负离子电场(静电场)是通过电板中填充高分子材料，当通电时分子之间相互碰撞、摩擦等物理作用，会使电板中产生巨大的能量，积累的能量导致电板中电位迅速增加而产生大量静电运动。这些静电运动的材料会向环境放电并将负电荷扩散到环境中，从而在一定空间范围内长时间制造负离子的氛围[1-5]。目前国内外研究负离子电场的应用主要集中在果蔬、肉类的保鲜方面。高压静电场处理可以减少鲜核桃青皮中总酚的损失，降低腐烂指数，延长保鲜期[6]；在高压静电场条件下解冻兔肉优于常规解冻，而且不会造成兔肉的脂质氧化[7]；可以最大限度延长冷冻生鲜食品保鲜期[8-10]。DENBA+静电场处理有效地加快了猪肉的冻结速率，降低脂肪氧化速率和嫩度，减少冷藏猪肉菌落总数[11]等。将肉类置于负离子电场中腌制可利用负离子电场使分子运动加快、抑制微生物繁殖、降低脂肪氧化速率等作用，对传统腌制技术的不足进行改善[12-13]。本试验将腌制技术与负离子电场结合，用Box-Behnken设计与响应面法优化负离子电场腌制工艺，获得腌制的最佳工艺，为负离子腌制技术降低腌制肉品脂肪氧化提供实验数据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
羊后腿肉，采样于内蒙古锡林古勒盟苏尼特羊繁育基地；食盐，呼和浩特市家乐福超市；NaNO2、抗坏血酸(分析纯)，天津市永大化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；GZX-9数显鼓风干燥箱，上海一恒仪器有限公司；磁力搅拌器，常州易晨仪器有限公司；TU-1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器责任有限公司；静电磁场装置，呼和浩特市绿碧电子设备有限公司；
1.3 方法
1.3.1 原料肉处理
将冷冻的苏尼特羊后腿肉在4 ℃条件下隔夜解冻，解冻后的肉切成5 cm×5 cm×5 cm的肉块，然后用注射器将混合好的腌制液注入肉块中，将肉块放在封闭的容器内腌制，腌制后进行测定。
试验腌制液：每100 g优质羊后腿肉，用100 mL水分别溶解0.1 g NaNO2和1 g抗环血酸，试验前将配制好的2种研制液放于4 ℃冰箱备用。
1.3.2 腌制方法
新型负离子电场腌制：称取250 g肉样，通过注射器将25 mL NaNO2溶液和12.5 mL抗坏血酸混合溶液注入肉块中，然后撒入6.25 g食盐，在容器内用手揉捻、翻动数下，用封口膜封口进行腌制。为腌制均匀，每6 h上下翻动1次。
1.3.3 负离子电场对羊肉肌红蛋白总量及相关色素的测定
取肉样20 g，加入20 mL浓度为0.04 mol/L，pH 6.8的磷酸钠缓冲剂,用快速搅拌器在室温下均质20 s。然后将样品于冰浴中冰浴1 h，取出于8 000 r/min、4 ℃下离心20 min。将上清液用滤纸过滤，用同样的缓冲液加至刻度25 mL。使用TU-1810紫外可见风光光度计测定在525、545、565和572 nm 处的吸光率。肌红蛋白总量及脱氧肌红蛋白(deoxyMb)、氧合肌红蛋白(MbO2)等及高铁肌红蛋(MetMb)各部分的比例按照孟宇竹等[14]方法，计算如公式(1)～公式(4)所示：
肌红蛋白总量(mmol·L-1)=-0.166A572+0.086A565+0.088A545+0.099A525
(1)
脱氧肌红蛋白/%=(0.369R1+1.140R2-0.941R3+0.015)×100
(2)
氧合肌红蛋白/%=(0.882R1-1.267R2+0.809R3-0.361)×100
(3)
高铁肌红蛋白/%=(-2.541R1+0.777R2+0.800R3+1.098)×100
(4)
式中：Rl、R2、R3分别是吸光率比值A572/A525、A565/A525、A545/A525。
1.3.4 单因素试验变量因素设定
在固定腌制剂加入量下，设置各因素水平为腌制温度(0、2、4、6、8 ℃)、腌制场强(0、1、3、5、7 kV)、腌制时间(10、11、12、13、14 h)对腌肉肌红蛋白相关量的影响。
1.3.5 响应面试验
依据Box -Behnken中心设计原理，结合负离子电场腌制工艺，选择场强、腌制温度和腌制时间3个因素为自变量，以腌制肉的氧合肌红蛋白含量的结果为响应值，设计3因素3水平试验，见表1。所有测定试验重复3次，实验结果取平均值。
1.4 数据分析
所有试验处理重复3次取平均值，数据采用SPSS 18.0和Excel进行分析，采用Box-Behnken法进行差异显著性分析，P<0.05。应用Origin 8.0软件作图。
表1 Box-Behnken设计因素水平表
Table 1 Variables and levels used in Box-Behnken design
水平因素A(腌制场强)/kVB(腌制时间)/hC(腌制温度)/℃-111140312615138
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 腌制温度对腌肉中肌红蛋白相关色素的影响
不同腌制温度对腌肉中肌红蛋白相关色素的影响如图1所示。
图1 腌制温度对腌肉中肌红蛋白相关色素的影响
Fig.1 Effect of different pickling temperature on myoglobin related pigment in cured meat
肉制品的颜色是评价肉的重要指标，肉制品的颜色主要由肉中的脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白和高铁肌红蛋白含量决定，在一定范围内氧合肌红蛋白含量越高肉的色泽越鲜红，相反高铁肌红蛋白含量越低肉的色泽越鲜红[15-16]。由图1可知，氧合肌红蛋白含量随着温度的升高先增加后减小，在4 ℃时达到最大值，高铁肌红蛋白含量随着腌制温度呈减小趋势；相反，脱氧肌红蛋白的含量随着腌制温度的升高呈增加趋势。综合比较腌制后6 ℃时肉的颜色与新鲜原料肉的颜色最接近，所以将6 ℃确定为腌制效果最佳温度。因此选择腌制温度4、6、8 ℃进行响应面实验。
2.1.2 腌制时间对腌肉中肌红蛋白相关色素的影响
不同腌制时间对腌肉中肌红蛋白相关色素的影响如图2所示。
图2 腌制时间对腌肉中肌红蛋白相关色素的影响
Fig.2 Effect of different pickling time on myoglobin related pigment in cured meat
随着腌制时间的延长氧合肌红蛋白含量和脱氧肌红蛋白含量整体呈先增加后减小的趋势；氧合肌红蛋白含量增加是因为肉在腌制过程中，肌红蛋白和亚硝酸盐发生一系列的反应生成亚硝基肌红蛋白，使肉呈鲜红色其含量增加；在11～12 h时，氧合肌红蛋白含量减小而脱氧肌红蛋白增加，这是因为密闭容器内的氧分逐渐减少，使氧合肌红蛋白脱氧转化为脱氧肌红蛋白[17]；相反，高铁肌红蛋白的含量呈先减小后增加的趋势，在12 h达到最小值之后逐渐增大，其原因是腌制过程亚硝基肌红蛋白并不稳定，较长的腌制时间导致其被逐渐氧化成高铁肌红蛋白，使肉的表面逐渐变暗[18]。综合比较3种肌红蛋白相关量的趋势，在腌制时间为12 h时，氧合肌红蛋白含量最较高，腌制效果最好。因此选择腌制时间11、12、13 h进行响应面实验。
2.1.3 负离子场强对腌肉中肌红蛋白相关色素的影响
不同场强对腌肉中肌红蛋白相关色素的影响如图3所示。
图3 不同场强对腌肉肌红蛋白相关色素的影响
Fig.3 Effect of different field strength on the amount of marinade myoglobin
由图3可知，在负离子电场腌制条件下，脱氧肌红蛋白和氧合肌红蛋白的含量随着场强的增加先增加后减小，在3 kV时达到最大值，分别为34.328%、18.075%；高铁肌红蛋白含量随着负离子电场强度的增加而呈先减小后增加趋势，在3 kV时达到最小，脱氧肌红蛋白和氧合肌红蛋白含量在3 kV后降低原因是过高的场强处理后加快氧合肌红蛋白氧化成高铁肌红蛋白[19]。另外，亚铁血红素被代替或分离造成球蛋白分子部分变性，铁原子的释放使卟啉环被修饰(铁原子的释放可以促进其氧化，而且与球蛋白的变性有关) 等都能造成肌肉颜色的改变[20]。综合比较，场强为3 kV时，鲜红色的氧合肌红蛋白含量最高，且最不理想的褐色高铁肌红蛋白含量最低，所以选择场强为1、3、5 kV进行响应面试验。
2.2 负离子电场腌制响应面法优化分析
2.2.1 响应面法试验结果分析
根据Box-Behnken中心设计原理，在单因素试验的基础上，选取影响较大的因素，以腌制场强(A)、腌制时间(B)、腌制温度(C)为自变量，以腌制后氧合肌红蛋白作为响应值设计响应面实验(表2)。
通过软件Design-Expert分析，得到的关于负离子电场腌制对羊肉氧合肌红蛋白的回归方程如下：
Y=20.35+0.29A+0.18B+0.089C+0.055AB-2.500E-003AC-0.27BC-1.03A2-0.014B2+0.069C2
式中：A、B、C分别代表腌制场强、腌制时间和腌制温度。通过Design-Expert分析，验证回归模型及各参数的显著度、失拟项结果见表3。
表2 响应面试验设计和结果
Table 2 The design and results of response surface experiment
试验号场强腌制时间腌制温度氧合肌红蛋白含量/%110119.78201-120.8430-1-119.81401120.47500020.3611019.76700020.381-1019.439-10-119.001010-119.5911-11019.081200020.45130-1120.5014-1-1018.9715-10119.20
由表3响应面的结果可知，模型的P=0.000 2(<0.01)，表明回归模型达非常显著水平，回归方程失拟项P=0.380 3(>0.05)，失拟值差异不显著，说明所选模型成立。回归模型中一次项A、B、交互项BC和二次项A2影响极显著。复相关系数R2为98.97%，说明模型相关度很好，实验误差小。
表3 响应面方差分析表
Table 3 Analysis of variance table of regression equation
方差来源平方和自由度均方F值P显著性模型5.2690.5853.240.000 2**A0.6710.6760.720.000 6**B0.2610.2623.600.004 6**C0.06310.0635.740.062 0AB0.01210.0121.100.342AC2.500E-00512.500E-0052.276-0050.963 8BC0.2810.2825.570.003 9**A23.8913.89354.00<0.000 1**B26.981E-00416.981E-0040.0640.811 0C20.01710.0171.590.263 1残差0.05550.011失拟项0.04030.0131.770.380 3纯误差0.01527.500E-003总离差5.3214
注：**表示差异极显著(P<0.01)
2.2.2 因素间的交互作用
经Design-Expert软件所得的响应面曲线图，如图4～图6所示。等高线可以直观地反映两变量交互作用的显著程度，圆形表示两因素交互作用不显著，椭圆形表示两因素交互作用显著[21]。
图4 场强与腌制时间对氧合肌红蛋白含量 交互作用影响的响应面和等高线
Fig.4 Response surface and contour of the interaction between field strength and curing time on the content of oxygenated myoglobin
由图4可知，场强与腌制时间对氧合肌红蛋白含量交互作用显著。当腌制时间不变时，随着负离子电场强度的增加，氧合肌红蛋白含量呈先增加后减小的趋势，因此，合适的场强有利于保持肉的颜色。
图5 场强与腌制温度对氧合肌红蛋白含量 交互作用影响的响应面和等高线
Fig.5 Response surface and contour of the interaction between field strength and curing temperature on the content of oxygenated myoglobint
由图5可知，腌制温度与场强对氧合肌红蛋白的交互作用不显著，当腌制温度不变时，随着场强的增大氧合肌红蛋白的含量呈先增加后减小的趋势。
图6 腌制时间与腌制温度对氧合肌红蛋白含量 交互作用影响的响应面和等高线
Fig.6 Response surface and contour of the interaction between curing time and curing temperature on oxygenated myoglobin content
由图6可知，腌制时间与腌制温度间对氧合肌红蛋白的交互作用极显著，随着腌制时间的增大及腌制温度的提高，氧合肌红蛋白的含量呈逐渐增加趋势。只有场强、腌制时间及腌制温度适宜，氧合肌红蛋白的含量最佳，腌肉的颜色达到最理想。
2.2.3 工艺优化及验证试验
通过Design Expert分析优化，得到负离子电场腌制的最优工艺为场强3.34 kV，腌制时间13 h，腌制温度4 ℃，氧合肌红蛋白含量为20.79%。考虑到实际条件的局限性，将最优工艺参数稍作调整为腌制场强3 kV、腌制时间13 h、腌制温度4 ℃。利用更改后的工艺参数进行腌制，相同条件下重复试验3次，得到的氧合肌红蛋白含量数据平均值为(20.67±0.18)%。与预测值20.79%基本相符，说明模型可以较好地预测负离子电场腌制后羊肉中氧合肌红蛋白含量变化情况，具有实际参考价值。
3 结论
负离子电场腌制可以防止羊肉脂肪氧化，有效地保持肉的颜色。在腌制过程中，场强强度和腌制时间对羊肉氧合肌红蛋白含量有显著影响。根据Design Expert分析结果和实验得出最佳工艺条件为腌制场强3 kV、腌制时间13 h、腌制温度4 ℃，在此条件下羊肉的氧合肌红蛋白含量为20.67%，与预测值吻合。因此，优化得到的负离子电场腌制工艺参数准确可靠，具有实际意义和参考价值。
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