解冻剖割除内脏清洗鸢乌贼属于柔鱼科，鸢乌贼属，在我国南海中分部较广，资源量大，是南海最具有开发潜力的种类之一[1-2]。鸢乌贼营养丰富，蛋白质含量高，且富含铁、锌等人体不可缺少的微量元素[3]。鸢乌贼大部分以干制品的形式销售，虽然外形与鱿鱼相似，但其肉质偏硬，酸度较高，影响了食用口感，在市场上价格较低[4]。鸢乌贼是南海渔业捕捞的主要物种之一，解决鸢乌贼品质的瓶颈问题，是提高鸢乌贼价值的关键所在。
在对肉类性质的研究中，对牛肉等畜产品[5-7]的研究较成熟，对水产品的研究相对较少。目前已有对鱿鱼肉质的相关研究，如采用酶、磷酸盐或熏制加工改善鱿鱼的质地[8-11]，取得了一定的效果。但对水产品加工过程中原料预处理对肉质影响的研究较少。鸢乌贼与鱿鱼在蛋白质组成含量、结构上存在差异，目前针对鸢乌贼肌肉性质的研究尚未见报道。本实验将系统研究嫩化剂协同处理对鸢乌贼肌肉质构、蛋白降解及肌肉组织微观结构的影响，同时结合水分活度降低剂、酸碱调节剂系统研究肌肉改性处理对肌肉性质的影响，建立鸢乌贼预处理方法，为鸢乌贼的干制加工利用提供理论基础。
鸢乌贼南海水产研究所“南锋号”科考船捕捞于南海海域，捕捞后立即放入-20 ℃冷库冻结，低温保藏运回实验室，规格为(100±10) g/只。
CaCl2、丙二醇、丙三醇、山梨醇、蔗糖、NaHCO3、KCl、K2HPO4、KH2PO4、MgCl2，广州万拓科学仪器有限公司；胰蛋白酶(250 U/mg)，广州齐云生物科技公司；乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、叠氮化钠(NaN3)，上海麦克林生化科技有限公司；BCA试剂盒，南京建成生物工程研究所。
超声波清洗器(AS10200AT),天津奥特赛恩斯公司；质构仪(QTS 25) 天津市德盟科技有限公司； 精密pH计(Delta320),梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；高速冷冻离心机(3K30型),德国 Sigma 公司； 紫外分光光度计(UV2550),岛津企业管理(中国)有限公司；均质机(Ultra Turrax T25B型),德国 IKA 工业设备公司；酶标仪(Synergy H1),美国BioTek公司；扫描电镜(Zeiss ULTRA 55),德国蔡司公司。
1.3.1 鸢乌贼前处理工艺
前处理工艺主要包括以下步骤：
鸢乌贼解冻剖割除内脏清洗
1.3.2 嫩化处理的单因素实验
在前期预实验的基础上，影响嫩化效果的主要因素为超声处理时间、CaCl2溶液浓度、胰蛋白酶溶液浓度，采用这3个单因素变量进行鸢乌贼嫩化处理实验。在料液比为1∶2(g∶mL)的条件下，分别考察超声(功率300 W)处理时间(2、4、6、8、10 min)、CaCl2溶液质量浓度(4、8、12、16 g/L)，胰蛋白酶溶液(pH 7、温度37 ℃)浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L)对鸢乌贼肌肉嫩化效果的影响，以肌肉质构硬度、弹性为指标。
1.3.3 嫩化处理的正交试验优化
在以上单因素实验的基础上，为了达到更好的效果，将超声处理与CaCl2、胰蛋白酶结合对鸢乌贼进行嫩化效果研究，以质构硬度为指标，采用3因素3水平正交试验，试验设计见表1。
表1 正交试验设计
Table 1 Design of orthogonal experiment
水平因素超声时间(A)/minCaCl2(B)/(g·L-1)胰蛋白酶(C)/(g·L-1)1460.12670.23880.3
1.3.4 水分活度降低剂的筛选
将鸢乌贼以料液比1∶2(g∶mL)分别放入丙二醇、丙三醇、山梨醇、蔗糖溶液(10、20、30、40、50 g/L)中浸渍1 h，热泵35 ℃干燥10 h，以水分活度为指标，研究水分活度降低剂对干制品性质的影响。
1.3.5 酸碱调节剂处理条件优化
鸢乌贼在经过上述处理后，分别加入NaHCO3溶液(2、4、6、8、10 g/L)浸泡15 min，以pH值为指标，研究NaHCO3对肌肉酸度的影响。
1.3.6 指标测定
1.3.6.1 质构测定
将鸢乌贼样品切成2 cm×2 cm，采用质构仪的质构剖面分析方法，通过对样品的2次压迫进行测定。设置为触发力5 g，测试速度30 mm/min，压缩距离0.3 cm，记录鸢乌贼的硬度、弹性等质构参数，每组样品测定3个平行，求取平均值。
1.3.6.2 肌原纤维小片化指数(myofibril fragmentation index，MFI)
参考CULLER等[12]的方法，略作修改。准确称取2.0 g绞碎的鸢乌贼样品，加入20 mL缓冲液(0.1 mol/L KCl，18 mmol/L K2HPO4, 7 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L NaN3)，均质(10 000 r/min，2 min，4 ℃)后冷冻离心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)，取沉淀加入20 mL上述缓冲液，搅拌均匀后离心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)，取沉淀加入15 mL上述缓冲液搅拌均匀后，采用2层纱布过滤，得到肌原纤维蛋白溶液，测定蛋白浓度。用上述缓冲液调节蛋白质量浓度为0.5 mg/mL，在波长540 nm下测定吸光度，所得到的结果乘以200后即为MFI值。
1.3.6.3 肌肉表面微结构观察
将处理过的鸢乌贼样品用0.1%戊二醛缓冲液固定1 h，在0.2%四氧化锇固定液中固定10 min。之后用磷酸盐缓冲液清洗3次(10 min/次)，用梯度乙醇溶液(25%、50%、70%、80%、90%、100%，体积分数)脱水各10 min，最后用丙酮脱水10 min。用离子溅射器镀铂膜，用电子扫描显微镜放大500倍进行观察。
1.3.6.4 水分活度
称取一定质量的干制品剪碎后，采用水分活度测定仪测定。
1.3.6.5 复水率
称取一定质量的干制品(M1)放入 40 ℃的恒温水浴锅复水1 h，取出后用滤纸除去表面水分，称重(M2)，计算如公式(1)所示：
复水率
(1)
1.3.6.6 pH值
称取鸢乌贼样品5 g，加入蒸馏水50 mL，匀浆后过滤，用pH计测定滤液的pH值。
1.3.7 数据处理
采用Excel软件进行数据处理及作图。
2.1.1 超声处理对鸢乌贼肌肉性质的影响
超声波处理对鸢乌贼肌肉硬度和弹性的影响见图1。处理时间在0～6 min时，鸢乌贼肌肉硬度下降较快，尤其在初始的2 min内，硬度下降明显，表明一定强度和时间的超声波处理能降低鸢乌贼的硬度。处理时间在6～10 min时鸢乌贼硬度下降缓慢，可能是超声波对肌肉结构的破坏作用达到一定程度后不会再随时间的延长有明显的作用[13]。鸢乌贼肌肉的弹性在超声波处理6 min内有明显的增加，说明超声波对肌肉蛋白具有一定的降解作用，具有软化肌肉的效果[14-15]。
图1 超声波处理对鸢乌贼肌肉硬度、弹性的影响
Fig.1 Influence of ultrasonic wave on hardness and spring of squid
2.1.2 CaCl2处理对鸢乌贼肌肉性质的影响
CaCl2处理对鸢乌贼肌肉硬度和弹性的影响见图2。随着CaCl2浓度的增加，鸢乌贼肌肉的硬度先下降后上升，而弹性先上升后下降。CaCl2质量浓度在0～8 g/L时，硬度下降而弹性增加，这可能是Ca2+对钙蛋白酶的激活导致了蛋白质的降解[16-17]。之后随着CaCl2质量浓度的增加，肌肉硬度增大而弹性减小，可能是一定浓度的CaCl2破坏了肌肉的持水性，削弱了CaCl2对肌肉的软化作用，从而使肌肉硬度上升[18]。
图2 CaCl2处理对鸢乌贼肌肉硬度、弹性的影响
Fig.2 Influence of CaCl2 on hardness and spring of squid
2.1.3 胰蛋白酶处理对鸢乌贼肌肉性质的影响
胰蛋白酶处理对鸢乌贼肌肉硬度和弹性的影响见图3。少量的胰蛋白酶就能对鸢乌贼肌肉性质产生明显的影响。胰蛋白酶质量浓度在0～0.2 g/L时，鸢乌贼肌肉硬度明显下降，弹性上升，这是由于蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解作用引起的[19]。而胰蛋白酶浓度高于0.2 g/L后鸢乌贼肌肉硬度和弹性的变化较小，这是由于随着酶浓度的升高，分解作用达到定值，因此质构性质趋于稳定[20]。
图3 胰蛋白酶处理对鸢乌贼肌肉硬度、弹性的影响
Fig.3 Influence of trypsase on hardness and spring of squid
采用L9(33)正交试验研究超声波、CaCl2、胰蛋白酶对鸢乌贼肌肉性质的综合影响，试验结果见表2、表3。
表2 L9(33)正交试验结果
Table 2 The result of L9(33) orthogonal experiment
试验号超声时间(A)/minCaCl2质量浓度(B)/(g·L-1)胰蛋白酶质量浓度(C)/(g·L-1)硬度/g1460.1121.1±2.082470.2111.6±1.523480.3108.5±0.504660.2107.2±1.155670.3105.8±0.686680.1115.2±1.337860.3105.6±0.648870.1118.5±1.269880.2110.8±1.81K1113.733111.300118.267K2109.400111.967109.867K3111.633111.500106.633R4.3330.66711.634
表3 方差分析表
Table 3 Analysis of orthogonal experiment
因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性超声波时间28.17625.81919.000CaCl2质量浓度0.70220.14519.000胰蛋白酶质量浓度216.349244.68219.000*误差4.842
注：*表示模型具有显著性(F比>F临界值)
在单因素处理试验的基础上，以硬度为指标，设计3因素3水平正交试验，根据极差分析可以看出，3因素对鸢乌贼肌肉硬度的影响顺序为：胰蛋白酶>超声波>CaCl2；其中胰蛋白酶对试验结果的有显著影响。肌肉硬度结果表明，最适的处理工艺参数为A2B1C3，即超声波6 min，CaCl2质量浓度6 g/L，胰蛋白酶质量浓度0.3 g/L，所得肌肉硬度为(105.8±0.68)g，较对照样品降低26.9%，效果较好。
鸢乌贼经过肌肉嫩化处理后，肌原纤维小片化指数明显增加，与对照组相比提高了56.46%(图4)。肌原纤维小片化指数与肌原纤维蛋白的水解程度有关，其值越大表明肌原纤维内部结构的损坏越大。超声波的空化效应和蛋白酶的水解作用可使鸢乌贼肌原纤维断裂，破坏了肌原纤维的完整性，从而使肌原纤维小片化指数增加[14,21]。
图4 肌肉改性处理对鸢乌贼肌原纤维小片化指数的影响
Fig.4 Influence of muscle modification on MFI of squid
肌肉的微观结构包括肌原纤维的直径、密度、组织结构等。由肌肉微观结构图(图5)可以看出，嫩化处理前，肌原纤维排列整齐且较紧密。经过嫩化处理后，肌肉结构变松散，肌原纤维有断裂现象，主要是酶的水解作用和超声波对结构的破坏作用。此结果与蛋白酶降解鲈鱼、牛肉等的结果相符[22-23]。
a-嫩化处理前;b-嫩化处理后
图5 肌肉改性处理对鸢乌贼肌肉组织结构的影响
Fig.5 Influence of muscle modification on muscle structure of squid
NaHCO3可以用于调节肉类pH，通过浸泡、注射等方式使肉类的pH值升高。鸢乌贼肌肉pH值随NaHCO3浓度变化的结果如图6所示。鸢乌贼经过NaHCO3处理，pH呈逐渐上升至稳定的趋势。这是由于NaHCO3的弱碱性，其水溶液可以改变鸢乌贼的pH值。当NaHCO3质量浓度为6 g/L时，鸢乌贼肌肉的pH值在6.79左右，相对初始值有明显的升高，肌肉酸味有明显的脱除，且没有异味，效果较好。NaHCO3作为脱酸剂在金枪鱼、牛肉等鱼类、畜禽肌肉上的应用也有相似结果[16,24-25]。
图6 NaHCO3处理对鸢乌贼肌肉pH值的影响
Fig.6 Influence of NaHCO3 on pH of squid
水分活度降低剂对鸢乌贼水分活度的影响见图7。不加入水分活度降低剂时，鸢乌贼干制品的水分活度高于0.8，加入糖醇类添加剂后，鸢乌贼干制品的水分活度较对照有所下降，加入不同添加剂的干制品水分活度下降幅度不同。添加丙二醇、丙三醇的干制品水分活度随着浓度的增加而逐渐降低，添加蔗糖、山梨醇的干制品水分活度随浓度的增加呈先下降后略有上升的趋势。丙二醇的效果优于丙三醇，在浓度高于30 g/L时趋于平稳，水分活度值在0.64左右，在此条件下大多数霉菌和酵母菌的生长都会受到抑制，可显著延长产品的保存期[26-27]。醇类降低干制品水分活度的主要机理是与干制品中的脂肪和蛋白质结合后增加了基团的极性，把部分自由水转为束缚水从而降低了水分活度[28-29]。食品在干制过程中随着水分含量的降低会变得干硬，通过预处理降低干制品的水分活度可以在相对高一些的水分含量上保持干制品的品质。丙醇类在鱼类、虾类干制品中应用都有一定的效果[30-32]。
复水率是评价干制品品质的指标之一，可以指示食品干制过程结构和性质变化[32]。随着丙二醇、丙三醇浓度的增加，鸢乌贼干制品复水率呈增加的趋势，在质量浓度为50 g/L时略有下降，其中丙二醇的作用稍大于丙三醇，丙二醇在质量浓度为30 g/L时，鸢乌贼干制品的复水率由40.94%提高到53.64%。随着蔗糖和山梨醇浓度的增加，干制品的复水率呈波动增加的趋势，在质量浓度为50 g/L时也略有下降。
a-对水分活度的影响;b-对复水率的影响
图7 水分活度降低剂对鸢乌贼干制品水分活度和复水率的影响
Fig.7 Influence of water activity lowering agent on water activity and rehydration of dried squid
采用嫩化剂结合酸碱调节剂、水分活度降低剂对鸢乌贼进行肌肉改性处理。超声结合CaCl2、胰蛋白酶处理可降低肌肉硬度，最优条件为超声处理6 min结合6 g/L CaCl2和0.3 g/L胰蛋白酶溶液浸泡处理；采用6 g/L NaHCO3能有效改善肌肉的酸性；30 g/L丙二醇处理能明显降低干制品的水分活度。通过上述肌肉改性处理能够使鸢乌贼肌肉肌原纤维发生断裂，肌肉组织松散，肌肉纤维小片化指数明显提高，从而有效改进鸢乌贼肌肉质构特性，改善肌肉结构，降低酸度和水分活度，提高干制品的复水性。
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