水产品食物中毒主要由副溶血弧菌引起，给人们的健康带来严重威胁[1]，同时也给物联网趋势下的食品安全带来挑战[2]。因处理不当使不同类型的水产品发生细菌交叉污染，食用后有可能导致食物中毒[3]，急性发作、呕吐、腹痛、腹泻及水样便是主要临床表现[4]。副溶血弧菌在食品环境中受到多种抗生素压力而产生耐药性，如链霉素、氨苄青霉素和头孢类，长期处于该环境可产生大量的多重耐药菌株[5-6]。建立针对副溶血弧菌快速检测技术是预防及控制该菌的关键。
传统微生物培养法是检测食源性病原菌的“金标准”，但其耗时长(一般4～7 d)、程序繁杂、工作量较大，难以满足快速检测的实际需求。目前，检测副溶血弧菌的分子方法有常规PCR法[7-8]、实时荧光定量PCR[9-10]和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)等[11]。这些技术已得到广泛应用，但因仪器价格昂贵，难以开展现场检测。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种在恒温条件下使DNA大量扩增的新技术，其针对靶序列的6个特定区域，设计4条特异性引物，通过Bst DNA聚合酶的链置换和链延伸作用实现扩增[12]。与常规PCR和实时荧光定量PCR技术相比，LAMP具有更高的灵敏性和特异性，且不需要特殊仪器，能在1 h内获得足量目的DNA用于分析[13]。基于以上优势，LAMP适合现场快速检测病原菌。近年来，全球学者报道了用于检测副溶血弧菌的LAMP方法。YAMAZAKI等[14]于2008年以tlh基因为检测位点首次建立了副溶血弧菌的LAMP技术，最低检测限可达5.3×102 CFU/mL。后来建立了针对副溶血弧菌toxR基因的LAMP方法[15]。这些方法不能用于鉴别致病性菌株，于是建立了针对毒力基因tdh和trh的LAMP方法[16]。学者根据检测需要也建立了多重LAMP[16-17]、原位LAMP[18]、多重核酸内切酶限制实时LAMP[19]、LAMP-LFD(loop-mediated isothermal amplification-lateral flow dipstick)[20]和微流体LAMP[21]等技术。国内学者也建立了针对副溶血弧菌tlh[22-23]、tdh[24]、trh[24]、ompA[25]和toxR[26]等基因的LAMP技术。
近年来，通过副溶血弧菌比较基因组学的研究，发现一种新的分子遗传标记。CHIOU等[27]于2015年报道了副溶血弧菌的青霉素耐药性源于一种β内酰胺酶编码基因-17(class A carbenicillin-hydrolyzing β-lactamase family-17,blaCARB-17)，在GenBank的293株副溶血弧菌和91株食品分离株中均发现该基因。LI等[28]在2016年证明副溶血弧菌的blaCARB-17是一种高特异的遗传学标记，相对于tlh、atpA更为保守，特异性更高[29]，而针对tlh和atpA基因的PCR检测会出现假阳性[28]。本研究基于副溶血弧菌新的特异性靶点blaCARB-17建立并优化LAMP扩增体系和条件，探究其特异性、灵敏性和可靠性，以满足水产品现场高效快检的实际需要。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
菌株：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus ATCC17802)、志贺氏菌(Shigella B4)、大肠杆菌(Escherichia coli D5)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC26003)、沙门氏菌(Salmonella enteritidis 50041)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes 54001)由漳州海关综合技术服务中心微生物检测室惠赠，在生物科学与技术学院实验室保存。
主要试剂：Bst DNA聚合酶大片段、100 mmol/L MgSO4、6×Loading Buffer、Gel Stain(10 000×)核酸染料、dNTP、10×反应缓冲液、Trans®2K Plus Ⅱ DNA Marker，北京全式金生物科技有限公司；GK1071细菌基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)、SYBR Green I，上海捷瑞生物工程有限公司；TCBS培养基、3%氯化钠碱性蛋白胨水，青岛高科园海博生物技术有限公司；营养琼脂、LB培养基，北京陆桥技术股份有限公司。
主要仪器：UV超灵敏多功能成像仪(Amersham Imager 600)，美国通用电气公司；高速离心机(MIKRO120)，德国Hettich公司；立式压力蒸汽灭菌器(BXM-30R)、隔水式恒温培养箱(GSP-9050MBE)，上海博迅实业有限公司；超净工作台(SW-CJ-IFD)，苏州安泰空气技术有限公司；电泳仪(Power B)，北京凯元信瑞仪器有限公司；数显恒温水浴锅(HH-2)，常州国华电器有限公司；恒温振荡摇床(HQY-C)，金坛市鸿科仪器厂；超微量分光光度计(Nanodrop One)，基因有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA模板的制备
副溶血弧菌标准株ATCC17802划线于TCBS固体培养基上，37 ℃培养得到单菌落。挑取单菌落到3%氯化钠碱性蛋白胨水中，200 r/min振荡培养得到菌悬液。取1 mL菌悬液，以12 000 r/min离心2 min收集菌体，沉淀按照GK1071细菌基因组DNA快速提取试剂盒操作说明提取DNA，-20 ℃保存备用。
1.2.2 引物设计与合成
选择副溶血弧菌blaCARB-17基因为目标序列，用Primer Explorer V4软件(http://primerexplore-r.jp/e/)，在线设计LAMP的内引物FIP、BIP和外引物F3、B3，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。tlh基因引物参考文献[7]设计，扩增片段长度约为450 bp。引物序列见表1。
表1 引物序列
Table 1 The primer sequences
方法引物引物序列(5’-3’)LAMPblaCARB-17-F3GCACACAGCTGAAAATCTGGblaCARB-17-B3TGATTTGCGCGATCAGTTGAblaCARB-17-FIPGAGCGGTCTGCAATCGACCAAGTATCGGATTCGCTCATGCblaCARB-17-BIPAGCGCGATGATCTGGAAAGACAAAGCGAAAGGTCGGTGTCPCRL-tlhAAGCGGATT ATGCAGAAGCAR-tlhGCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC
1.3 扩增反应体系
1.3.1 LAMP扩增体系
反应体系(25 μL)：50 mmol/L MgSO4(2.4 μL)，10 mmol/L dNTPs (3.6 μL)，10×反应缓冲液(2.5 μL)，10 μmol/L F3和B3(各0.5 μL)，10 μmol/L FIP和BIP (各4 μL)，DNA模板(1 μL)，8 U/μL Bst DNA聚合酶(1 μL)，无菌双蒸水(ddH2O)补足25 μL，混匀。在63 ℃水浴锅中反应60 min，80 ℃、20 min酶灭活结束反应。取4 μL产物在质量浓度20 g/L琼脂糖凝胶上电泳检测，同时加1 μL SYBR Green Ⅰ(1 000×)至反应管中肉眼观察颜色变化。
1.3.2 PCR扩增体系
反应体系(25 μL)：2×Power Taq PCR Master Mix预混液(12.5 μL)，L-tlh和R-tlh引物(各1 μL)，副溶血弧菌DNA模板(3 μL)，用ddH2O补齐25 μL。扩增程序：94 ℃、3 min预变性；94 ℃变性60 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，25次循环；72 ℃延伸10 min。取5 μL产物在质量浓度15 g/L琼脂糖凝胶上电泳分析。
1.4 LAMP体系的优化
对Bst DNA聚合酶量、内外引物浓度比、dNTPs浓度、Mg2+浓度、反应温度和反应时间分别进行优化，参数设计见表2。对某一条件优化时，其他参数按照1.3.1小节进行。
表2 LAMP体系中参数优化的试验设计
Table 2 Design of parameter optimization in LAMP system
反应条件优化参数设定(递减顺序)Bst DNA酶用量/U8、6.4、4.8、3.2、1.6、0内外引物浓度比12∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1dNTPs浓度/(mmol·L-1)1.76、1.6、1.44、1.28、1.12、0.96、0.8、0.64Mg2+浓度(mmol·L-1)7.2、6.0、4.8、3.6、2.4、1.2反应温度/℃67、65、63、61、59、57反应时间/min70、60、50、40、30、20
1.5 特异性试验
以单核细胞增生李斯特菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌作为对照，先分别得到液体培养物，用试剂盒提取各自基因组DNA，然后各取1 μL DNA模板加入已优化的LAMP反应体系进行检测，分析LAMP检测副溶血弧菌的特异性。
1.6 灵敏性试验
将副溶血弧菌ATCC17802按照1.2.1小节的方法制备基因组DNA模板，然后用Nanodrop超微量分光光度计测定其初始浓度，倍比稀释得到不同浓度的DNA模板。分别取1 μL模板溶液加入已优化的反应体系进行LAMP扩增，电泳与SYBR Green Ⅰ染料分析，确定其灵敏度。
1.7 人工污染模拟试验
将副溶血弧菌ATCC17802液体扩大培养，利用平板计数法调整菌悬液浓度为1×107 CFU/mL，并进行10倍梯度稀释，使菌悬液浓度为1～1×107 CFU/mL，取1 mL菌液分别均匀涂布于新鲜虾样品表面，室温放置4 h后，用1 mL ddH2O冲洗回收菌液，用1.2.1小节的方法提取基因组DNA。各取1 μL DNA模板加入已优化的反应体系进行LAMP扩增，得出人工污染样品的检测限。
1.8 实际样品检测
采集水产市场新鲜花蛤、牡蛎和虾样品共144份，通过国标方法分离鉴定副溶血弧菌，并用常规PCR技术检测分离株的tlh基因。对阳性样品用无菌ddH2O回收菌体，提取基因组后用优化的LAMP技术进行检测，分析其可靠性。
2 结果与分析
2.1 LAMP体系的建立
本试验针对副溶血弧菌blaCARB-17基因设计一套特异性引物进行LAMP扩增。图1-a所示为电泳检测结果，阴性对照的扩增产物未显示阶梯状条带，副溶血弧菌ATCC17802的DNA扩增产物显示阶梯状条带；图1-b所示为SYBR Green Ⅰ染色检测结果，副溶血弧菌ATCC17802的DNA扩增产物变荧光绿，阴性对照管为橘黄色。结果表明，建立的LAMP体系能正确扩增目的基因，用于检测副溶血弧菌。
a-LAMP产物电泳检测；b-LAMP产物SYBR Green Ⅰ染色检测；
M-Trans®2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-阴性对照；2-副溶血弧菌
ATCC17802标准株基因组
图1 副溶血弧菌ATCC17802标准株LAMP结果
Fig.1 Results of LAMP detection of Vibrio parahaemolyticus
standard strain ATCC17802
2.2 LAMP各主要参数的优化
2.2.1 优化Mg2+浓度
本实验对LAMP反应体系中1.2～7.2 mmol/L递增浓度的Mg2+进行了考察。如图2-a所示，阴性对照和浓度为1.2 mmol/L的Mg2+没有阶梯状条带产生；其余的反应管均显示阶梯状条带，电泳条带清晰度和亮度最佳的Mg2+浓度为2.4 mmol/L。如图2-b所示，橘黄对应的为阴性对照管和Mg2+浓度为1.2 mmol/L的反应液，其余反应液均为荧光绿。图2-b中的样品6和7颜色稍深，与图2-a中对应的电泳结果一致。因为Bst DNA酶是一种Mg2+依赖性聚合酶，适量Mg2+浓度可促进酶的反应活性。由图2可见，Mg2+浓度为2.4 mmol/L时扩增产物量最多，随其浓度升高，DNA量反而下降。结果表明,25 μL体系中50 mmol/L MgSO4溶液最佳添加量为1.2 μL，即浓度为2.4 mmol/L，比胡元庆等[22]研究的3.6 mmol/L Mg2+浓度略低，比纪懿芳等[23]研究的4.0 mmol/L Mg2+浓度也低。
a-Mg2+浓度对LAMP影响的电泳结果；b-Mg2+浓度对
LAMP影响的SYBR Green Ⅰ染色结果；M-Trans®2K Plus Ⅱ
DNA Marker；1-阴性对照；2～7-体系中Mg2+浓度分别为1.2、
2.4、3.6、4.8、6.0、7.2 mmol/L
图2 Mg2+浓度对LAMP反应的影响
Fig.2 Effect of Mg2+ concentration on LAMP reaction
2.2.2 优化dNTPs浓度
dNTPs是LAMP扩增产生DNA链的原料，其浓度与反应的效率密切相关，决定产物的最终合成量。本实验对LAMP反应体系中0.64～1.76 mmol/L递增浓度的dNTPs进行考察。由图3-a可知，除了阴性对照管无阶梯状条带，其余所有浓度dNTPs均产生了阶梯状条带；最清晰的dNTPs浓度为0.96 mmol/L。SYBR Green Ⅰ检测结果如图3-b所示，橘黄色对应阴性对照反应管，荧光绿为所有实验组反应管。
a-dNTPs浓度对LAMP影响的电泳结果；b-dNTPs浓度对LAMP
影响的SYBR Green Ⅰ染色结果；M-Trans®2K Plus Ⅱ DNA Marker；
1-阴性对照；2～9-体系中dNTPs浓度分别为0.64、0.8、
0.96、1.12、1.28、1.44、1.6和1.76 mmol/L
图3 dNTPs浓度对LAMP反应的影响
Fig.3 Effect of dNTPs concentration on LAMP reaction
由于dNTP能与游离的Mg2+结合，在LAMP体系中过量时可以间接影响Bst DNA酶的活性。所以图3-a中样品8的dNTP浓度为1.6 mmol/L，DNA合成量明显下降。综上所述，0.96 mmol/L的dNTPs为25 μL体系中的最佳浓度，与胡元庆等[22]筛选的最佳dNTPs条件一致，但比纪懿芳等[23]研究的3.5 mmol/L dNTPs浓度低很多。
2.2.3 优化Bst DNA聚合酶量
Bst DNA聚合酶是LAMP反应的催化剂，可直接影响扩增效率。本实验考察了Bst DNA聚合酶用量对LAMP反应的影响。如图4-a所示，酶的用量为0和1.6 U时无阶梯状条带出现；3.2 U时开始产生阶梯状条带，4.8 U时产生最清晰条带，继续增加酶用量至6.4 U产物量无显著增加，当达到8 U时产物量反而下降。分析原因可能是高浓度的酶量会增加引物多聚体之间发生错配的几率，影响LAMP扩增的效率。如图4-b所示，橘黄色对应阴性对照管和Bst DNA聚合酶量为0和1.6 U时反应管，其余反应液均为绿色，而样品7颜色稍深，与高酶量时扩增效率下降有关。另外Bst DNA聚合酶用量直接决定检测成本。综上所述，4.8 U为25 μL体系中Bst DNA聚合酶(8 U/μL)的最佳用量，与胡元庆等[22]筛选的最佳酶量条件一致。
a-Bst DNA聚合酶用量对LAMP影响的电泳结果；b-Bst DNA聚合酶
用量对LAMP影响的SYBR Green Ⅰ染色结果；M-Trans®2K Plus Ⅱ DNA
Marker；1-阴性对照；2～7-体系中Bst DNA聚合酶量分别为0、
1.6、3.2、4.8、6.4和8 U
图4 Bst DNA聚合酶量对LAMP反应的影响
Fig.4 Effect of the amount of Bst DNA polymerase
on LAMP reaction
2.2.4 优化内外引物浓度比
内外引物浓度比是影响LAMP反应特异性的重要条件。本实验考察内外引物浓度比对LAMP反应的影响。如图5-a所示，所有浓度比都出现阶梯状条带，当内外引物浓度比为8∶1时，阶梯状最清晰，继续增加引物比DNA产量略有下降。如图5-b所示，橘黄色对应阴性对照管反应液，荧光绿色为实验组反应液。LAMP反应中内引物不断被消耗，而外引物量不会减少，所以内外引物比越来越小，会抑制内引物与靶序列配对，导致反应不彻底。综上所述,内外引物浓度比8∶1为25 μL体系中最佳条件，与胡元庆等[22]和纪懿芳等[23]筛选的最佳引物比均一致。
a-内外引物浓度比对LAMP影响的电泳结果；b-内外引物浓度比对
LAMP影响的SYBR Green Ⅰ染色结果；M-Trans®2K Plus Ⅱ DNA
Marker；1-阴性对照；2～6-体系中内外引物浓度比分别为
4∶1、6∶1、8∶1、10∶1和12∶1
图5 内外引物浓度比对LAMP反应的影响
Fig.5 Effect of the ratio of primer concentration on LAMP reaction
2.2.5 优化反应时间
LAMP相对于PCR扩增技术而言，没有升温和降温的过程，所以显著节省了反应时间。本实验考察反应时间对LAMP反应的影响。由图6-a可知，清晰的阶梯状条带开始产生的反应时长为40 min；反应时间最短，产生亮度和清晰度最佳的阶梯状条带的时长为60 min。如图6-b所示，橘黄色为阴性对照管反应液，其余反应液为荧光绿色。从时间优化的结果分析，到达60 min时扩增基本进入平台期，时间继续延长并不能显著增加DNA的产量，本着节约时间提高效率的原则，选择60 min作为最佳条件，与胡元庆等[22]和纪懿芳等[23]筛选的最佳反应时间均一致。
a-反应时间对LAMP影响的电泳结果；b-反应时间对LAMP
影响的SYBR Green Ⅰ染色结果；M-Trans®2K Plus Ⅱ DNA Marker；
1-阴性对照；2～7-体系中反应时间分别为20、30、40、50、60和70 min
图6 反应时间对LAMP反应的影响
Fig.6 Effect of reaction time on LAMP
2.2.6 优化反应温度
LAMP是一种酶促反应，温度是控制酶活性的关键因素。本实验考察温度对LAMP反应的影响。由图7-a可知，在57～67 ℃时均有阶梯状条带产生，当反应温度为65 ℃时扩增条带最清晰，温度达到67 ℃时DNA产量略有下降。如图7-b所示，橘黄色为阴性对照管反应液，其余反应液为荧光绿。Bst DNA聚合酶最适反应温度是60～65 ℃，在此条件下酶兼具双链解离与新链延伸的双重活性，温度过高可导致引物无法与目的片段有效结合而影响扩增效率，温度过低可使引物之间形成多聚体或者错配，出现假阳性结果。结果表明，65 ℃为25 μL体系中最佳反应温度，比胡元庆等[22]筛选的最佳反应温度63 ℃稍高，与纪懿芳等[23]研究的最佳反应温度一致。
a-反应温度对LAMP影响的电泳结果；b-反应温度对LAMP
影响的SYBR Green I染色结果；M-Trans®2K Plus Ⅱ DNA Marker；
1-阴性对照；2～7-体系中反应时间分别为57、59、61、63、65和67 ℃
图7 反应温度对LAMP反应的影响
Fig.7 Effect of reaction temperature on LAMP
2.3 特异性结果
特异性是评价LAMP反应可靠性的重要指标。结果如图8-a所示，阶梯状条带产生的为副溶血弧菌标准菌株ATCC17802，其余5株非副溶血弧菌均未出现阶梯状条带。如图8-b所示，用SYBR Green Ⅰ检测，反应液荧光绿的为溶血弧菌标准菌株基因组，其余5株非副溶血弧菌反应液为橘黄色。影响LAMP特异性的因素很多，其中引物序列、内外引物比和Bst DNA聚合酶用量直接影响特异性，而Mg2+浓度、dNTPs浓度、反应时间和温度则间接影响特异性。本实验对以上各因素确定了最佳条件后，用5种常见的食源性病原菌作对照分析LAMP方法检测副溶血弧菌的特异性，为实际应用于食品安全检测奠定基础。结果表明，用新的靶基因blaCARB-17建立的LAMP方法具有很好的特异性。
a-特异性实验的电泳结果；b-特异性实验的SYBR Green Ⅰ染色结果；
M-Trans®2K Plus Ⅱ DNA Marker；1，7-副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus
ATCC17802)；2～6-分别是大肠杆菌(Escherichia coli D5)、金黄色葡萄
球菌(Staphylococcus aureus CMCC26003)、沙门氏菌(Salmonella
enteritidis 50041)、志贺氏菌(Shigella B4)、单核细胞
增生李斯特菌(Listeria monocytogenes 54001)
图8 LAMP的特异性结果
Fig.8 Results of LAMP specificity
2.4 灵敏性结果
LAMP反应的灵敏性是评价其实效性的一项重要指标。本实验用试剂盒提取了副溶血弧菌ATCC17802基因组，梯度稀释后作为LAMP反应的模板分析其灵敏性。由图9-a可知，当基因组DNA质量浓度为3.64×102ng/μL时，电泳图显示有梯状条带，质量浓度继续降低,条带消失。SYBR Green I检测结果如图9-b所示，基因组质量浓度为3.64×102 ng/μL时反应管显示绿色，质量浓度继续降低绿色变淡。综合电泳和染料显色结果：本实验所建立的LAMP方法的最低检测限为3.64×102 ng/μL，比纪懿芳等[23]研究的最低检测限高。
a-灵敏性实验的电泳结果；b-灵敏性实验的SYBR Green Ⅰ
染色结果；M-Trans®2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-阴性对照；
2～11-副溶血弧菌ATCC17802的DNA质量浓度依次为4.66×104、
2.33×104、1.17×104、5.82×103、2.91×103、1.46×103、
7.28×102、3.64×102、1.82×102和9.09×101 ng/μL
图9 LAMP的灵敏性结果
Fig.9 Results of LAMP sensitivity
2.5 人工污染虾样品LAMP结果
副溶血弧菌ATCC17802的菌液梯度稀释后，涂于新鲜虾体表进行污染模拟。如图10-a所示，所有污染菌液的样品均有阶梯状条带出现，阴性对照未出现阶梯状；用SYBR Green I染色检测的结果如图10-b所示，除了阴性对照管所有反应管变为绿色。
a-LAMP检测人工污染虾样品电泳结果；b-LAMP检测人工污染虾样品
的SYBR Green Ⅰ染色结果；M-Trans®2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-阴性
对照；2～8-副溶血弧菌ATCC17802的菌液浓度依次为1×107、
1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×101 CFU/mL
图10 人工污染虾样品的LAMP结果
Fig.10 Results of LAMP for detecting experimentally
inoculated shrimp samples
结果表明：人工污染模拟实验得到最低检测限为10 CFU/mL，略高于胡元庆等[22]报道的1 CFU/mL，比纪懿芳等[23]的模拟实验中最低检测限2.8×102 CFU/mL略低。
2.6 实际样品检测结果
用针对tlh基因的PCR技术在450 bp处出现单条带(图略)，鉴定副溶血弧菌分离株共33株；对33个阳性样品(编号2～34)进行LAMP检测，实验结果均为阶梯状条带，如图11-a所示；用SYBR Green I检测结果如图11-b所示，反应液(编号2～34)均显示荧光绿色。以上结果表明，建立的LAMP与tlh基因的PCR方法符合率100%。
a-LAMP检测实际样品实验的电泳结果；b-LAMP检测实际样品实验的SYBR Green Ⅰ染色结果；
M-Trans®2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-阴性对照；2～34-实际样品
图11 LAMP检测实际样品结果
Fig.11 Results of LAMP for detecting aquatic products
3 讨论
副溶血弧菌是河口和海洋环境的常驻菌，目前已成为水产食源性人类肠炎的主要病原[1]。该菌每年导致全球约50%-70%的腹泻型肠炎病例，且引发的食物中毒事件越发频繁[5]。从各种水产品的生产环境都能分离到该菌，且对链霉素、头孢类和氨苄等抗生素表现高度耐药性[3]。沿海地区的多重耐药性在各种抗生素压力环境中不断演化[5]。副溶血弧菌对食品安全的威胁包括食物中毒、环境带菌和多重耐药3个方面。为防控该菌的传播及变异，快速检测是最有效的手段。
LAMP技术具有简便、快速、易操作、不需要特殊扩增设备等优点[12]。LAMP没有常规PCR的升温和降温循环，在恒温箱或水浴锅中63～65 ℃反应约30～60 min即得足量产物，更适合现场即时检测[14]。分子诊断技术需要纯化的DNA为模板，制备高纯度DNA既耗时又费钱，而LAMP可用粗提的DNA为模板。LAMP在结果分析方面有明显优势，可用多种技术检测产物，包括琼脂糖凝胶电泳、肉眼可视化观察、使用浊度计[29]。
本文对影响LAMP特异性与灵敏性的主要条件逐一进行了优化。其中Bst DNA聚合酶用量、Mg2+浓度和反应温度通过影响Bst DNA聚合酶的活性而作用于催化反应，是LAMP的关键条件。Bst DNA酶是LAMP反应中的重要因素，适当酶量可以保证反应顺利进行，高浓度会使引物形成多聚体而降低反应效率[12]。Mg2+可对Bst DNA聚合酶的活性产生影响，高浓度的Mg2+不仅增加反应的成本，还会导致体系的不稳定[23]。LAMP反应中Mg2+浓度有一个最佳条件，过多或过少都可能没有结果。温度是通过控制酶活性而影响LAMP反应[15]，温度过高会使引物与目的片段结合效率降低，温度过低可使引物形成多聚体而出现假阳性。内引物在LAMP反应中是决定因素，率先与靶序列互补配对，在Bst DNA聚合酶作用下启动链延伸[12]。而外引物遵循自由碰撞理论与靶序列配对，高浓度能提升其锚定靶基因的效率，为内引物的延伸提供骨架。适当浓度的dNTPs是扩增反应的原料保障，实验中不宜过量，因为低浓度的dNTP可减少非靶位启动和延伸时的核苷酸错误掺入[23]。LAMP相对于常规PCR和定量PCR技术的最大优势是省时高效，一般反应在60 min内完成，借助染料或与流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)技术联用可在1 h内得到结果。为确定新建立LAMP方法的可靠性，我们用新鲜虾为宿主进行了模拟实验，得到了最低检测限为10 CFU/mL，为实际推广应用提供参考。为进一步验证LAMP的可靠性，本实验收集了144份水产样品，微生物分离后用PCR技术鉴定阳性菌株，用LAMP技术进行检测，结果也证明所建方法实用可靠。
特异性是LAMP检测技术的重要指标。本研究首次以副溶血弧菌的一种β内酰胺酶编码基因blaCARB-17为靶序列建立LAMP。特异性实验表明，本方法能特异性扩增副溶血弧菌ATCC17802的blaCARB-17基因，未检出其他5个对照食源性细菌。blaCARB-17基因在探索副溶血弧菌对氨苄西林的耐药机制时被发现，其位于基因组的2号染色体上，该基因的上游和下游分布相关的转运蛋白和酶编码基因[27]。blaCARB-17基因无法定位于任何基因岛上，其遗传环境中没有整合酶和转座酶等元件，表明该基因是副溶血弧菌的固有序列。2016年，LI等[28]基于blaCARB-17基因建立了检测副溶血弧菌的PCR方法，特异性达到100%，而用tlh和atpA的PCR检测有假阳性，充分证明该基因是副溶血弧菌新的特异性靶序列。近年来，国内外学者建立了检测副溶血弧菌的多种LAMP方法，包括常规LAMP和LAMP与其他技术联用，但均未能对实际样品现场即时性检测[29]。常规LAMP比其他技术更实用，影响因素较少。本研究首次以blaCARB-17为靶序列建立常规LAMP方法，为深入探索其可视化试剂盒提供依据。
灵敏度是检测技术的另一项评价指标。本实验得到基因组最低检测限为3.64×102ng/μL，模拟实验的菌落最低检测限为10 CFU/mL。胡元庆等[22]建立了基于tlh基因的LAMP方法，最低检测限为1 CFU/mL；纪懿芳等[23]建立了以tlh为标识基因的LAMP方法，最低检测限为140 CFU/mL；周顺等[25]建立了以ompA为靶基因的创伤弧菌和副溶血弧菌的双重LAMP，对实际样品检测的灵敏度可达374～410 CFU/g (mL)；相兴伟等[26]建立了针对副溶血弧菌toxR和霍乱弧菌ompW基因的双重LAMP，对模拟食品样品的最低检测限为50 CFU/mL。通过以上对比可知,本研究建立的LAMP检测限低于其他报道，可以用于水产食品的实际检测。
4 结论
本研究针对副溶血弧菌blaCARB-17基因在线设计特异性引物，运用Bst DNA聚合酶扩增β内酰胺酶基因，对反应体系中各项参数进行优化，确定了Mg2+的最适浓度为2.4 mmol/L，dNTPs的最佳反应浓度为0.96 mmol/L，Bst DNA聚合酶最适用量为4.8 U，最佳内外引物浓度比是8∶1，最佳反应温度是65 ℃，最佳反应时间60 min，首次以blaCARB-17为目标序列建立了检测副溶血弧菌LAMP技术。在此基础上，以单核细胞增生李斯特菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌为对照考察了LAMP的特异性，结果显示只有副溶血弧菌LAMP反应呈阳性，其他对照菌株为阴性，表明该方法具有很好的特异性。通过模拟实验和实际样品的检测，都能说明该LAMP方法具有很好的可靠性。当然本研究还有一些可以改进的方面，比如用羟基萘酚蓝染料[29]代替SYBR Green I实现可视化，反应前加入可避免操作过程中形成气溶胶导致样品交叉污染。还可以用付世骞等[30]设计的无电加热器替代水浴锅，便于现场即时检测。综上所述，本研究为探索基于blaCARB-17基因的LAMP试剂盒产品提供可能。
[1] YU Q Q,NIU M Y,YU M Q,et al.Prevalence and antimicrobial susceptibility of Vibrio parahaemolyticus isolated from retail shellfish in Shanghai[J].Food Control,2016,60:263-268.
[2] LAW J W F,AB MUTALIB N S,CHAN K G,et al.Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens:Principles,applications,advantages and limitations[J].Frontiers in Microbiology,2015,5:770.
[3] ELBASHIR S,PARVEEN S,SCHWARZ J,et al.Seafood pathogens and information on antimicrobial resistance:A review[J].Food Microbiology,2018,70:85-93.
[4] LI L Z,MENG H M,GU D,et al.Molecular mechanisms of Vibrio parahaemolyticus pathogenesis[J].Microbiological Research,2019,222:43-51.
[5] JIANG Y H,CHU Y B,XIE G S,et al.Antimicrobial resistance,virulence and genetic relationship of Vibrio parahaemolyticus in seafood from coasts of Bohai Sea and Yellow Sea,China[J].International Journal of Food Microbiology,2019,290:116-124.
[6] XIE T F,XU X K,WU Q P,et al.Prevalence,molecular characterization,and antibiotic susceptibility of Vibrio parahaemolyticus from ready-to-eat foods in China[J].Frontiers in Microbiology,2016,7:549.
[7] TAIWO M,BAKER-AUSTIN C,POWELL A,et al.Comparison of toxR and tlh based PCR assays for Vibrio parahaemolyticus[J].Food Control,2017,77:116-120.
[8] SIRIKHARIN R,TAENGCHAIYAPHUM S,SANGUANRUT P,et al.Characterization and PCR detection of binary,Pir-like toxins from Vibrio parahaemolyticus isolates that cause acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp[J].PloS One,2015,10(5):e0126987.
[9] KIM S H,LEE Y S,KWAK H S.Rapid real-time PCR for the detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood[J].International Journal of Infectious Diseases,2016,53:69.
[10] XU D S,JI L,WU X F,et al.Detection and differentiation of Vibrio parahaemolyticus by multiplexed real-time PCR[J].Canadian Journal of Microbiology,2018,64(11):809-815.
[11] ANAND P S S,SOBHANA K S,GEORGE K C,et al.Selection of specific cell wall antigen for rapid detection of fish pathogenic Vibrio parahaemolyticus by enzyme immunoassay[J].Indian Journal Fish,2016,63(2):76-85.
[12] TASRIP N A,KHAIRIL MOKHTAR N F,HANAPI U K,et al.Loop mediated isothermal amplification;a review on its application and strategy in animal species authentication of meat based food products[J].International Food Research Journal,2019,26(1):1-10.
[13] IZUMIYA H,MORITA M,ARAKAWA E,et al.Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for Vibrio cholerae O1 and O139[J].Molecular and Cellular Probes,2019,45:65-67.
[14] YAMAZAKI W,ISHIBASHI M,KAWAHARA R,et al.Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus[J].BMC Microbiology,2008,8(1):163.
[15] CHEN S Y,GE B L.Development of a toxR-based loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio parahaemolyticus[J].BMC Microbiology,2010,10(1):41.
[16] YAMAZAKI W,KUMEDA Y,UEMURA R,et al.Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and simple detection of Vibrio parahaemolyticus in naturally contaminated seafood samples[J].Food Microbiology,2011,28(6):1 238-1 241.
[17] LIU N W,ZOU D Y,DONG D R,et al.Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification method for thesimultaneous detection of Salmonella spp.and Vibrio parahaemolyticus[J].Scientific Reports,2017,7(1):115-129.
[18] WANG L,SHI L,SU J Y,et al.Detection of Vibrio parahaemolyticus in food samples using in situ loop-mediated isothermal amplification method[J].Gene,2013,515(2):421-425.
[19] WANG Y,LI D X，WANG Y,et al.Rapid and sensitive detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus by multiple endonuclease restriction real-time loop-mediated isothermal amplification technique[J].Molecules,2016,21(1):111.
[20] PROMPAMORN P,SITHIGORNGUL P,RUKPRATANPORN S,et al.The development of loop-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick for detection of Vibrio parahaemolyticus[J].Letters in Applied Microbiology,2011,52(4):344-351.
[21] CHEN C,LIU P,ZHAO X,et al.A self-contained microfluidic in-gel loop-mediated isothermal amplification for multiplexed pathogen detection[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2017,239:1-8.
[22] 胡元庆,黄玉萍,李凤霞,等.水产品中副溶血性弧菌LAMP检测方法的优化[J].现代食品科技,2017,33(6):313-320;247.
HU Y Q,HUANG Y P,LI F X,et al.Optimization of loop-mediated isothermal amplification methods for the detection of Vibrio parahaemolyticus in aquatic products[J].Modern Food Science and Technology,2017,33(6):313-320；247.
[23] 纪懿芳,胡文忠,姜爱丽,等.LAMP技术快速检测海产品副溶血弧菌的条件优化[J].食品工业科技,2015,36(20):59-63;67.
JI Y F,HU W Z,JIANG A L,et al.Optimize of loop-mediated isothermal amplification technology in detection of Vibrio parahaemolyticus[J].Science and Technology of Food Industry,2015,36(20):59-63；67.
[24] 韩小龙,张海燕,曹明秀,等.基于环介导等温扩增法(LAMP)检测上海市售贝类产品中副溶血性弧菌的毒力菌株[J].现代食品科技,2015,31(9):278-283.
HAN X L,ZHANG H Y,CAO M X,et al.Detection of virulent Vibrio parahaemolyticus strains from commercial shellfish in Shanghai by loop-mediated isothermal amplification[J].Modern Food Science and Technology,2015,31(9):278-283.
[25] 周顺,高志鑫,张敏.创伤弧菌和副溶血弧菌双重LAMP检测方法的建立及初步应用[J].中国兽医学报,2016,36(11):1 875-1 881.
ZHOU S,GAO Z X,ZHANG M.The development and application of a duplex loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus[J].Chinese Journal of Veterinary Science,2016,36(11):1 875-1 881.
[26] 相兴伟,郑斌,顾丽霞,等.双重LAMP技术快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法学研究[J].现代食品科技,2017,33(1):253-260.
XIANG X W,ZHENG B,GU L X,et al.Study on simultaneous detection of Vibrio Parahaemolyticus and Vibrio Cholerae in aquatic products by loop-mediated isothermal amplification method[J].Modern Food Science and Technology,2017,33(1):253-260.
[27] CHIOU J C,LI R，CHEN S.CARB-17 Family of β-Lactamases mediates intrinsic resistance to penicillins in Vibrio parahaemolyticus[J].Antimicrobial Agents & Chemotherapy,2015,59(6):3 593-3 595.
[28] LI R C,CHIOU J,CHAN E W C,et al.A novel PCR-based approach for accurate identification of Vibrio parahaemolyticus[J].Frontiers in Microbiology,2016,7:44.
[29] 纪懿芳,胡文忠,姜爱丽,等.海产品中副溶血弧菌的LAMP-HNB快速检测技术[J].食品与发酵工业,2015,41(7):142-148.
JI Y F,HU W Z,JIANG A L,et al.Rapid diagnostic methods for Vibrio parahaemolyticus in seafood using LAMP-HNB[J].Food and Fermentation Industries,2015,41(7):142-148.
[30] 付世骞,曲艳艳,冯晓涵,等.环介导等温扩增-无电加热法检测乳中阪崎克罗诺杆菌[J].食品与发酵工业,2018,44(3):220-225.
FU S Q,QU Y Y,FENG X H,et al.Detection of Cronobacter sakazakii in milk by loop-mediated isothermal amplification without electric heating method[J].Food and Fermentation Industries,2018,44(3):220-225.