急性肺损伤(acute lung injury, ALI)属于一种病理性损伤,是急性呼吸衰竭最常见的病因,表现为炎症因子释放、炎症细胞迁移以及肺间质水肿[1-2]。然而,目前ALI的有效治疗药物很少。因此,我们不得不重视研究其可能的分子机制以及更有效的治疗方法。病理状态下,内毒素可诱导机体炎症反应的发生,其中脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作为其有效成分起主要作用。在ALI的一些动物模型中,LPS常被用来诱发肺部炎症,通过结合膜表面Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)在免疫系统中发挥重要作用[3]。因此,本研究选用LPS诱导大鼠ALI模型。LPS可通过细胞膜表面TLR4受体,激活PI3K/Akt及NF-κB信号通路,最终促进炎症相关因子(如TNF-α、IL-1β以及IL-6等)的释放,参与ALI过程[4-5]。
榛蘑,学名蜜环菌(Armillaria mellea),属担子菌亚门、白蘑科、蜜环菌属,主要分布于我国东北地区,其具有食用性以及多种药理活性,包括抗凋亡[6],保护内皮细胞[7]、抗血栓[8]、抗炎[9]、抗氧化[10]等功能。本研究以LPS作为诱导剂,建立大鼠ALI模型,探讨榛蘑粗多糖对于LPS造成的ALI的抑制作用及其机制,为阐明其抗炎机制提供理论依据。
榛蘑于长白山采集,而榛蘑粗多糖为提取物;乌拉坦(麻醉剂),购于Gibco公司;p-PI3K抗体、p-Akt抗体、p-NF-κB p65抗体和Lamin B抗体,购自美国Abcam公司;I-κB抗体,购自美国CST公司;LPS、β-actin 抗体、二抗(羊抗鼠IgG-HRP)、二抗(羊抗兔 IgG-HRP),购自美国Sigma公司;内皮素-1(endothelin-1, ET-1)、血栓调节蛋白(thrombomodulin, TM)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)以及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)试剂盒,购自上海研谨生物科技有限公司;核蛋白提取试剂盒与全蛋白提取试剂盒,购于Solarbio公司。
SD大鼠(清洁级)35只,体重范围为(200±20)g,其合格证书编号为SCXK(吉)2011-0007,本校实验动物中心提供。
RT-2100型酶标仪,购自美国Bio-Tek公司;GelDoc XR凝胶成像仪,购自美国Bio-Rad公司;BX53F显微镜,购自日本OLYMPUS 株式会社。
1.4.1 榛蘑粗多糖的制备
野生棒蘑被烘干后,使用热水浴浸提,过滤残渣,将残渣在热水浴中加热浓缩,加入无水乙醇使其完全沉淀,反复洗涤,最终干燥后得到榛蘑粗多糖,产率为2.2%[11]。
1.4.2 动物分组及处理
本实验将大鼠随机分组,共5组,分别为正常对照组、模型组(LPS 20 mg/kg)、阳性对照组(LPS+地塞米松5 mg/kg)、榛蘑粗多糖低、高剂量组(200、400 mg/kg)。榛蘑粗多糖组分别按200、400 mg/kg体质量灌胃,其余3组均以等体积的生理盐水灌胃。第10天,将鼠禁食24 h。次日,将阳性对照组的大鼠以5 mg/kg体质量腹腔注射地塞米松,2 h后,除正常对照组,其他各组大鼠以20 mg/kg体质量注射LPS诱导ALI,正常对照组以等体积的生理盐水注射。LPS损伤6 h后,将大鼠用20%乌拉坦麻醉,仰卧位固定,采血并取出肺组织,用于血清学指标检测、Western bolt实验以及肺组织病理形态学观察。
1.4.3 肺组织形态学观察
使用4%多聚甲醛固定大鼠肺组织,经无水乙醇脱水、石蜡包埋和切片等操作步骤后,使用苏木素-伊红(HE)染色。于显微镜下观察其结构变化。
1.4.4 血清学指标检测
全血置于常温30 min以上,以4 000 r/min转速离心10 min,按ELISA试剂盒操作步骤进行ET-1、TM、IL-6以及TNF-α水平的检测。
1.4.5 Western bolt法
提取肺组织总蛋白,作为检测p-PI3K、p-Akt以及I-κB指标的样品;提取肺组织核蛋白,用于检测p-NF-κB p65 表达水平。
将上述2种蛋白分别进行BCA蛋白定量。在5×上样缓冲液中95 ℃煮沸10 min后,取50 μg蛋白质样品分别进行SDS-PAGE凝胶电泳,随后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将转膜后的PVDF以5%脱脂牛奶封闭液封闭 1 h,1 h后用TBST缓冲液(含有tris-buffered,saline和吐温20三种物质)洗涤3次,每次至少5 min,之后以相应的一抗在4 ℃孵育过夜。第2天再次用TBST洗涤,二抗于常温孵育2 h,用凝胶成像仪进行分析。
1.4.6 统计学分析
试验数据用平均数±标准差(x±SD)表示,使用SPSS 20.0统计学软件对数据进行单因素方差统计分析,P<0.05表示差异具有显著意义。
HE染色法观察了榛蘑粗多糖对肺组织病理损伤的影响。如图1所示,正常对照组大鼠肺组织未见微血栓形成,肺泡以及肺间质的结构较为完整。经LPS损伤后模型组肺泡结构被破坏,肺泡壁充血以及增厚,肺血管周围可见大量炎症细胞浸润,并观察到微血栓形成。榛蘑粗多糖高剂量组肺泡和肺间质结构趋于恢复正常,未见炎症细胞的过度浸润和血栓的形成。这就提示,榛蘑粗多糖可以减轻LPS引起的肺组织的病理损伤。
a-正常对照组;b-模型组;c-阴性对照组; d-榛蘑粗多糖高剂量组
图1 大鼠肺组织形态学观察(×100)
Fig.1 Morphological observation of lung tissue in rats
与正常对照组相比,模型组中TNF-α和IL-6的含量明显增多(P<0.01),说明LPS作用后可引起炎症因子的释放。与模型组相比,阳性对照组和榛蘑粗多糖高剂量组中TNF-α和IL-6的含量显著减少(P<0.05)。这就提示,地塞米松和榛蘑粗多糖可抑制LPS所致的TNF-α和IL-6水平的升高。与阳性对照组相比,榛蘑粗多糖低剂量组中TNF-α和IL-6的含量有显著差异(P<0.05),见表1。
表1 血清中TNF-α与IL-6水平的检测
Table 1 Detection of TNF-α and IL-6 in serum
分组TNF-α/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)正常对照组1.6±1.2*##2.8±1.1*##模型组11.2±2.3**7.4±1.2**阳性对照组3.4±1.3##4.2±1.8##榛蘑粗多糖低剂量组7.7±2.2*6.3±1.6*榛蘑粗多糖高剂量组4.6±1.9##5.3±1.6#
注:与模型组相比,#表示差异显著(P<0.05),##表示差异极显著(P<0.01);与阳性对照组相比,*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01) (下同)
如表2所示,与正常对照组相比,模型组中血栓调节蛋白(TM)和内皮素-1(ET-1)明显增多(P<0.01),说明LPS作用后引起内皮细胞的损伤;与模型组相比,阳性对照组和榛蘑粗多糖低、高剂量组中TM和ET-1的水平显著下降(P<0.05),这就说明地塞米松和榛蘑粗多糖可以减少LPS对内皮细胞的损伤。与阳性对照组相比,榛蘑粗多糖低剂量组中TM和ET-1的含量有显著差异(P<0.05)
表2 血清中TM与ET-1水平的检测
Table 2 Detection of TM and ET-1 in serum
分组TM/(μg·L-1)ET-1/(ng·L-1)正常对照组1.7±0.3##1.5±0.8##模型组3.5±0.6**8.7±1.4**阳性对照组1.8±0.2##2.4±0.7##榛蘑粗多糖低剂量组2.3±0.4*#6.1±1.4*#榛蘑粗多糖高剂量组2.0±0.1#2.4±1.3##
为了分析榛蘑粗多糖对LPS所致的ALI的作用机制,我们观察了其对p-PI3K、p-Akt以及I-κB水平的影响。如图2所示,与正常对照组相比,模型组中p-PI3K和p-Akt水平明显升高,I-κB蛋白的表达显著减少(P<0.01),说明LPS作用后可引起PI3K/Akt信号通路相关蛋白的激活;与模型组相比,榛蘑粗多糖低剂量组中p-Akt蛋白水平明显降低,I-κB蛋白的表达明显增多(P<0.01),阳性对照组和榛蘑粗多糖高剂量组中p-PI3K和p-Akt水平显著降低,I-κB蛋白的表达明显增多(P<0.01)。这就说明,地塞米松和榛蘑粗多糖抑制了LPS所致的PI3K/Akt信号通路的激活。与阳性对照组相比,榛蘑粗多糖低剂量组中p-PI3K、p-Akt以及I-κB的水平有显著差异(P<0.05)。
A-正常对照组;B-模型组;C-阳性对照组;D-榛蘑粗多糖低剂量组; E-榛蘑粗多糖高剂量组(下同)
图2 I-κB蛋白表达以及PI3K和Akt蛋白磷酸化水平
Fig.2 The expression of I-κB protein and the phosphorylation level of PI3K and Akt
如图3所示:与正常对照组相比,模型组中胞核p-NF-κB p65水平明显升高(P<0.01),说明LPS作用后可引起NF-κB p65活化;与模型组相比,阳性对照组和榛蘑粗多糖低、高剂量组中p-NF-κB p65水平明显降低(P<0.01)。说明地塞米松和榛蘑粗多糖抑制了NF-κB p65的磷酸化水平。与阳性对照组相比,榛蘑粗多糖低剂量组中p-NF-κB p65的水平有显著差异(P<0.01)。
图3 胞核NF-κB p65的磷酸化水平
Fig.3 The phosphorylation level of NF-κB P65 in nucleus
ALI是一种炎症反应造成的肺组织病理性损伤[12],其特征为炎症相关介质的释放(如TNF-α、IL-1以及IL-6等)、中性粒细胞过度迁移以及细胞毒性介质的释放[13]。LPS作为细菌外膜的重要组成部分,会对宿主造成损害,包括炎症反应和对组织器官的损伤[14-15]。因此,本实验以LPS作为诱导剂来建立ALI模型。已有研究证明,地塞米松具有明确的抗炎作用,可以改善呼吸氧合功能,减轻LPS引起的大鼠ALI[16]。所以,本实验选择地塞米松作为阳性药物。LPS结合细胞膜上的特异受体,如CD14和TLR4,引发免疫应答。这些受体激活后可引起核转录因子NF-κB p65活化,而NF-κB p65活化后可进一步促进炎症因子(如TNF-α或IL-6)的合成和释放。研究表明,PI3K/Akt通路可调节肺部炎症中细胞存活以及氧化应激,参与ALI过程[4]。
TNF-α与IL-6是炎症过程中重要的细胞因子,参与ALI的炎症反应[17-18]。在LPS诱导的ALI过程中,这些细胞因子可诱导炎症细胞的浸润,加速其病理改变并放大炎症反应[19]。ET-1和TM作为内皮细胞损伤的指标,在ALI时,其水平显著增高[20-21]。因此,本实验中我们同时检测了ET-1和TM的水平。实验结果表明,榛蘑粗多糖抑制了LPS所致的TNF-α、IL-6、TM以及ET-1的合成与释放,减轻了LPS引起的肺组织的病理损伤。
为了进一步探讨其作用机制,我们还检测了PI3K/Akt信号通路和NF-κB p65。NF-κB p65是基因转录的调节因子,它的激活依赖于IKK复合物。在生理状态下,I-κB与NF-κB p50/NF-κB p65结合,处于非活化状态。在多种诱因的作用下IKK复合物可被激活,促使I-κB发生磷酸化而被降解,进一步促进NF-κB p65发生核转移以及在核内的磷酸化,最终促进炎症介质的释放[22-23]。PI3K和Akt是NF-κB上游分子。研究表明,LPS通过TLR4激活PI3K/Akt信号通路,直接诱导原代培养小鼠肺细胞的炎症反应[24]。MENG等的研究结果表明,在大鼠ALI模型中,右美托咪定通过抑制PI3K/Akt信号通路对ALI起保护作用[4],这与我们的实验结果一致。实验结果表明,榛蘑粗多糖对LPS诱导的大鼠ALI的抑制作用可能与PI3K/Akt信号通路相关。
综上所述,榛蘑粗多糖通过对PI3K/Akt信号通路的调控作用对LPS诱导的ALI起保护作用。
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