发酵乳酸甜可口、营养丰富，具有改善人体肠道菌群、减轻乳糖不耐症、抗氧化等多种功能，近年来越来越受到消费者的关注和青睐[1-2]。与牛乳相比，羊乳不仅是重要的大宗乳原料，并且易于人体消化吸收，富含核苷酸、表皮细胞生长因子等多种活性成分[3]。而蜂蜜作为一种营养和保健价值极高的天然食品，在抗氧化、润肠等方面也发挥着重要作用[4-5]。因此，在羊乳中加入蜂蜜可将二者营养和保健功效有机结合，为功能性乳制品开发提供一条新思路。
国内外学者在蜂蜜酸乳研究方面已开展不少工作。ROTAR等[6]研究表明，添加蜂蜜对牛酸乳感官品质、理化性质以及微生物组成有明显影响。PERNA等[7]在牛乳中分别添加板栗和苏拉蜂蜜，板栗蜂蜜酸乳呈现更高的抗氧化活性。王然等[8]则分析了酸浆果蜂蜜牛酸乳贮藏过程中抗氧化活性的变化。HATI等[9]发现，在乳中添加适量蜂蜜可提高酸乳发酵过程中乳酸菌的蛋白水解活性，促进功能活性肽释放。ELENANY[10]则研究了添加不同比例马郁兰蜂蜜对羊酸乳感官、流变学及微生物学特性的影响。整体来看，目前相关研究主要集中于蜂蜜牛酸乳，以羊乳为原料非常少；并且添加蜂蜜时，有些将蜂蜜和其他原辅料一起在发酵前配料阶段加入，有些则基于保留蜂蜜活性成分考虑于发酵结束后才添加。蜂蜜拥有复杂的天然成分，其是否参与乳酸菌发酵过程对酸乳会产生较大影响。然而，尚未发现蜂蜜不同添加方式对酸乳品质及生物活性影响的研究。我国是世界蜂蜜生产和消费大国，枣花蜜是其中极具特色的大宗单花种蜂蜜，拥有浓郁枣花香气和特殊口感，同时较油菜、洋槐等浅色蜂蜜具有更强抗氧化活性[11]。目前也尚未见枣花蜜应用于羊酸乳产品开发的报道。
本文以羊乳为研究对象，分别于发酵前和发酵结束后添加枣花蜜，探究枣花蜜不同添加方式对羊酸乳发酵速度、感官品质、乳酸菌数、持水力、质构特性以及抗氧化活性的影响，以期为加快功能性羊酸乳制品开发、促进蜂蜜及羊乳资源利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枣花蜜于2018年采自陕西佳县，4 ℃贮存待用；生鲜羊乳，宝鸡众羊生态牧业有限公司，验收合格后4 ℃运至实验室；YF-L812乳酸菌发酵剂，丹麦科汉森公司。
蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、琼脂粉,北京奥博星生物技术有限责任公司；酚酞,西安化学试剂厂；NaCl、FeSO4，天津市天力化学试剂有限公司；FeCl3、甲醇，天津市科密欧化学试剂有限公司；2, 2-二苯基-1-苦基-肼基(DPPH)、2, 4, 6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、菲洛嗪(Ferrozine),Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
KQ-250DE数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HH-2电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；Five Easy Plus pH酸度计，梅特勒-托利多仪器有限公司；TGL-20bR高速低温冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；722G可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；TA.XTC通用型质构仪，上海保圣实业发展有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 羊酸乳样品的制备
羊酸乳以及发酵前、后添加枣花蜜的羊酸乳分别按下列工艺流程制备：
(1)羊酸乳(对照)：羊乳→添加白砂糖(质量分数7%)→杀菌(90～95℃/5 min)→冷却(40 ℃以下)→接入YF-L812乳酸菌发酵剂(添加量：0.2 U/kg乳)→发酵(43 ℃)→后熟24 h(4 ℃)→成品
(2)发酵前添加枣花蜜的羊酸乳[以下简称枣花蜜羊酸乳(I)]：羊乳→添加白砂糖(质量分数4%)和枣花蜜(质量分数3%)，混合均匀→杀菌(90～95 ℃/5 min)→冷却(40 ℃以下)→接入YF-L812乳酸菌发酵剂(添加量：0.2 U/kg乳)→发酵(43 ℃)→后熟24 h(4 ℃)→成品
(3)发酵后添加枣花蜜的羊酸乳[以下简称枣花蜜羊酸乳(II)]：羊乳→添加白砂糖(质量分数4%)→杀菌(90～95 ℃/5 min)→冷却(40 ℃以下)→接入YF-L812乳酸菌发酵剂(添加量：0.2 U/kg乳)→发酵(43 ℃)→冷却→机械破乳→添加枣花蜜(质量分数3%)并搅拌混匀→后熟24 h(4 ℃)→成品
1.3.2 感官评价
取出羊酸乳样品，室温条件放置30 min回温，然后由10名人员组成评定小组，从色泽、风味、口感、组织状态4方面对其进行感官评价，评分标准见表1。
1.3.3 滴定酸度测定
参照GB 5413.34—2010中方法[12]测定羊酸乳样品的滴定酸度。
表1 羊酸乳感官评分表
Table 1 Sensory evaluation scale of goat yogurt
项目特征感官得分(共计100分)色泽颜色异常0～5颜色发暗呈黄褐色5～10呈均匀乳白或微黄色,略带枣花蜜色泽10～20风味有蒸煮味等不良气味、膻味重0～5奶香及蜜香味弱,有明显膻味5～10奶香及蜜香味较弱或不协调,无明显膻味10～15奶香及蜜香味饱满协调,基本无膻味15～25口感粗糙有颗粒感、偏酸或偏甜0～10细腻顺滑无颗粒感、偏酸或偏甜10～20细腻顺滑无颗粒感、酸甜适中20～25组织状态稀薄、乳清大量析出0～5较稀薄、乳清少量析出5～10较稀薄、无乳清析出10～15稠厚适中、乳清少量析出15～20 稠厚适中、无乳清析出20～30
1.3.4 乳酸菌数测定
参照GB 4789.35—2016中方法[13]测定保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌活菌数(CFU/mL)，乳酸菌总数为两者之和。
1.3.5 持水力测定
采用离心法测定酸乳持水力。10 g酸乳样品于4 ℃条件下分别在4 000 r/min离心20 min、4 500 r/min离心15 min和5 000 r/min离心10 min，离心完毕后弃上清液，对沉淀物称重。持水力通过公式(1)计算：
(1)
式中，W，样品持水力，%；m1、m2，分别表示离心前、后样品质量，g。
1.3.6 质构特性分析
通过反挤压装置(TA/BE探头)对酸乳样品进行下压测试，分析其硬度、稠度、黏性指数和内聚性。具体参数如下：探头直径40 mm；力量感应元500 g，数据采集频率10次/s；测试方法：单次测试；测试样品温度15 ℃；测前、测中和测后速度分别为0.3、0.3和0.5 mm/s；下压深度15 mm；最小触发力3 g。每种样品平行测定8次，结果以平均值计。
1.3.7 抗氧化活性测定
1.3.7.1 DPPH自由基清除能力测定
参照FENG等[14]的方法并略作修改。10 g样品溶于30 mL甲醇溶液(体积分数80%)，4 ℃下4 000 r/min离心10 min。吸取0.5 mL上清液与4 mL DPPH乙醇溶液(0.1 mmol/L)混匀，用蒸馏水调至10 mL，于室温(25 ℃)下避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度，记为A1。乙醇溶液(体积分数95%)代替上清液作为参比，吸光度记为A0。蒸馏水为空白对照，DPPH自由基清除率根据公式(2)计算：
DPPH自由基清除率
(2)
式中：A0，参比溶液吸光度值；A1，待测样品溶液吸光度值。
1.3.7.2 总抗氧化能力测定(FRAP法)
参照FENG等[14]的方法并略作修改。酸乳样品处理同1.3.7.1。吸取0.5 mL上清液与3 mL TPTZ工作液(0.3 mol/L醋酸盐缓冲液、10 mmol/L TPTZ和20 mmol/L FeCl3按体积比10∶1∶1组成)混匀，37 ℃水浴10 min，于593 nm测定吸光度。以蒸馏水为空白对照，FeSO4(0.05～0.3 mmol/L)制作标准曲线，羊酸乳总抗氧化能力以FeSO4当量表示。
1.3.7.3 Fe2+螯合能力测定
参照杨希等[15]的方法并略作修改。10 g样品溶于30 mL蒸馏水，4 ℃下4 000 r/min离心10 min。吸取4 mL上清液与50 μL FeSO4(2 mmol/L)及0.2 mL Ferrozine(5 mmol/L)混匀，37 ℃水浴30 min，于562 nm测定吸光度，记为A2。蒸馏水代替上清液作为参比，吸光度记为A3。蒸馏水为空白对照，Fe2+螯合率根据公式(3)计算：
Fe2+螯合率
(3)
式中：A3,参比溶液吸光度值；A2，待测样品溶液吸光度。
1.3.8 数据处理与分析
试验重复3次，数据以平均值±标准偏差表示，采用SPSS 19.0软件进行显著性分析，P<0.05表示存在差异显著。
2 结果与分析
2.1 蜂蜜添加方式对羊酸乳发酵速度的影响
酸乳发酵过程中，乳酸菌利用乳糖产生乳酸等有机酸而使发酵体系酸度升高，实际生产中常通过酸度测定来判断酸乳是否达到发酵终点，国标要求酸乳产品滴定酸度≥70 °T[16]。如图1所示，发酵5 h后，发酵前添加枣花蜜的羊酸乳滴定酸度为70 °T，且从外观上观察凝乳状态良好，说明其已达到发酵终点；而此时发酵后添加枣花蜜的羊酸乳和对照羊酸乳仅有60和59 °T，且尚未形成稳固的凝乳体系，继续发酵至6 h，两者滴定酸度才分别达到70和69 °T。这表明，发酵前加入枣花蜜有助于加快物料体系的发酵速度，缩短羊酸乳凝乳时间，提高生产效率。蜂蜜中约含有75%～80%还原糖类且主要是葡萄糖和果糖，先添加枣花蜜再进行发酵，乳酸菌不仅代谢乳中乳糖，还可利用蜂蜜中单糖转化为乳酸，从而促使酸乳酸度升高速度较快[17]。
图1 枣花蜜添加方式对羊酸乳发酵速度的影响
Fig.1 Effect of jujube honey adding methods on fermentation
speed of goat yogurt
2.2 蜂蜜添加方式对羊酸乳感官品质的影响
通过观察酸乳色泽、风味、口感及组织状态，评价枣花蜜添加方式对羊酸乳感官品质的影响。如表2所示，与对照羊酸乳相比，发酵后添加枣花蜜的羊酸乳整体感官得分最高，发酵前添加则使产品感官品质略有下降。枣花蜜是一种气味芳香浓郁的典型琥珀色蜂蜜，2种添加方式均使羊酸乳色泽有所加深，但发酵后添加显著提高产品最终风味和口感，发酵前添加则导致风味略差。这可能是由于蜂蜜中香气成分大多为挥发性物质，在高温时极容易发生损失或破坏，枣花蜜于发酵前添加会参与热杀菌和发酵过程，原有香气成分未能得到较好保留[18]。
表2 羊酸乳感官评定结果
Table 2 Sensory evaluation results of goat yogurt
羊酸乳样品项目评分/分(共计100分)色泽(20分)风味(25分)口感(25分)组织状态(30分)总分(100分)羊酸乳(对照)20.00±0.00c18.00±1.00b22.00±0.50a29.00±0.87b89.00±1.32b枣花蜜羊酸乳(I)18.00±1.32a17.00±0.87a22.00±0.87a27.00±1.50ab84.00±0.50a枣花蜜羊酸乳(Ⅱ)18.00±0.50b24.00±1.00c25.00±0.00b25.00±1.00a92.00±1.80c
注：同一列不同上标字母代表显著性差异(P<0.05)(下同)
2.3 蜂蜜添加方式对羊酸乳乳酸菌数的影响
从表3可以看出，枣花蜜添加方式对羊酸乳中乳酸菌数量有显著影响，对照羊酸乳的乳酸菌活菌数量最高，枣花蜜羊酸乳(Ⅱ)次之，枣花蜜羊酸乳(I)最低，但3种羊酸乳产品均达到国标要求的乳酸菌总数水平(≥1×106 CFU/mL)[16]。枣花蜜于发酵前加入虽促进乳酸菌利用其糖类快速产酸，但蜂蜜中富含的多种天然抗菌成分(包括过氧化氢、甲基乙二醛、酶类、植物源多酚物质、抗菌肽、王浆主蛋白等)会明显抑制乳酸菌增殖[19-20]，从而导致枣花蜜羊酸乳(I)中乳酸菌数量最低。ROTAR等[6]研究蜂蜜枸杞牛酸乳时，同样发现发酵前添加蜂蜜导致酸乳中乳酸菌数明显减少。FENG等[14]研究表明，添加红枣浆的羊酸乳中乳酸菌数量也显著降低, 且红枣浆添加量越大，乳酸菌总数越少，其认为是红枣浆中各种有机酸及多酚成分抑制乳酸菌生长所致。对于发酵后添加枣花蜜羊酸乳，产品活菌数低于对照羊酸乳，则可能是由于发酵期间可利用糖类含量的减少以及后熟期间蜂蜜对乳酸菌抑制作用等因素导致。另外，无论添加枣花蜜与否，羊酸乳中嗜热链球菌数量均略高于保加利亚乳杆菌(表3)。这与张哲源等[21]研究乳固形物含量对羊酸乳中乳酸菌的影响结果一致，认为可能是由于嗜热链球菌较保加利亚乳杆菌具有更高的蛋白水解活性和乳糖利用率所致。
表3 枣花蜜添加方式对羊酸乳乳酸菌数的影响
Table 3 Effect of jujube honey adding methods on the
number of lactic acid bacteria in goat yogurt
羊酸乳样品保加利亚乳杆菌数×10-8/(CFU·mL-1)嗜热链球菌数×10-8/(CFU·mL-1)乳酸菌总数×10-8/(CFU·mL-1)羊酸乳(对照)13.46±0.463c20.49±0.800c33.95±0.142c枣花蜜羊酸乳(I)6.14±0.260a8.91±0.495a15.05±0.448a枣花蜜羊酸乳(Ⅱ)8.48±0.060b11.05±0.372b19.53±0.520b
2.4 蜂蜜添加方式对羊酸乳持水力的影响
持水力可衡量酸乳生产和贮藏过程中乳清析出难易程度，是反映发酵乳品质的重要指标。采用不同外力条件比较羊酸乳产品的持水能力，结果如图2所示。
图2 枣花蜜添加方式对羊酸乳持水力的影响
Fig.2 Effect of jujube honey adding methods on water
holding capacity of goat yogurt
枣花蜜添加与否以及添加方式对羊酸乳持水力有显著影响，枣花蜜羊酸乳(Ⅱ)表现出最佳持水力，羊酸乳次之，而枣花蜜羊酸乳(I)最差。FENG等[14]研究红枣羊酸乳时，发现在发酵前加入红枣浆会导致酸乳产品持水力明显下降。而在发酵结束后添加枣花蜜，枣花蜜成分可能增强了体系对水分子的结合能力，因而产品持水能力增强。
2.5 蜂蜜添加方式对羊酸乳质构特性的影响
质构仪可客观评价不同羊酸乳产品的质构学特性差异。如表4所示，硬度、稠度、内聚性和黏性指数4个物性指标高低均为：羊酸乳>枣花蜜羊酸乳(I)>枣花蜜羊酸乳(Ⅱ)。张哲源等[21]研究表明，羊酸乳质构特性与乳固形物含量呈正相关，发酵前添加枣花蜜的羊酸乳体系中固形物浓度较低，因而其硬度、稠度、内聚性和黏性指数均低于对照羊酸乳；而对于发酵后添加枣花蜜羊酸乳，由于发酵完毕后进行了机械破乳操作，凝乳体系被破坏，故各物性指标均最低。张悦等[22]在比较牛、羊酸乳质构特性时也发现，无论对于牛还是羊酸乳，搅拌型产品的质构指标均显著低于凝固型。
表4 枣花蜜添加方式对羊酸乳质构特性的影响
Table 4 Effect of jujube honey adding methods on texture characteristics of goat yogurt
羊酸乳样品质构特性硬度/g稠度/(g·s)内聚性/g黏性指数/(g·s)羊酸乳(对照)58.25±0.92c565.86±5.62c15.90±0.45c184.81±1.69c枣花蜜羊酸乳(I)33.29±0.31b347.53±2.78b12.45±0.54b108.51±1.75b枣花蜜羊酸乳(Ⅱ)14.25±0.84a133.17±1.30a9.76±0.73a49.62±3.54a
2.6 蜂蜜添加方式对羊酸乳抗氧化活性的影响
在酸乳、奶酪等发酵乳制品生产过程中，乳酸菌水解乳蛋白质释放各种生物活性肽，从而赋予发酵乳制品功能，如抗氧化生物活性[23-24],如表5所示。
表5 枣花蜜添加方式对羊酸乳抗氧化活性的影响
Table 5 Effect of jujube honey adding methods on
antioxidant activities of goat yogurt
羊酸乳样品抗氧化活性DPPH自由基清除率/%FRAP值/(mmolFeSO4·g-1酸乳)Fe2+螯合率/%羊酸乳(对照)24.664±0.001a0.328±0.001a12.010±0.015a枣花蜜羊酸乳(I)27.543±0.014b0.345±0.002c29.216±0.010c枣花蜜羊酸乳(Ⅱ)25.239±0.005a0.335±0.001b20.833±0.012b
与对照羊酸乳相比，枣花蜜羊酸乳的DPPH自由基清除率、总抗氧化能力以及Fe2+螯合率均显著提高(P<0.05)。这可能是由于蜂蜜本身含有丰富的酚酸、黄酮以及类胡萝卜素等抗氧化组分有关[25]。FENG等[14]和熊笑苇等[26]分别在羊乳中加入红枣浆和槐米后进行乳酸菌发酵，同样显著增强了羊酸乳产品的抗氧化能力。另外，发酵前添加枣花蜜羊酸乳的抗氧化活性明显高于发酵后添加，尤其Fe2+螯合率增加近40%，这可能与枣花蜜促进酸乳发酵过程中抗氧化成分的释放有关。此外，前人研究发现，热处理也会促使蜂蜜产生抗氧化物质，从而增强其抗氧化活性[27-28]，因此，杀菌处理也可能是导致发酵前添加枣花蜜羊酸乳抗氧化活性显著增强的重要原因。
3 结论
本文研究了发酵前和发酵结束后2种枣花蜜添加方式对羊酸乳发酵速度、感官品质、乳酸菌数、持水力、质构特性以及抗氧化活性的影响。在发酵前加入枣花蜜，有助于乳酸菌产酸从而缩短羊酸乳凝乳时间，但高温杀菌对蜂蜜香气成分的破坏会导致整体口感稍差；另外，乳酸菌增殖抑制程度较大，持水力明显下降，硬度、稠度、内聚性和黏性指数有所降低，抗氧化活性则显著提高。而在发酵结束后添加枣花蜜，羊酸乳凝乳时间虽无显著变化，但整体风味、口感以及持水能力得到明显提高，乳酸菌增殖抑制程度较小，抗氧化活性有所增强，产品硬度、稠度、内聚性和黏性指数则明显降低。由此可见，蜂蜜的不同添加方式对羊酸乳发酵速度、产品品质以及抗氧化活性具有明显影响，在开发蜂蜜羊酸乳时，要根据产品需求和目标选择合适的蜂蜜添加方式及工艺。
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