积分数)水溶性硅素后，大鲵皮明胶复合液酰胺A带吸收峰分别为 3 415.00 cm-1、3 338.43 cm-1和3 315.73 cm-1，分别较未添加组吸收峰降低了6.01、85.58和105.28个波数。酰胺A带向低波数偏移，说明复合液中大鲵皮明胶与硅素发生氢键相互作用。随着硅素比例的增加，大鲵皮明胶复合液氢键作用逐渐增加[11, 13]。表2中大鲵皮明胶酰胺I带、II带分别在1 638.94 cm-1和1 560.73 cm-1处。添加不同比例硅素后，各组复合液酰胺I带有向高波数移动的趋势，分别从1 638.94 cm-1移动至1 681.41 cm-1处。而各组复合液酰胺II带呈现向低波数移动的趋势，分别从1 560.73 cm-1移动至1 538.54 cm-1处。各组复合液酰胺III带向高波数略有偏移，分别从1 236.64 cm-1移动至1 240.96 cm-1。酰胺I带和II带与CO和N—H振动相关，通常氢键作用较强时，会使酰胺I带和II带向低波数移动，这也反应出硅素-明胶相互作用导致复合液内部CO和N—H的氢键作用发生变化[11,14,18]。该结果与前人在明胶提取或者改性研究中，明胶红外光谱酰胺A带、I带、II带和III带吸收特征峰的变化基本类似[13,26]。
表2 复合液红外光谱特征吸收峰波数
Table 2 Wavenumber of the complex liquids
硅素比例(体积分数)吸收峰位置/cm-1酰胺A带酰胺I带酰胺II带酰胺III带0%3 421.011 638.941 560.731 236.6410%3 415.001 654.851 544.241 238.2030%3 338.431 655.251 544.901 239.2150%3 315.731 681.411 538.541 240.96
以乳化活性指数和乳化稳定性指数为指标，对含不同比例硅素的大鲵皮明胶溶液的乳化性质进行评价，结果如图6所示。由图6可以看出，大鲵皮明胶溶液(含硅素0%)的EAI和ESI分别为(11.06±0.22) m2/g和(66.05±3.11) min。当添加不同比例硅素后，大鲵皮明胶复合液的EAI和ESI值明显增加(P<0.05)，且存在剂量-效应依赖关系。与未加硅素组相比，加入10%、30%和50%(体积分数)硅素的大鲵皮明胶复合液EAI值分别提高了22.15%、49.28%和127.85%；ESI值分别提高了18.76%、62.65%和109.95%。本研究通过向大鲵皮明胶中引入不同比例硅素，复合液的EAI和ESI值都分别得到明显提高(P<0.05)，这说明二者结合可能发挥了一定的协同表面活性。究其原因，一方面是水产明胶作为一种生物分子聚合物具有较好的界面性质，表现出一定天然乳化剂的应用潜力[17,26-27]；另一方面是水溶性硅素本身也具有较强表面活性[19]，引入到大鲵明胶溶液后致使复合液的乳化活性指数和乳化稳定性得到了明显提高。
A-乳化活性指数；B-乳化稳定指数
图6 硅素添加量对大鲵皮明胶乳化活性的影响
Fig.6 Influence of silicon level on the emulsifying properties of giant salamander skin gelatin
注：柱上方不同小写字母代表组间存在显著差异(P<0.05)
添加不同比例硅素后，大鲵皮明胶溶液L*值和pH值显著升高(P<0.05)，而凝胶强度显著下降(P<0.05)。流变性分析表明，与未添加硅素相比，低剂量的硅素(10%～30%，体积分数)能提高大鲵皮明胶的储能模量和损耗模量，显示出较好的黏弹性质；而高剂量硅素会破坏大鲵皮明胶黏弹性质。引入不同比例硅素后大鲵皮明胶红外光谱酰胺A带、II带向低波数方向移动，而I带和 III带向高波数方向偏移，可能是硅素与明胶氨基酸侧链的氢键作用变化引起。大鲵皮明胶溶液加入不同比例硅素后，乳化活性指数和稳定性指数得到显著提高(P<0.05)。因此，大鲵皮明胶引入低剂量硅素后，复合液具有较好的理化性质和乳化活性，可作为功能性表面活性剂用于食品乳液中。
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