动物源食品是人体补充蛋白质的主要来源,生活中常见的动物源食品包括肉类、蛋类和奶类等[1-2]。近年来动物源食品中各类农药残留引起的质量安全问题被广泛关注[3],一方面,农药在农作物中使用以后,其残留可能通过食物链进入到动物源食品中[4-5];另一方面,部分农药可以直接作为动物源食品生产中的杀虫剂、消毒剂等[6],引发残留风险。因此,为保障动物源食品的质量安全,迫切需要开展动物源食品中农药残留的检测分析方法相关的研究。
液相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、分析速度快等优点,可同时测定多种农药残留,近年来被广泛应用于各类植物源和动物源食品的检测分析[7-9]。动物源食品通常包括肉类、内脏、蛋类和奶类等,其脂肪、蛋白质等营养成分含量较高,在农药残留分析时需要净化处理以减少其干扰。我国国家标准《GB/T 20772—2008 动物肌肉中461种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》等报道中使用凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography,GPC)法对样品进行净化处理[10-12],此外,固相萃取(solid phase extraction,SPE)法[13-15]、QuEChERS法[16-18]在动物源食品检测中也表现出很好的净化效果。
噻菌灵(thiabendazole)属苯咪唑类杀菌剂,是一种内吸性植物杀菌剂[19],也是动物生长中的广谱性抗寄生虫药[20-21]。本实验选择噻菌灵及其代谢物5-羟基噻菌灵(5-hydroxythiabendazole),分子结构式见图1。对比研究GPC、SPE和QuEChERS 3种净化方法在猪肉、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉中的净化效果,为动物源食品的前处理方法提供技术支持。
图1 噻菌灵和5-羟基噻菌灵的分子结构式
Fig.1 Molecular of thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole
实验仪器:超高压液相色谱系统,Waters公司;AB SCIEX API4000+质谱系统,AB公司;ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)Waters公司;GPC VARIO凝胶渗透色谱仪,德国LCTech;高速匀浆机,IKA公司;多管旋涡混合器,北京同德创业科技公司;高速离心机,日本日立公司;旋涡混合仪,上海沪西分析仪器厂。
实验用水均为超纯水,Millipore,USA公司;乙腈、甲醇(色谱纯),Fisher Scientific试剂公司;PSA吸附剂(N-丙基乙二胺,分析纯),Biocomma公司;C18吸附剂(40~63 μm),上海Anpel公司;NaCl、无水MgSO4(分析纯),广州化学试剂厂。
噻菌灵和5-羟基噻菌灵农药标准品,购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。
猪肉(瘦肉)、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉,均购自海口本地市场,猪肉、猪肝和鸡肉使用绞肉机粉碎,鸡蛋使用匀浆机搅匀,制成待测样。
1.2.1 样品的提取
准确称取猪肉、鸡蛋、牛奶、猪肝或鸡肉样品各5.00 g(精确到0.01 g)放入50 mL离心管中,加入25.0 mL乙腈溶剂进行提取,使用高速匀浆机在15 000 r/min下匀浆1 min。为降低样品中的蛋白质等杂质的影响,在样品中再加入2~3 g NaCl,继续在15 000 r/min下匀浆1 min。将离心管在4 000 r/min下离心5 min,使液体和固体相完全分离,同时使有机相与水相分层,取上层乙腈相溶液待净化。
1.2.2 样品的净化
(1)GPC法
取10 mL乙腈提取液在50 ℃减压蒸干,用乙酸乙酯+环己烷(体积比1∶1)溶液定容至5 mL,使用GPC净化。GPC选择Bio-BeadsS-X3(38~75 μm)作为填料,规格为400 mm×25 mm;使用乙酸乙酯+环己烷(体积比1∶1)作为流动相,流速为5 mL/min;淋洗的预冲时间为15 min,收集时间为10 min。GPC样品在收集后,于50 ℃减压蒸干,用乙腈溶液定容至10.0 mL溶解后,过0.22 μm微孔有机滤膜后上机测定。
(2)SPE法
取5 mL乙腈提取液在50 ℃减压蒸干,用固相萃取小柱进行净化。分别用100 mg的C18吸附剂和100 mg的PSA吸附剂装填固相萃取小柱,并在上下方别装入250 mg无水MgSO4吸水。分别用5 mL超纯水和5 mL甲醇活化萃取小柱,用2 mL甲醇溶解样品后上样,用10 mL甲醇溶液分3次进行淋洗。收集淋洗液在50 ℃减压蒸干,用乙腈溶液定容至5.0 mL,过0.22 μm微孔有机滤膜后上机测定。
(3)QuEChERS法
取5 mL乙腈提取液于25 mL离心管中,依次加入500 mg的无水MgSO4去除样品中的水分,同时加入100 mg的C18吸附剂和100 mg的PSA吸附剂进行协助净化。剧烈旋涡振荡2 min,将离心管在4 000 r/min转速下离心5 min,取乙腈相溶液过0.22 μm微孔有机滤膜后上机测定。
1.2.3 仪器分析条件
色谱条件:超高压液相色谱柱选择ACQUITY UPLC®BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),柱温设置为25 ℃。流动相分别为乙腈(A)和0.05%甲酸水溶液(B),流速为0.25 mL/min,以梯度洗脱模式对目标物进行洗脱,确保噻菌灵及5-羟基噻菌灵得到良好分离。洗脱程序:0~1 min,10%A变为60%A;1~3.5 min,60%A变为75%A;3.5~4.0 min,保持75%A;4.0~4.5 min,75%A变为10%A;4.5~5.0 min,保持10%A。
质谱条件:选择电喷雾质谱的正离子扫描和多反应监测模式,仪器的喷雾电压为5 000 V,雾化气压力为379.225 kPa,离子源温度为550 ℃。同时监测噻菌灵和5-羟基噻菌灵,定性、定量离子对及去簇电压、碰撞电压见表1。
表1 噻菌灵与5-羟基噻菌灵的主要质谱参数
Table 1 Working parameter of MS for thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole
化合物保留时间/min定性离子对定量离子对去簇电压/V碰撞电压/V噻菌灵1.59202.1/175.1202.1/175.110034.5202.1/131.143.55-羟基噻菌灵1.39218.1/147.0218.1/147.010044.6218.1/191.035.5
以质量浓度1 000 μg/mL的噻菌灵与5-羟基噻菌灵标准溶液作为母液,使用甲醇逐级稀释法分别配制0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 μg/mL系列标准溶液,以进样标准溶液中目标物的质量浓度(μg/mL)作为横坐标X,以定量离子的峰面积作为纵坐标Y,绘制标准曲线,外标法进行定量。方法的典型色谱图见图2,线性回归方程等相关数据见表2。为保证3种净化方法的可比性,在相同的提取体积和样品稀释倍数下,噻菌灵与5-羟基噻菌灵的定量限[limit of quantitaion(LOQ),S/N=10]分别为0.002和0.01 mg/kg。我国食品质量安全国家标准GB 2763—2019中规定动物源性食品中噻菌灵的残留定义为噻菌灵与5-羟基噻菌灵之和,其中最大残留限量值的最低值为0.05 mg/kg(禽肉类),最高值为1 mg/kg(牛肾),本方法可满足其检测分析的需求。
表2 噻菌灵与5-羟基噻菌灵的线性回归方程和定量限
Table 2 Standard curves and LOQs of thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole
化合物线性回归方程相关系数LOQ/(mg·kg-1)噻菌灵Y=1.86×108X+4.18×1060.9990.0025-羟基噻菌灵Y=1.01×108X+5.28×1060.9990.01
a-1、a-2、a-3、a-4、a-5:噻菌灵在猪肉、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉样品中的加标 回收色谱图,b-1、b-2、b-3、b-4、b-5:5-羟基噻菌灵在猪肉、鸡蛋、牛奶、 猪肝和鸡肉样品中的加标回收色谱图,加标量均为0.01 mg/kg
图2 噻菌灵与5-羟基噻菌灵的典型色谱图
Fig.2 Typical chromatogram of thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole
本实验选择GPC法、SPE法和QuEChERS法3种净化方法,其中GPC按照国家标准(GBT 20772—2008),使用Bio-BeadsS-X3填料,依靠分子质量(400~14 000)排阻层析,可以很好地去除脂肪等杂质。在SPE和QuEChERS 2种净化方法中,本实验对比了PSA、C18对样品的净化效果,实验结果见图3。可以看出,在均使用无水MgSO4的情况下,SPE和QuEChERS两种净化方法选择PSA与C18协助净化的效果优于单独使用PSA或C18,且样品上机液清透明亮,可以很好地保证噻菌灵和代谢物5-羟基噻菌灵的净化效果,有效避免仪器污染,其原因可能是动物源样品通常含有大量脂肪、蛋白质及非极性磷脂类干扰物等杂质,给噻菌灵及其代谢物带来干扰。C18吸附剂在硅胶上键合了十八烷基官能团,对非极性干扰物具有较好去除效果,PSA吸附剂在硅胶上键合了乙二胺-N-丙基官能团,可吸附酸性化合物[22]。当只使用PSA或C18,样品中杂质的净化效果较差,引起目标化合物回收率偏低。将C18和PSA混合使用,在SPE和QuEChERS两种方法均表现出较好的净化效果。但是与SPE法相比,QuEChERS法不需要额外装填萃取小柱,快速、简捷,回收率达到要求,可用于动物源食品中农药残留分析的快速净化处理。
以不含噻菌灵和5-羟基噻菌灵的猪肉、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉空白样品,分别在0.01、0.05和1.0 mg/kg 3个质量浓度进行添加回收率实验,测试GPC法、SPE法和QuEChERS法3种净化方法的准确度,实验结果见表3。GPC法在实验的3个浓度时,5次重复的平均回收率为80%~108%;SPE法在实验的3个浓度时,5次重复的平均回收率80%~110%;QuEChERS法在实验的3个浓度时,5次重复的平均回收率82%~107%。我国农业行业标准NY/T 788—2018农作物中农药残留试验准则中规定,添加水平在0.01、0.05和1.0 mg/kg时,回收率应分别为60%~120%、70%~120%和70%~110%。本实验3种净化方法对噻菌灵和5-羟基噻菌灵的添加回收率均满足要求。
a-SPE法;b-QuEChERS法
图3 SPE和QuEChERS使用不同吸附剂对比图
Fig.3 Comparison of Purification between SPE and QuEChERS with different adsorbents
表3 噻菌灵与5-羟基噻菌灵在五种动物源食品中的添加回收率及相对标准偏差(n=5)
Table 3 Recoveries and RSDs of thiabendazole and 5-hydroxythiabendazole in 5 food products of animal origin (n=5)
样品化合物平均回收率/%GPCSPEQuEChERS0.01 mg/kg0.05 mg/kg1.0 mg/kg0.01 mg/kg0.05 mg/kg1.0 mg/kg0.01 mg/kg0.05 mg/kg1.0 mg/kg猪肉噻菌灵94±2.984±2.993±4.891±5.992±5.889±4.5105±2.197±1.894±7.55-羟基噻菌灵101±4.090±7.5102±4.399±4.9107±1.484±6.495±4.894±4.0104±4.9鸡蛋噻菌灵101±8.995±8.795±3.097±5.485±1.899±8.788±2.794±6.3103±7.15-羟基噻菌灵80±2.396±3.796±8.488±7.887±1.799±1.5100±3.989±2.783±8.4牛奶噻菌灵95±2.094±3.287±2.0109±3.588±2.7108±8.584±7.596±1.193±1.55-羟基噻菌灵108±2.7101±1.6107±6.4110±2.886±2.793±4.2100±4.3101±1.986±4.7猪肝噻菌灵94±7.982±3.381±2.8101±4.180±5.093±7.084±4.1104±4.2107±1.55-羟基噻菌灵91±5.094±1.382±2.387±8.1105±5.995±2.5106±3.388±7.588±5.4鸡肉噻菌灵98±6.395±7.5105±6.794±1.392±6.891±4.582±4.383±5.285±4.25-羟基噻菌灵86±4.088±5.887±2.9102±7.085±8.080±6.191±5.4103±6.987±2.9
为了验证方法在实际样品分析中的适用性,本实验在海口本地市场抽取的猪肉、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉样品各30个,使用GPC法、SPE法和QuEChERS法3种净化方法进行前处理,并分别配制5种样品的基质标准溶液进行检测,所有样品中均未检出噻菌灵和5-羟基噻菌灵。方法具有良好的灵敏度和的重现性,可满足市场样品检测需求。
动物源食品含有大量的脂肪等杂质,尤其是对于猪背膘、猪腩等部位,其脂肪含量可达50%以上,在前处理的净化过程需要进行脱脂及去除其他干扰杂质[23]。本实验中主要测试的样品为猪瘦肉、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉,脂肪含量较低,PSA与C18协助净化可以达到较好的效果,因此在提取后直接使用GPC法、SPE法和QuEChERS法3种净化方法处理。同时,在保证分析方法灵敏度满足需求的情况下,上机液的定容使用较大体积的溶剂,避免因浓缩带来的杂质干扰,大大简化了前处理过程,提高了分析效率。此外,当遇到猪背膘等脂肪含量高的动物源样品,可在提取时加入正己烷进行除油,其对本实验中的非脂溶性农药噻菌灵的提取率影响较小,但对于其它脂溶性农药可能会造成回收率偏低,其影响有待进一步研究。
本实验对比研究GPC法、SPE法和QuEChERS法3种净化方法在猪肉、鸡蛋、牛奶、猪肝和鸡肉等动物源食品中噻菌灵及其代谢物残留测定的净化效果。其中GPC法使用Bio-BeadsS-X3填料,SPE法和QuEChERS使用PSA与C18吸附剂协助净化,3种净化方法在样品分析时的回收率均满足要求。考虑到GPC法和SPE法需要特定的仪器或固相萃取柱,耗时费力,推荐使用快速、简捷的QuEChERS方法进行处理,可用作噻菌灵在动物源食品中的检测分析。
[1] 谢云峰,王浩,刘佟,等.在线固相萃取-高效液相色谱联用测定动物源食品中的维生素A、E[J].分析化学, 2014, 42(9):1 343-1 347.
XIE Y F, WANG H, LIU T, et al.Fast analysis of vitamin a and e in animal derived foods by on-line solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatography [J].Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2014, 42(9), 1 343-1 347.
[2] 韩丙军,林冰,黄海珠,等.超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中螺虫乙酯及其代谢物残留[J].食品科技, 2017, 42(12):297-302.
HAN B J, LIN B, HUANG H Z, et al.Determination of spirotetramat and its major metabolites in food products of animal origin using ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Food Science and Technology, 2017, 42(12):297-302.
[3] 舒小桂,张媚玉,贺利民.食品中拟除虫菊酯类农药残留检测前处理技术研究进展[J].食品安全质量检测学报, 2019, 10(18):6 157-6 164.
SHU X G, ZHANG M Y, HE L M.Advances in pretreatment of pyrethroid residues in foodstuffs [J].Journal of Food Safety and Quality, 2019, 10(18):6 157-6 164.
[4] 孙雪,郗存显,唐柏彬,等.复合免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中6种黄曲霉毒素和6种玉米赤霉醇类真菌毒素残留量[J].分析化学, 2016, 44(6):970-978.
SUN X, XI C X, TANG B B, et al.Determination of aflatoxins and zeranols in animal-originated foods by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry combined with immunoaffinity clean-up column [J].Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2016, 44(6):970-978.
[5] 宓捷波,张然,王飞,等.在线固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中阿维菌素和伊维菌素的残留量[J].理化检验(化学分册), 2017, 53(9):1 009-1013.
MI J B, ZHANG R, WANG F, et al.Determination of avermectin and ivermectin residues in animal origin foods by LC-MS/MS coupled with online solid phase extraction [J].Physical Testing and Chemical Analysis(Part B:Chemical Analysis), 2017, 53(9):1 009-1 013.
[6] 刘永涛,何雅静,房金岑,等.动物源性水产品中兽药残留限量标准现状及对比分析[J].中国渔业质量与标准, 2019, 9(6):1-17.
LIU Y T, HE Y J, FANG J C, et al.Current situations and comparative analysis of veterinary medicine on maximum residue limits in animal-derived aquatic products between China and other countries [J].Chinese Fishery Quality and Standards, 2019, 9(6):1-17.
[7] 黄坤,范小龙,曹琦,等.QuEChERS-超高效液相色谱串联质谱法快速测定禽蛋中7种喹诺酮类兽药残留[J].食品与发酵工业, 2019, 45(16):261-265.
HUANG K, FAN X L, CAO Q, et al.Rapid determination of 7 quinolone residues in poultry eggs using QuEChERS and ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J].Food and Fermentation Industries, 2019, 45(16):261-265.
[8] 田金凤,尚远宏.QuEChERS净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定凯特芒果中14种农药残留[J].食品与发酵工业, 2020, 46(9):272-277.
TIAN J F, SHANG Y H.Determination of fourteen kinds of pesticide residues in Kaite mango by QuEChERS with UPLC-MS/MS [J].Food and Fermentation Industries, 2020, 46(9):272-277.
[9] 毕思远,曹建涛,李保玲,等.QuEChERS-气相色谱分析厦门海域鱼体中有机氯类农药残留特征及风险评价[J].食品与发酵工业, 2019, 45(21):229-235.
BI S Y, CAO J T, LI B L, et al.Determination and risk assessment of organochlorine pesticides in marine fish from Xiamen sea area by QuEChERS combined with gas chromatography [J].Food and Fermentation Industries, 2019, 45(21):229-235.
[10] 李佩佩,郭远明,张小军,等.高效液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中同化激素的研究进展[J].理化检验(化学分册),2014,50(11):1 476-1 480.
LI P P, GUO Y M, ZHANG X J, et al.Recent advances of researches on HPLC-MS/MS determination of anabolic hormones in animal origin- food [J].Physical Testing and Chemical Analysis(Part B:Chemical Analysis), 2014, 50(11):1 476-1 480.
[11] 郑必胜,唐芳勇,何禄英,等.凝胶渗透色谱法表征广东虫草多糖柱层析分离纯化效果的研究[J].食品科技, 2009, 34(5):298-303.
ZHENG B S, TANG F Y, HE L Y, et al.Study on the effect of column chromatography on the purification of cordyceps guangdongensis polysaccharide by GPC [J].Food Science and Technology, 2009, 34(5):298-303.
[12] 吕飞,李华东,叶英,等.建立同时快速测定动物源性食品中17种农药的在线凝胶渗透色谱-气相色谱质谱联用法[J].中国食品卫生杂志, 2016, 28(1):69-75.
LYU F, LI H D, YE Y, et al.Establishment of a method for the simultaneous and rapid detection of 17 pesticide residues in animal derived foods using on-line GPC-GC-MS [J].Chinese Journal of Food Hygiene, 2016, 28(1):69-75.
[13] 徐晨,张双,白素琴,等.分散固相萃取与气相色谱联合测定原料乳中19种有机氯农药残留[J].食品科技, 2019, 44(6):341-346.
XU C, ZHANG S, BAI S Q, et al.Determination of 19 organochlorine pesticide residues in raw milk by dispersive solid phase extraction using gas chromatography[J].Food Science and Technology, 2019, 44(6):341-346.
[14] 宓捷波,张敏,柴铭骏,等.亲水作用色谱-串联质谱法测定动物源食品中10种氨基糖苷类药物的残留量[J].食品研究与开发, 2019, 40(19):197-204.
MI J B, ZHANG M, CHAI M J, et al.Determination of ten kinds of aminoglycosides residues in animal original food using hydrophilic interaction chromatography tandem mass spectrometry [J].Food Research and Development, 2019, 40(19):197-204.
[15] 任召珍,刘志敏,徐娜,等.LC-MS/MS测定动物源食品中10种β-内酰胺类抗生素残留[J].食品工业, 2018, 39(9):284-287.
REN Z Z, LIU Z M, XU N, et al.Residue analysis of 10 kinds of β-lactams in animal source foods by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry [J].the Food Industry, 2018, 39(9):284-287.
[16] 黄胜广,赵卉,王玉方,等.QuEChERS结合超高效液相色谱-串联质谱法同时测定梅花鹿鹿茸中18种磺胺[J].食品与发酵工业,2019,45(24):223-228.
HUANG S G, ZHAO H, WANG Y F, et al.Determination of 18 kinds of sulfonamides in antler velvet of cervus nippon temminck by QuEChERS /UPLC-MS /MS [J].Food and Fermentation Industries, 2019,45(24):223-228.
[17] 夏虹,彭茂民,刘丽.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定柑橘中12种植物生长调节剂残留[J].食品科技, 2018, 43(10):340-344.
XIA H, PENG M M, LIU L.Using QuEChERS method to determine twelve plant growth regulator residues in orange by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry[J].Food Science and Technology, 2018, 43(10):340-344.
[18] 王培锋,王凤美,张鸿伟,等.高效液相色谱-四极杆轨道阱高分辨质谱对动物源食品中抗生素类成分的快速筛查[J].食品安全质量检测学报, 2014, 5(12):3 769-3 777.
WANG P F, WANG F M, ZHANG H W, et al.Screening of antibiotics in foodstuffs of animal origin by high performance liquid chromatography-quadrurpole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry [J].Journal of Food Safety and Quality, 2014, 5(12):3 769-3 777.
[19] 杨石有,周慧珍,王娟,等.芒果炭疽病菌对噻菌灵的敏感性测定[J].现代农药, 2014, 13(6):44-47.
YANG S Y, ZHOU H Z, WANG J, et al.Sensitivity bioassay of mango anthracnose to thiabendazole[J].Modern Agrochemicals, 2014, 13(6):44-47.
[20] IGUAL-ADELL R, OLTRA-ALCARAZ C, SOLER-COMPANY E, et al.Efficacy and safety of ivermectin and thiabendazole in the treatment of strongyloidiasis[J].Expert Opinion on Pharmacotherapy, 2004, 5(12):2 615-2 619.
[21] PORTUGAL R, SCHAFFEL R, ALMEIDA L, et al.Thiabendazole for the prophylaxis of strongyloidiasis in immunosuppressed patients with hematological diseases:A randomized double-blind placebo-controlled study[J].Haematologica, 2003(6):663-664.
[22] 王连珠,方恩华,王彩娟,等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中痕量五氯酚及其钠盐[J].色谱, 2018, 36(6):518-522.
WANG L Z, FANG E H, WANG C J, et al.Determination of trace pentachlorophenol and its sodium salt in animal-origin foods by QuEChERS-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J].Chinese Journal of Chromatography, 2018, 36(6):518-522.
[23] 周迎春,刘少博,韩海涛,等.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定动物源食品中万古霉素残留量[J].肉类研究, 2018, 32(4):56-61.
ZHOU Y C, LIU S B, HAN H T, et al.Rapid determination of vancomycin residues in animal-origin foods by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].China Meat Research Center, 2018, 32(4):56-61.