总RNA提取和制备是各种以RNA为基础的技术前提。这些技术包括实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)、RNA测序(RNA-seq)、cDNA文库构建、Northern杂交分析等。不同技术应用对RNA提取物的质量要求侧重点稍有区别,但毫无疑问,得率越高、纯度越高、完整性越好,后续的各种RNA工作越方便进行。相比细菌,酵母的细胞壁比较厚,难于破碎,如何有效地破碎细胞壁并保证RNA的完整性,是获得高质量酵母菌总RNA的关键问题[1-4]。到目前为止,酿酒酵母RNA提取已经有很多文献报道,主要方法有(酸)热酚法[5-6]、水浴法[7]、RNAsnapTM法[8]、一步甲酰胺法[9]等,国内外也开发了商品化试剂盒[4, 10]。但整体上这些方法首先针对对数期酵母细胞的RNA提取而研发;非对数生长期细胞[11],非常规生长或发酵条件[2],各种原因导致的酵母细胞状态变化,都会影响RNA提取方法的效率和效果;在RNA得率和质量不能满足使用基本要求的情况下,提取方法必需先行调整、摸索和优化。
酿酒酵母是分子生物学和遗传学研究的最重要模式生物之一。酿酒酵母在葡萄糖为碳源的丰富培养基中的典型生长曲线,对数生长期(exponential phase, EP)之后有二次生长期(post-diauxic phase, DP)和稳定期(stationary phase, SP)[12-13];3个阶段的维持和中间转换调节机制有多种,其一是cAMP-PKA信号转导途径[13]。cAMP是环式3′,5′-单磷酸腺嘌呤核苷(3′,5′-cyclic adenosine monophosphate),简称环磷酸腺苷,是普遍存在于生物机体内并在生物机体的功能调节中起着十分重要作用的生理活性物质,被称为第二信使[14];PKA是酵母蛋白质激酶(protein kinase A);cAMP-PKA信号转导途径涉及细胞生长和发育调节,有着极为广泛的功能[12-14]。
本课题组在多年cAMP-PKA信号转导途径研究基础上获得了高分泌cAMP的酵母菌株,对影响胞外cAMP产量高低的各种因素进行了初步评价和优化[15-17]。在前期酿酒酵母研究过程中,RNA提取与应用是经常性的工作;无论qRT-PCR、Northern杂交分析和cDNA文库构建等,基本都选择使用对数生长期细胞,利用商品化RNA提取试剂盒进行提取,所得RNA提取物都能满足下游使用要求。而在胞外cAMP高产菌株的发酵机制与代谢调控研究工作中我们发现:cAMP生产菌株发酵时间长,cAMP的胞外分泌和积累贯穿生长曲线的上述3个阶段[15-17],仅仅进行对数生长期的分析是远远不够的。为此,我们在前期建立的对数生长期细胞RNA提取与利用基础上,对比考察了不同生长阶段细胞的RNA提取效果,并进行了初步优化;本文报告了不同生长阶段细胞RNA提取效果的对比及初步优化的结果。
1.1.1 菌株与引物
酿酒酵母G2为本实验室前期工作中构建的具有一定胞外cAMP 生产能力的工程菌[17]。本实验用到的引物对如下:(1)检测ACT1基因:ACT1-UP:5′-TTATTGATAACGGTTCTGGTATG-3′,ACT1-DW:5′-CC TTGGTGTCTTGGTCTAC-3′,PCR产物预期长度100 bp;(2)检测CYR1基因:CYR1-UP:5′-GTCTTCCACTTCCTCATCTT-3′,CYR1-DW:5′-TATTATCCTGCTCTC GGTTG-3′,PCR产物预期长度119 bp。引物对使用Primer Premier软件设计,苏州金唯智生物科技有限公司合成。
1.1.2 培养基与活化培养
YPD培养基(g/L):酵母抽提物10、蛋白胨A 20、D-葡萄糖20,固体培养基则还需添加琼脂粉15;均购于上海生工技术有限公司。从甘油管中划线接种YPD平板活化,30 ℃倒置培养2~3 d至长出单菌落;然后挑取单菌落接种液体YPD培养基,30 ℃、220 r/min培养约16 h;需要时再转接二次液体培养活化。
1.1.3 试剂与仪器
直径500 μm玻璃珠(CAT#:11079105,Biospec);柱式真菌RNAout试剂盒(CAT#:80804-50)、UV型核酸染料绿如蓝(CAT#;70303-1.5)、DNase(CAT#:90903-1000),北京天恩泽;琼脂糖H(CAT#:9 012-36-6),上海生工;反转录试剂盒(CAT#:04897030001),Roche;荧光定量PCR试剂盒SYBR Green I(CAT#:FP205-02),TIANGEN。
TU-1810紫外分光光度计,普析通用;S-10酶膜仪,西尔曼科技;BD115恒温培养箱,Binder;SM-30水平轨道式摇床,Edmund Bühler;FP120细胞破碎仪,Thermo Savant;IID超声波细胞粉碎机,SCIENTZ;Pico 17高速离心机、88880018涡旋振荡器,Thermo SCIENTIFIC;Q5000超微量紫外分光光度计,Quawell;P25标准型凝胶电泳仪,Biometra;M030723紫外线透射仪,UVitec;LightCycler 480 II实时荧光定量PCR仪,Roche;2100 Bioanalyzer生化分析仪,Agilent。
使用250 mL摇瓶,装液量为60 mL YPD培养基;接种新鲜活化种子液,控制起始A600=0.2,30 ℃、220 r/min培养7 d。定时取样进行如下分析:(1)A600测定;(2)酶膜仪葡萄糖浓度测定,按照说明书操作;(3)镜检观察和计数;(4)以单管分装菌液,立即冻存于-80 ℃,供总RNA提取用。设置3个重复。结果使用典型的、有代表性的数据。
1.3.1 珠打法破碎酵母细胞
按设备说明书并参考文献[4]进行操作。取适量菌液到2 mL细胞破碎仪专用离心管中,10 000×g、1 min、4 ℃离心,弃上清液,细胞沉淀用无菌超纯水洗涤3次;500 μL无菌超纯水重悬;加入300 μL玻璃珠,振荡30 s、静息120 s(期间样品置于冰上),1~20个循环。取适量体积破碎液直接或适当稀释后镜检观察和计数,计算细胞破碎率;下同。
1.3.2 液氮研磨
同1.3.1收集菌体;参照文献[1]中的方法,将菌体转移至研钵中,立即加入适量液氮,迅速研磨至液氮全部挥发,重复3次研磨操作。用适量无菌超纯水重悬研磨后的菌粉,计数。
1.3.3 反复冻融
同1.3.1收集菌体和重悬;参照文献[1]中的方法,将离心管迅速置于液氮中冷冻3 s,取出后立即于37 ℃水浴解冻,直至菌液彻底融化;重复以上操作3次。
1.3.4 超声波破碎
同1.3.1收集菌体,1 mL无菌超纯水重悬;参照厂家推荐的酿酒酵母破壁参数操作,即超声波细胞粉碎机功率380 W,工作2 s,间歇3 s,超声破碎5 min,视镜检情况增加处理次数。
1.3.5 涡旋振荡
同1.3.1收集菌体和重悬;参照本实验室酿酒酵母DNA提取破壁条件,加入300 μL玻璃珠,涡旋振荡5 min,视镜检情况增加振荡次数。
取-80 ℃冻存菌液,冰上自然缓慢解冻,按照RNA提取试剂盒说明书进行操作。具体操作步骤如表1所示。
表1 天恩泽柱式真菌RNAout试剂盒RNA提取步骤
Table 1 TIANDZ Column Fungal RNAout operating steps
步骤操作时间/min113 000×g离心 1 min,弃上清,将酿酒酵母细胞收集至1.5 mL离心管管底32加入0.4 mL溶液A,充分吹打混匀;加入0.4 mL溶液B,剧烈振荡30 s1365 ℃保温5 min。5 413 000×g离心3 min,转移上清液到干净的1.5 mL塑料离心管中3.5 5加入0.1 mL溶液B和0.1 mL自备氯仿,振荡混匀30 s1613 000×g离心3 min,转移上清液到干净的5 mL塑料离心管中3.57加入相当于上清液3倍体积的溶液C和1倍体积的溶液D,充分混匀18将混合液分3~4次转移到离心吸附柱中,每次13 000×g离心0.5 min,弃收集管中的穿透液39吸取0.5 mL通用洗柱液到离心吸附柱中,13 000×g离心0.5 min,弃收集管中的穿透液11013 000×g离心0.5 min,去除残留的洗柱液111将离心吸附柱转移到RNase-free 1.5 mL塑料离心管中,加入50 μL RNA洗脱液;13 000×g离心0.5 min,离心管中即为RNA样品1 总计24
当插入珠打法细胞破碎步骤时,表1步骤1改在同1.3.1里的专用管里进行,然后按步骤2加入试剂,同1.3.1加入玻璃珠后用细胞破碎仪振荡破碎,继续步骤3及后续提取操作。
1.5.1 分光光度计测定
按说明书操作,分别测定RNA提取物在230、260、280 nm处的吸光度,并自动计算总RNA的质量浓度(ng/μL)及A260/280、A260/230比值。需要时对样品进行稀释。重复3次测定,计算平均值。
1.5.2 琼脂糖凝胶电泳分析
取800 ng RNA提取物,混合上样缓冲液后加入到10 g/L琼脂糖凝胶加样孔中,在0.5×TAE缓冲液中电泳。核酸染料体积分数0.005%,电泳电压5 V/cm,电泳时长30 min。电泳结束后利用紫外线透射仪进行分析。
1.5.3 RNA完整值(RNA integrity number,RIN)分析
取1~5 ng RNA提取物,使用生化分析仪,按说明书操作,由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
1.6.1 反转录
按反转录试剂盒说明书进行操作,体系及反应条件如下:(1) 2 μg RNA,1 μL Oligo dT,补RNase free H2O至13 μL,65 ℃保温10 min;(2) 冷却后加入如下组分:4 μL 5×Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer,0.5 μL Protector RNase Inhibitor,2 μL Deoxynucleotide Mix,0.5 μL Transcriptor Reverse Transcriptase,轻轻吹打混匀,先50 ℃保温60 min,然后85 ℃保温5 min。
1.6.2 qRT-PCR分析
按qPCR试剂盒说明书进行操作,体系及反应条件如下:(1) 25 ng核酸模板(RNA提取物或cDNA),0.3 μmol/L上游引物,0.3 μmol/L下游引物,10 μL SYBR Green I,补水至20 μL;(2) 95 ℃ 5 min;95 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40个循环。
菌株G2在20 g/L葡萄糖培养基YPD中的生长和糖耗曲线如图1所示。葡萄糖在20 h左右耗尽;综合糖耗和生长情况,生长3阶段对应时段分别为:对数生长期(EP)9~20 h,二次生长期(DP)20~48 h,48~60 h间进入稳定期(SP)。
图1 酵母菌株G2在YPD中的生长和糖耗曲线
Fig.1 The growth curve and glucose curve of strain G2 in YPD medium
为了简化情况,不同阶段总RNA提取效果的分析选择3个时间点菌液进行(16、36、60 h);分别对应和代表图1所示生长3阶段。RNA提取效果通过如下3个方面的分析和相应指标进行对比判断。
2.2.1 分光光度计测定和得率计算
RNA提取物的分光光度计测定和相应得率计算结果如表2所示。一般认为若A260/280值在1.9~2.1、A260/230值在2.0附近,表明样品纯度较好,没有明显的碳水化合物(糖类)、盐类、有机溶剂污染或蛋白残留。由表2可知,3个时间点RNA提取物样品都没有明显的核酸以外前述物质的污染,纯度较好;3个时间点的得率差异极为显著。
表2 不同时间RNA提取物吸光度测定值和得率
Table 2 RNA absorbance and yield at different growth times
时间/hA260/280A260/230得率/(ng·A-1600)得率比值162.25±0.022.02±0.011 010.611.07362.11±0.012.01±0.01171.51.88601.94±0.012.20±0.0691.31
2.2.2 RNA提取物电泳
RNA提取物样品的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。16 h RNA提取物样品28S、18S、5S条带清晰,而36 h则出现了显著的变化,条带相对弥散、模糊。需要说明的是60 h RNA提取物样品浓度太低,给电泳、反转录和qPCR各环节与16、36 h RNA提取物样品完全平行的操作设计带来很大不便,同时也影响它自身效果判断;尤其电泳上样量大,因此这里放弃了60 h RNA提取物样品的电泳分析。
图2 RNA提取物琼脂糖凝胶电泳
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of RNA extractions
2.2.3 qPCR测试和RNA提取物DNA污染判断
RNA提取物里的DNA污染情况是判断RNA提取物质量和确定其能否被正式使用的关键环节。简单的检测方式是以RNA提取物为模板进行常规PCR反应,琼脂糖凝胶电泳观测不到目的条带时,视为RNA提取物里的DNA污染可以忽略。本实验为了便于量化比较不同阶段RNA提取物的DNA污染程度,同时量化比较DNA污染对不同表达丰度基因定量PCR的背景干扰程度,选择qPCR方式进行DNA污染检测。在预实验分析的基础上,选择ACT1基因和CYR1基因分别为高、低丰度表达的基因代表,使用引物对ACT1-UP/ACT1-DW、CYR1-UP/CYR1-DW,分别以RNA提取物和反转录所得cDNA样品为模板,控制相同的核酸模板量和完全一样的条件进行qPCR。2种模板对应CP(crossing point)值的差值简写为ΔCP(RNA-cDNA)。CP值和ΔCP(RNA-cDNA)结果分别如图3和图4所示。
图3 不同时间CP值
Fig.3 CP value change during different growth times
图4 qPCR方法检查RNA提取物DNA污染情况
Fig.4 RNA purity test by qPCR method
由图3和图4可知,ACT1基因和CYR1基因的表达中,以RNA提取物为模板的CP值一般认为≈35或≥35,说明RNA提取物中无DNA污染或其中DNA污染可以忽略;图3显示16 h样品DNA污染可以忽略,而36 h和60 h样品则存在一定程度的DNA污染;如图4所示ΔCP(RNA-cDNA)的变化,说明基因的表达水平随时间延长而下降,同时来自DNA污染的背景干扰相对增加;而ACT1基因的ΔCP远远高于CYR1基因的ΔCP,说明DNA污染所致背景干扰的程度与基因表达丰度有关,丰度越高、DNA污染背景干扰程度相对越低,反之亦然。
上述结果初步证明3个阶段的RNA提取物得率、完整性和DNA污染程度彼此差异显著;对数期细胞能很容易地获得较好的提取效果,工作方便,无需进一步纯化就能用于下游应用。另外2个阶段的菌液RNA提取首要问题是得率低,其次是存在完整性和DNA污染问题。
如前言所述,细胞壁的有效破碎和RNA完整性之间是一个矛盾;而DNA污染问题则可以通过DNase消化解决。因此,本文首先尝试从提高细胞破壁率的角度来改进36 h和60 h细胞的RNA提取效果。参考文献[1-4]选择珠打法(bead beating)、液氮碾磨、反复冻融、超声波破碎和加玻璃珠涡旋振荡5种方法,首先检查对60 h细胞的破壁效果,然后结合使用破壁步骤和试剂盒提取RNA。由表3和图5可知,以破壁率来说,珠打方法破壁效果最好,玻璃珠涡旋振荡和液氮研磨次之;反复冻融和超声波破碎方法过低,放弃进一步考察;对所得破碎细胞液进一步进行RNA提取操作,玻璃珠涡旋振荡方法不仅得率低,RNA完整性也较珠打和液氮研磨方法差。综上,选择珠打破壁法用于后续的实验。
表3 不同破壁方法细胞破壁率和相应RNA提取效果比较
Table 3 Comparison of cell wall disruption ratio and RNA extraction yield and quality by different methods
编号破壁方法60 h破壁率/%60 h RNA 得率/(ng·A-1600)A260/280A260/2301珠打 92737.82.26±0.022.08±0.022液氮研磨 39523.42.22±0.012.07±0.023反复冻融 13*——4超声波破碎6*——5涡旋振荡 74169.92.09±0.021.98±0.04
注:*表示由于破壁率过低而未进行后续提取操作;-表示未检出
1-珠打;2-液氮研磨;3-涡旋振荡
图5 三种破壁方法所得RNA提取物琼脂糖凝胶电泳
Fig.5 Agarose gel electrophoresis of RNA extractions by three cell wall disruption methods
2.3的结果与文献报道一致,证明珠打匀浆法是最常用也是最有效的酵母细胞破壁方法之一[1-4]。我们进一步按1.3.1里的操作,取适量上述36和60 h菌液进行更细致的破壁条件摸索;重点调整破壁处理循环数,以确保细胞破壁率在99%以上;然后根据1.4 插入优化的珠打匀浆步骤进行RNA提取。所得提取物样品仍然从同上的3个方面进行评价;为考察RNA提取物能否满足转录组学测序要求,还进行了RIN测定。
2.4.1 分光光度计测定值和得率
RNA提取物的分光光度计测定和相应得率计算结果如表4所示,16 h样品RNA提取物得率没有明显变化,但36、60 h样品的RNA提取物得率则分别为2.2.1中得率的5.71、8.60倍,上升显著;A260/280、A260/230比值反映出RNA提取物纯度较高、没有明显的核酸以外物质的污染。
表4 不同时间RNA提取物吸光度测定值和得率
Table 4 RNA absorbance and yield at different growth times
时间/hA260/280A260/230得率/(ng·A-1600)得率比值162.15±0.012.11±0.021 022.21.01362.13±0.022.14±0.05979.65.71602.26±0.012.09±0.02785.68.60
2.4.2 RNA提取物电泳和RIN分析
RNA提取物样品的琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示。16 h RNA提取物条带清晰,且28S与18S RNA倍性关系明显,RNA完整性较好;36 h RNA提取物效果较图2有显著改进,28S与18S RNA倍性关系略差于16 h RNA提取物;60 h RNA提取物样品28S、18S、5S三带依稀可见,效果与图2中36 h RNA提取物接近。
图6 RNA提取物琼脂糖凝胶电泳
Fig.6 Agarose gel electrophoresis of RNA extractions
为进一步确认RNA提取物完整性能否达到进行转录组学测序分析要求,样品提交苏州金唯智生物科技有限公司公司使用生化分析仪和RNA芯片进行了分析,结果显示16、36、60 h样品RNA提取物RIN分别为8.8、7.4和5.3,28S/18S (Area)分别为1.7、1.5和1.6;16、36 h样品能通过该公司进行转录组学测序分析的质控要求;而60 h样品则不能通过。另外,图2所示试剂盒方法提取16 h RNA样品也能通过质控检查,完全达到测序分析要求。
2.4.3 qPCR测试和RNA提取物DNA污染判断
测试CP值结果如图7和图8所示。需要说明的是ACT1基因和CYR1基因的表达:(1) 以RNA提取物为模板的CP值,除了16 h样品CP值分别为37.30、ND(检测不到),36 h和60 h样品CP值都在34.71~36.07,说明RNA提取物中的DNA污染干扰都可以忽略不计,无需DNase消化;(2)图7说明2个基因在3个阶段都维持表达,表达水平随时间延长略有下降;(3)2个基因的ΔCP(RNA-cDNA) 值都随时间延长而下降,说明表达水平随时间延长而下降的同时,来自DNA污染的背景干扰相对增加;(4)ACT1基因的ΔCP值明显高于CYR1基因的ΔCP值,说明基因表达丰度越高,DNA污染背景干扰程度相对越低,反之亦然。
图7 cDNA为模板的CP值
Fig.7 CP value change by cDNA as template
综合前述结果,试剂盒提取方法能完全满足16 h对数生长期细胞RNA提取的得率和质量要求;而添加珠打破壁步骤,则进一步解决了36 h二次生长期细胞和60 h稳定期细胞RNA提取得率和DNA污染问题,36 h样品还能满足RNA测序完整性要求。然而,还存在如下一些问题需要说明和进一步研究予以明确。
图8 qPCR方法检查RNA提取物DNA污染情况
Fig.8 RNA purity test by qPCR method
2.4.3.1 RNA提取得率和质量要求
确如吴思琪等[3]所述,总RNA的人工手动提取和试剂盒提取各有利弊。手动提取不存在试剂盒的最低菌体细胞量和最小洗脱体积限制,总RNA得率有望远高于试剂盒提取;但试剂盒方法方便将小分子杂质、大分子蛋白质以及DNA等一并去除,直接得到纯度相对更高的样品,省却后续人工提纯步骤。本团队前期也做过一些方法的对比,最终确定在得率和纯度能满足下游应用要求的前提下,优先使用试剂盒,其相对快速便捷、全程不到30 min(表1);更方便控制人为操作误差,相对稳定。
本研究中,RNA质量是从满足2个方面的应用——qRT-PCR和转录组学测序完整性要求来进行评价的。qRT-PCR上,DNA污染程度和造成的背景信号干扰程度,是相对于基因的表达丰度而言的;为了同时量化对比不同阶段RNA提取物质量和DNA污染对不同表达丰度基因qPCR的背景干扰程度,我们选取了ΔCP (RNA-cDNA)指标,用于评价基因以及qPCR体系的设计,以控制CP值在合理的范围内为原则。相比于得率,DNA污染实际是一个相对次要的问题,通过DNAase消化即能解决;但DNAase消化后的进一步提纯则是一个需要慎重考虑的问题,因为提纯无疑会增加操作步骤、降低得率,使试剂盒优势大打折扣。
一般认为,振荡是破碎酵母细胞壁的一个有效方法,但在提高得率的同时,可能与RNA完整性矛盾,因此,必需小心控制振荡的条件[1-4]。本研究中,参考文献[1-4]选择的5种方法对比考察证明了珠打法破壁的优势,即操作快速简便、能同时多管操作和提高破壁率。如图2、图6和RIN测定结果所示,珠打法对16 h对数生长期细胞没有明显效果,一方面说明试剂盒就能很好解决对数生长期细胞的破壁问题,另一方面也说明珠打本身不会特别导致RNA断裂而破坏RNA完整性;而珠打法处理的36 h细胞RNA提取物也能达到转录组学测序要求,更说明了本研究中的珠打步骤没有明显影响RNA完整性。
2.4.3.2 三个阶段细胞及RNA提取差异分析
本研究选取了3个时间点对应3个阶段,来说明细胞状态变化对RNA提取得率与质量的影响。事实上这仅仅是一个初步调查;适当延长培养时间,缩短取样间隔,适当增加分析取样点和检测指标,能更准确地划分各个生长阶段,更完整、可靠地反映整个生长曲线过程中的变化规律;而本研究菌株在生长过程中分泌的胞外cAMP,对整个阶段细胞状态进而对RNA提取的影响,还有待更深入的调查。
2.5.3.3 ACT1基因表达
ACT1基因是人们常用的酿酒酵母qRT-PCR分析内参基因之一;但事实上有研究报道整个生长或发酵阶段它的表达并不稳定,尤其稳定期甚至检测不到,因此被认为它并不是最合适的内参基因[18-19]。本研究中,基于3阶段RNA提取物及其cDNA为模板的预实验结果,将其选作高丰度表达的基因代表,而图3和图6的结果则进一步证明了ACT1基因在稳定期仍然维持较高水平的表达。本研究使用的菌株cAMP生产相关性能应该是本研究结果与文献报道不同的主要影响因素之一。进一步的分析还在进行中。
综上,本研究考察了cAMP生产酵母菌株G2在YPD培养基中不同生长阶段的总RNA提取效果,并进行了初步改进研究。选择16 h对数生长期细胞、36 h二次生长期细胞和60 h稳定期细胞,分别用试剂盒提取,RNA得率依次为1 010.6、171.5和91.3 ng/A600。以ACT1和CYR1为高、低丰度表达的基因代表,进行qRT-PCR的同时判断DNA污染情况;琼脂糖电泳和RIN测定判断完整性;结果显示36 h和60 h RNA提取物都存在DNA污染和完整性较差问题。添加珠打破壁步骤破碎细胞,显示对16 h细胞的RNA提取效果没有明显变化,但36 h和60 h得率分别提高至979.6和785.6 ng/A600,为前述值的5.71倍和8.60倍,且样品纯度能满足qRT-PCR要求,36 h样品能满足RNA测序要求。分析细胞3个阶段中的状态变化是决定RNA提取阶段性特征的根本原因。本研究结果将有助于推动建立酵母生长全阶段RNA分析技术和深化cAMP途径相关调控机制的认识。
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