急性肺损伤(acute lung injury, ALI)属于一种病理性损伤，是急性呼吸衰竭最常见的病因，表现为炎症因子释放、炎症细胞迁移以及肺间质水肿[1-2]。然而，目前ALI的有效治疗药物很少。因此，我们不得不重视研究其可能的分子机制以及更有效的治疗方法。病理状态下，内毒素可诱导机体炎症反应的发生，其中脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作为其有效成分起主要作用。在ALI的一些动物模型中，LPS常被用来诱发肺部炎症，通过结合膜表面Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)在免疫系统中发挥重要作用[3]。因此，本研究选用LPS诱导大鼠ALI模型。LPS可通过细胞膜表面TLR4受体，激活PI3K/Akt及NF-κB信号通路，最终促进炎症相关因子(如TNF-α、IL-1β以及IL-6等)的释放，参与ALI过程[4-5]。
榛蘑，学名蜜环菌(Armillaria mellea)，属担子菌亚门、白蘑科、蜜环菌属，主要分布于我国东北地区，其具有食用性以及多种药理活性，包括抗凋亡[6]，保护内皮细胞[7]、抗血栓[8]、抗炎[9]、抗氧化[10]等功能。本研究以LPS作为诱导剂，建立大鼠ALI模型，探讨榛蘑粗多糖对于LPS造成的ALI的抑制作用及其机制，为阐明其抗炎机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 药材与试剂
榛蘑于长白山采集，而榛蘑粗多糖为提取物；乌拉坦(麻醉剂)，购于Gibco公司；p-PI3K抗体、p-Akt抗体、p-NF-κB p65抗体和Lamin B抗体，购自美国Abcam公司；I-κB抗体，购自美国CST公司；LPS、β-actin 抗体、二抗(羊抗鼠IgG-HRP)、二抗(羊抗兔 IgG-HRP)，购自美国Sigma公司；内皮素-1(endothelin-1, ET-1)、血栓调节蛋白(thrombomodulin, TM)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)以及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)试剂盒，购自上海研谨生物科技有限公司；核蛋白提取试剂盒与全蛋白提取试剂盒，购于Solarbio公司。
1.2 实验动物
SD大鼠(清洁级)35只，体重范围为(200±20)g，其合格证书编号为SCXK(吉)2011-0007，本校实验动物中心提供。
1.3 仪器与设备
RT-2100型酶标仪，购自美国Bio-Tek公司；GelDoc XR凝胶成像仪，购自美国Bio-Rad公司；BX53F显微镜，购自日本OLYMPUS 株式会社。
1.4 实验方法
1.4.1 榛蘑粗多糖的制备
野生棒蘑被烘干后，使用热水浴浸提，过滤残渣，将残渣在热水浴中加热浓缩，加入无水乙醇使其完全沉淀，反复洗涤，最终干燥后得到榛蘑粗多糖，产率为2.2%[11]。
1.4.2 动物分组及处理
本实验将大鼠随机分组，共5组，分别为正常对照组、模型组(LPS 20 mg/kg)、阳性对照组(LPS+地塞米松5 mg/kg)、榛蘑粗多糖低、高剂量组(200、400 mg/kg)。榛蘑粗多糖组分别按200、400 mg/kg体质量灌胃，其余3组均以等体积的生理盐水灌胃。第10天，将鼠禁食24 h。次日，将阳性对照组的大鼠以5 mg/kg体质量腹腔注射地塞米松，2 h后，除正常对照组，其他各组大鼠以20 mg/kg体质量注射LPS诱导ALI，正常对照组以等体积的生理盐水注射。LPS损伤6 h后，将大鼠用20%乌拉坦麻醉，仰卧位固定，采血并取出肺组织，用于血清学指标检测、Western bolt实验以及肺组织病理形态学观察。
1.4.3 肺组织形态学观察
使用4%多聚甲醛固定大鼠肺组织，经无水乙醇脱水、石蜡包埋和切片等操作步骤后，使用苏木素-伊红(HE)染色。于显微镜下观察其结构变化。
1.4.4 血清学指标检测
全血置于常温30 min以上，以4 000 r/min转速离心10 min，按ELISA试剂盒操作步骤进行ET-1、TM、IL-6以及TNF-α水平的检测。
1.4.5 Western bolt法
提取肺组织总蛋白，作为检测p-PI3K、p-Akt以及I-κB指标的样品；提取肺组织核蛋白，用于检测p-NF-κB p65 表达水平。
将上述2种蛋白分别进行BCA蛋白定量。在5×上样缓冲液中95 ℃煮沸10 min后，取50 μg蛋白质样品分别进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将转膜后的PVDF以5%脱脂牛奶封闭液封闭 1 h，1 h后用TBST缓冲液(含有tris-buffered，saline和吐温20三种物质)洗涤3次，每次至少5 min，之后以相应的一抗在4 ℃孵育过夜。第2天再次用TBST洗涤，二抗于常温孵育2 h，用凝胶成像仪进行分析。
1.4.6 统计学分析
试验数据用平均数±标准差(x±SD)表示，使用SPSS 20.0统计学软件对数据进行单因素方差统计分析，P<0.05表示差异具有显著意义。
2 结果与分析
2.1 大鼠肺组织形态学观察
HE染色法观察了榛蘑粗多糖对肺组织病理损伤的影响。如图1所示，正常对照组大鼠肺组织未见微血栓形成，肺泡以及肺间质的结构较为完整。经LPS损伤后模型组肺泡结构被破坏，肺泡壁充血以及增厚，肺血管周围可见大量炎症细胞浸润，并观察到微血栓形成。榛蘑粗多糖高剂量组肺泡和肺间质结构趋于恢复正常，未见炎症细胞的过度浸润和血栓的形成。这就提示，榛蘑粗多糖可以减轻LPS引起的肺组织的病理损伤。
a-正常对照组；b-模型组；c-阴性对照组； d-榛蘑粗多糖高剂量组
图1 大鼠肺组织形态学观察(×100)
Fig.1 Morphological observation of lung tissue in rats
2.2 血清中TNF-α与IL-6水平的检测
与正常对照组相比，模型组中TNF-α和IL-6的含量明显增多(P<0.01)，说明LPS作用后可引起炎症因子的释放。与模型组相比，阳性对照组和榛蘑粗多糖高剂量组中TNF-α和IL-6的含量显著减少(P<0.05)。这就提示，地塞米松和榛蘑粗多糖可抑制LPS所致的TNF-α和IL-6水平的升高。与阳性对照组相比，榛蘑粗多糖低剂量组中TNF-α和IL-6的含量有显著差异(P<0.05)，见表1。
表1 血清中TNF-α与IL-6水平的检测
Table 1 Detection of TNF-α and IL-6 in serum
分组TNF-α/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)正常对照组1.6±1.2*##2.8±1.1*##模型组11.2±2.3**7.4±1.2**阳性对照组3.4±1.3##4.2±1.8##榛蘑粗多糖低剂量组7.7±2.2*6.3±1.6*榛蘑粗多糖高剂量组4.6±1.9##5.3±1.6#
注：与模型组相比，#表示差异显著(P<0.05)，##表示差异极显著(P<0.01)；与阳性对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01) (下同)
2.3 血清中TM与ET-1水平的检测
如表2所示，与正常对照组相比，模型组中血栓调节蛋白(TM)和内皮素-1(ET-1)明显增多(P<0.01)，说明LPS作用后引起内皮细胞的损伤；与模型组相比，阳性对照组和榛蘑粗多糖低、高剂量组中TM和ET-1的水平显著下降(P<0.05)，这就说明地塞米松和榛蘑粗多糖可以减少LPS对内皮细胞的损伤。与阳性对照组相比，榛蘑粗多糖低剂量组中TM和ET-1的含量有显著差异(P<0.05)
表2 血清中TM与ET-1水平的检测
Table 2 Detection of TM and ET-1 in serum
分组TM/(μg·L-1)ET-1/(ng·L-1)正常对照组1.7±0.3##1.5±0.8##模型组3.5±0.6**8.7±1.4**阳性对照组1.8±0.2##2.4±0.7##榛蘑粗多糖低剂量组2.3±0.4*#6.1±1.4*#榛蘑粗多糖高剂量组2.0±0.1#2.4±1.3##
2.4 大鼠肺组织中I-κB蛋白表达以及p-PI3K与p-Akt蛋白水平的检测
为了分析榛蘑粗多糖对LPS所致的ALI的作用机制，我们观察了其对p-PI3K、p-Akt以及I-κB水平的影响。如图2所示，与正常对照组相比，模型组中p-PI3K和p-Akt水平明显升高，I-κB蛋白的表达显著减少(P<0.01)，说明LPS作用后可引起PI3K/Akt信号通路相关蛋白的激活；与模型组相比，榛蘑粗多糖低剂量组中p-Akt蛋白水平明显降低，I-κB蛋白的表达明显增多(P<0.01)，阳性对照组和榛蘑粗多糖高剂量组中p-PI3K和p-Akt水平显著降低，I-κB蛋白的表达明显增多(P<0.01)。这就说明，地塞米松和榛蘑粗多糖抑制了LPS所致的PI3K/Akt信号通路的激活。与阳性对照组相比，榛蘑粗多糖低剂量组中p-PI3K、p-Akt以及I-κB的水平有显著差异(P<0.05)。
A-正常对照组;B-模型组;C-阳性对照组;D-榛蘑粗多糖低剂量组; E-榛蘑粗多糖高剂量组(下同)
图2 I-κB蛋白表达以及PI3K和Akt蛋白磷酸化水平
Fig.2 The expression of I-κB protein and the phosphorylation level of PI3K and Akt
2.5 大鼠肺组织细胞核中p-NF-κB p65水平的检测
如图3所示：与正常对照组相比，模型组中胞核p-NF-κB p65水平明显升高(P<0.01)，说明LPS作用后可引起NF-κB p65活化；与模型组相比，阳性对照组和榛蘑粗多糖低、高剂量组中p-NF-κB p65水平明显降低(P<0.01)。说明地塞米松和榛蘑粗多糖抑制了NF-κB p65的磷酸化水平。与阳性对照组相比，榛蘑粗多糖低剂量组中p-NF-κB p65的水平有显著差异(P<0.01)。
图3 胞核NF-κB p65的磷酸化水平
Fig.3 The phosphorylation level of NF-κB P65 in nucleus
3 讨论与结论
ALI是一种炎症反应造成的肺组织病理性损伤[12]，其特征为炎症相关介质的释放(如TNF-α、IL-1以及IL-6等)、中性粒细胞过度迁移以及细胞毒性介质的释放[13]。LPS作为细菌外膜的重要组成部分，会对宿主造成损害，包括炎症反应和对组织器官的损伤[14-15]。因此，本实验以LPS作为诱导剂来建立ALI模型。已有研究证明，地塞米松具有明确的抗炎作用，可以改善呼吸氧合功能，减轻LPS引起的大鼠ALI[16]。所以，本实验选择地塞米松作为阳性药物。LPS结合细胞膜上的特异受体，如CD14和TLR4，引发免疫应答。这些受体激活后可引起核转录因子NF-κB p65活化，而NF-κB p65活化后可进一步促进炎症因子(如TNF-α或IL-6)的合成和释放。研究表明，PI3K/Akt通路可调节肺部炎症中细胞存活以及氧化应激，参与ALI过程[4]。
TNF-α与IL-6是炎症过程中重要的细胞因子，参与ALI的炎症反应[17-18]。在LPS诱导的ALI过程中，这些细胞因子可诱导炎症细胞的浸润，加速其病理改变并放大炎症反应[19]。ET-1和TM作为内皮细胞损伤的指标，在ALI时，其水平显著增高[20-21]。因此，本实验中我们同时检测了ET-1和TM的水平。实验结果表明，榛蘑粗多糖抑制了LPS所致的TNF-α、IL-6、TM以及ET-1的合成与释放，减轻了LPS引起的肺组织的病理损伤。
为了进一步探讨其作用机制，我们还检测了PI3K/Akt信号通路和NF-κB p65。NF-κB p65是基因转录的调节因子，它的激活依赖于IKK复合物。在生理状态下，I-κB与NF-κB p50/NF-κB p65结合，处于非活化状态。在多种诱因的作用下IKK复合物可被激活，促使I-κB发生磷酸化而被降解，进一步促进NF-κB p65发生核转移以及在核内的磷酸化，最终促进炎症介质的释放[22-23]。PI3K和Akt是NF-κB上游分子。研究表明，LPS通过TLR4激活PI3K/Akt信号通路，直接诱导原代培养小鼠肺细胞的炎症反应[24]。MENG等的研究结果表明，在大鼠ALI模型中，右美托咪定通过抑制PI3K/Akt信号通路对ALI起保护作用[4]，这与我们的实验结果一致。实验结果表明，榛蘑粗多糖对LPS诱导的大鼠ALI的抑制作用可能与PI3K/Akt信号通路相关。
综上所述，榛蘑粗多糖通过对PI3K/Akt信号通路的调控作用对LPS诱导的ALI起保护作用。
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