金枪鱼又名鲔鱼、吞拿鱼，是一种大洋暖水性洄游鱼类，广泛分布于太平洋、印度洋和大西洋低纬度水域[1]。其肉质鲜美、口感丰富，富含高蛋白低脂肪，具有极高的营养价值，是一种重要的商品食用鱼[2]。金枪鱼从捕获到市场约需要30 d，因此金枪鱼捕获之后的保鲜技术和手段十分重要[3]。镀冰衣保鲜是一种用于冻品贮藏的抗氧化、防止干耗的技术，鱼体冻结后，迅速浸入冰衣液，然后取出，由于鱼体表面过冷，在表面会形成晶莹透亮的冰衣层，以隔绝空气[4]。
冰衣液种类有多种，张越扬等[5]研究了酸性电解水冰衣对金枪鱼的品质影响。结果表明，在-18 ℃的冻藏条件下，酸性电解水冰衣能够显著降低金枪鱼中的细菌总数，减缓TVB-N值的上升。雷雨田等[6]将南美白对虾分别镀上水冰衣和茶多酚冰衣，在-18 ℃下冻藏24周，测定色差、蒸煮损失率和蛋白质的氧化程度，结果表明，茶多酚冰衣组的南美白对虾色泽和蛋白质等指标都显著优于水冰衣组和对照组，但蒸煮损失率指标稍差于水冰衣组。然而，采用单一冰衣液能够显著提升保鲜效果，但效果有限。根据栅栏技术原理，复合冰衣液具有协同效用，能够发挥不同添加剂的保鲜效果，提升保鲜品质。
本文选用了迷迭香酸、乳酸钠和竹叶抗氧化物3种保鲜剂进行复配，以持水力、色差和蛋白质综合评分作为评价指标。在单一镀冰衣对金枪鱼保鲜影响的研究基础上，通过响应面法，探究迷迭香酸、乳酸钠和竹叶抗氧化物3种保鲜剂的最佳配比浓度，并测定相关指标对保鲜效果进行验证，为金枪鱼复合镀冰衣保鲜的进一步研究提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料和仪器
实验采用捕捞后超低温速冻后的大目金枪鱼鱼块，大连晨洋科技发展有限公司；迷迭香酸(迷迭香提取物主要成分)，生工生物工程(上海)股份有限公司；乳酸钠(食品级)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；竹叶抗氧化物(食品级)，浙江圣氏生物科技有限公司。
H-2050R 型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Kjeltec 8400 FOSS 全自动凯氏定氮仪，福斯分析仪器(苏州)有限公司；CR-400型色彩色差计，日本柯尼卡美能达公司；UV-1102型紫外可见分光度计，上海天美仪器有限公司。
1.2 实验方法
配制相应浓度的冰衣液，并加入质量分数为1%的增稠剂(羧甲基纤维素钠)防止冰衣开裂。将大小均匀、超低温冻藏的金枪鱼鱼块，置于配制好的4 ℃冰衣液中，完全浸泡10～15 s进行镀冰衣处理。在-18 ℃下冻藏30 d后，采用静止水解冻，测定持水力、色差和盐溶性蛋白含量。
1.2.1 单因素实验
分别配制迷迭香酸冰衣液(质量分数分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)、乳酸钠溶液(质量分数分别为1%、2%、3%、4%)、竹叶抗氧化物(质量分数分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)进行单一镀冰衣实验。
1.2.2 响应面法优化复合冰衣液配比
根据单因素实验结果，以迷迭香酸冰衣液、乳酸钠冰衣液、竹叶抗氧化物冰衣液质量分数3个因素为自变量，以持水力、色差值和盐溶性蛋白含量总评分作为响应值，进行3因素3水平响应面实验，并对实验结果进行验证。
1.2.3 保鲜结果验证及分析
参照实验结果，采用最佳配比复合冰衣液对金枪鱼进行镀冰衣处理，贮存6个月后测定持水力、蒸煮损失、色差、盐溶性蛋白含量、TVB-N指标，与对照组进行对比分析，验证保鲜效果。
1.2.4 指标测定
1.2.4.1 持水力
参照SAITO等[7]的方法并稍作修改，鱼肉解冻后，用滤纸擦干表面的水分，称取2.00 g左右的肉块记为m1，用2层纸包好置于离心管中，5 000 r/min，4 ℃离心10 min，精确称量离心后的肉块质量记为m2，按公式(1)计算持水力。
(1)
1.2.4.2 色差
将解冻后的金枪鱼鱼肉切块(规格1 cm×1 cm× 2 cm)，采用色差仪测定正反两面色差值，每面测定2次，采用红度值(a*)作为肉色变化的判定依据。每次实验进行3次取平均值减小误差。
1.2.4.3 盐溶性蛋白质溶解度
参考NIU等[8]的方法测定。
1.2.4.4 蒸煮损失率
参照LI等[9]的方法并稍作修改，取1 cm×1 cm×1 cm的鱼肉，称重记为m2，放置于拉链袋中，85 ℃下水浴10 min后称重记为m3，蒸煮损失率按照公式(2)计算：
(2)
1.2.4.5 TVB-N值的测定
参考GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》[10]中的分析方法进行测定。
1.2.5 评分
为了综合评价金枪鱼的新鲜程度，本文采用熵权法对持水力、色差和蛋白质计算权重，计算总评分。熵权法是一种客观赋权法，利用信息熵计算各指标的权重，能够正确反映各指标的相互重要程度。熵值法求指标值包含归一化处理，因此不需要对数据进行归一化预处理[11]。信息熵按照公式(3)计算，其中m表示指标数，n表示数据组数，Y表示指标的值，Ej表示该指标的信息熵。
(3)
式中
(4)
根据公式(5)计算各指标的权重Wj。
(5)
熵表示系统的无序程度，信息熵代表了信息的不确定度。指标的信息熵越小，该指标提供的信息量越大，在综合评价中所起作用越大，计算权重越高，反之计算权重就越低。熵权法计算指标权重按照公式(3)～(5)依次进行计算。
1.3 数据处理方法
通过Design-Expert 10.0.7软件进行分析，绘制响应曲面图，得到复合冰衣液最佳浓度配比。其他图形采用Origin Pro 2016绘制。
2 结果与分析
2.1 单因素实验
采用单一镀冰衣的实验方法，将金枪鱼在-18 ℃贮藏30 d后，分别测定其持水力、色差和盐溶性蛋白含量，并采用熵权法进行权重计算。金枪鱼鱼块的持水力、色差和盐溶性蛋白质含量的权重值分别为0.14、0.43和0.43,总评分如图1所示。
图1 单一镀冰衣实验结果
Fig.1 Experimental results of single ice coat
迷迭香酸是迷迭香的主要提取物之一，通过清除自由基和金属离子而具有一定的还原能力，具有抗氧化的作用[12]。在迷迭香酸镀冰衣组别中，采用0.2%迷迭香酸镀冰衣后的金枪鱼盐溶性蛋白含量最高，色差值和持水力也较好，总评分最高。SHI等[13]采用质量分数0.2%迷迭香提取物对虾镀冰衣冻藏保鲜，也具有最好的效果。乳酸钠能够抑制食物细菌生长，增强风味，延长货架期，广泛应用于食品工业[14]。采用3%乳酸钠镀冰衣后的金枪鱼总评分与质量分数2%乳酸钠差距不大，盐溶性蛋白含量明显高于质量分数2%的乳酸钠冰衣组。竹叶抗氧化物是一种天然抗氧化剂，富含黄酮、内酯和酚酸类化合物，具有抗脂质氧化、抑菌的作用。随着竹叶抗氧化物浓度的提高，镀冰衣处理后的金枪鱼，蛋白含量逐渐下降并趋于平稳，色差值差距不大，其中质量分数0.1%竹叶抗氧化物冰衣液评分最高。
2.2 采用响应面法优化金枪鱼复合镀冰衣配比
2.2.1 复合镀冰衣配比实验方案和因素水平
根据单因素实验结果，利用Box-Behnken中心组合实验设计原理，采用3因素3水平的响应面分析法设计实验，实验因素水平设计如表1所示。
表1 Box-Behnken实验设计因素和水平 单位：%
Table 1 Box-Behnken experimental design factors
and levels
因素水平-101A迷迭香酸0.10.20.3B乳酸钠234C竹叶抗氧化物0.050.10.15
2.2.2 响应面分析
具体响应面实验方案与结果如表2所示(由Design-Expert 10.0.7软件生成)，实验共17个实验点，13～17为中心实验点，中心实验点的实验误差较小，均值是20.81，符合实验要求。
对表2中的实验数据进行多元回归拟合后，得A迷迭香酸、B乳酸钠和C竹叶抗氧化物浓度对总评分Y影响的二次多项回归模型。
表2 Box-Behnken试验设计方案及结果
Table 2 Box-Behnken experimental design scheme and
results
实验组别A迷迭香酸B乳酸钠C竹叶抗氧化物评分1-1-1018.7521-1018.073-11019.43411020.985-10-119.30610-118.087-10118.67810121.0290-1-116.851001-119.77110-1119.221201118.471300021.021400021.021500020.641600020.811700020.61
Y=20.82+0.25×A+0.72×B+0.42×C+
0.56×A×B+0.89×A×C-0.92×B×C-0.41A2-
1.10×B2-1.41×C2
(6)
2.3 模型显著性检验
模型的方差分析结果如表3所示。总模型方差显著(P<0.05)，模型拟合相关度97.71%。方差失拟项F值不显著(P=0.1094>0.05)。该二次回归模型与实际实验拟合较好，适合复合冰衣液对金枪鱼新鲜度影响的预测。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Anovariance analysis of regression model
方差来源平方和自由度均方F值P值模型26.2292.9133.24<0.000 1A0.5010.505.750.047 6B4.1314.1347.160.000 2C1.4311.4316.270.005 0AB1.2411.2414.130.007 1AC3.1713.1736.210.000 5BC3.3813.3838.550.000 4A20.7210.728.170.024 4B25.1015.1058.220.000 1C25.4615.4662.29<0.000 1残差0.6170.088失拟项0.4630.153.940.109 4纯误差0.1640.039总误差26.8316
由表3中可以看出，迷迭香酸、乳酸钠和竹叶抗氧化物质量分数对总评分影响均显著(P<0.05),且任意2种因素对响应值存在显著的交互作用(P<0.05)。各个因素对实验结果的重要性由F值的检验判定，概率P值越小，显著性越高[15]。由表3可知各个因素对金枪鱼新鲜度的影响大小为：乳酸钠>竹叶抗氧化物>迷迭香酸。
2.4 响应曲面分析及最佳复合冰衣液配比
利用Design-Expert 10.0.7软件绘制的模型的三维响应值曲面可以直观看出各因素对响应值的影响。
a-迷迭香酸和乳酸钠;b-迷迭香酸和竹叶抗氧化物;c-乳酸钠和竹叶抗氧化物
图2 迷迭香酸、乳酸钠和竹叶抗氧化物交互作用对总评分的影响
Fig.2 Response surface for the mutual influences of rosmarinic acid， sodium lactate and antioxidants in bamboo leaves on total score
迷迭香酸具有清除羟自由基的能力，浓度越高，清除能力越强[16]。由图2-a可以看出，随着迷迭香酸浓度的增加，总体评分上升，当乳酸钠处在编码范围值(-1,0)时，两者存在显著的增效作用，当乳酸钠处在编码范围值(0,1)时，总评分下降，这是因为乳酸钠是一种弱酸盐，高浓度的乳酸钠会导致蛋白质变性[17]。竹叶抗氧化物富含黄酮类、内酯类和酚酸类化合物，能阻断脂肪链自动氧化的链式反应，清除多种活性氧自由基，但竹叶抗氧化物颜色呈现黄色或棕黄色，浓度过高对色差造成一定影响，因此当竹叶抗氧化物浓度过高时也会造成评分下降。三维响应面图在底面投影成等高线图，可以反映出每2个因素对响应值变量造成的影响和交互作用的强弱。等高线图呈椭圆形表示交互作用强，呈圆形表示交互作用较弱[18-19]。由图2等高线可以看出乳酸钠与迷迭香酸和竹叶抗氧化物结合具有很强的协同作用。通过对回归方程的求导和分析，复合冰衣液的最佳成分配比是迷迭香(0.3%)、乳酸钠(3.4%)和竹叶抗氧化物(0.12%)，此时金枪鱼复合镀冰衣的效果最好，预测评分为21.19分。
2.5 复合冰衣液对金枪鱼镀冰衣保鲜效果验证
2.5.1 保水性评定结果
金枪鱼鱼肉中的水分含量与金枪鱼蛋白质、色泽、质构等紧密相关，蒸煮损失和持水力的变化是衡量金枪鱼新鲜度的重要指标[20-21]。表4显示了金枪鱼复合镀冰衣和对照组贮藏6个月保水性的变化，可以看出复合镀冰衣的金枪鱼持水力下降远远慢于对照组。随着贮藏时间延长，持水力下降趋势变快，蒸煮损失的整体变化不大，这是由于冻藏过程中盐溶性蛋白变性，破坏了蛋白质周围疏水与亲水结合键，导致蛋白质持水力的下降和鱼肉保水性的丧失[22]。
表4 复合镀冰衣对金枪鱼保水性的影响 单位：%
Table 4 Effect of compound ice coating on water retention of tuna
月份0123456持水力对照组82±1.6081±2.977±2.172±1.366±1.159±1.451±4.5复合镀冰衣83±1.583±3.980±6.078±1.476±3.269±1.966±2.4蒸煮损失对照组22±0.431±1.830±2.828±4.330±2.528±2.033±3.5复合镀冰衣24±3.224±1.327±1.028±2.124±0.625±0.426±2.4
2.5.2 盐溶性蛋白含量的变化
盐溶性蛋白作为金枪鱼肌肉组织中主要成分，是评判肌肉品质好坏的重要指标[23-24]，如图3所示。在冻藏过程中，由于冰晶的机械作用，导致肌原纤维蛋白破坏，盐溶性蛋白含量下降，盐溶性蛋白含量的变化能够反映出蛋白质的变性程度[25]。在冻藏过程中，对照组由于直接与空气接触，盐溶性蛋白变性严重。复合镀冰衣具有抗氧化作用，相较于对照组蛋白质下降速度较慢，6个月后下降为26.5 mg/g。
图3 复合镀冰衣对盐溶性蛋白的影响
Fig.3 Effect of compound ice coating on salt soluble protein
2.5.3 色差的变化
贮藏期间金枪鱼复合镀冰衣和对照组的色差变化如图4所示。新鲜金枪鱼呈鲜红色，在贮藏期间由于氧化作用，肌红蛋白会被氧化成高铁肌红蛋白，导致鱼肉褐变，红度值变化[26]。随着镀冰衣贮藏时间的延长，金枪鱼肉色(a*值)呈下降趋势，复合镀冰衣处理后的金枪鱼下降比对照组慢。6个月后，复合镀冰衣组和对照组a*值分别下降至6.2和4。对照组的金枪鱼由于高铁肌红蛋白中含有的Fe3+在鱼肉中沉积，鱼肉褐变明显[27]。
图4 复合镀冰衣对色差的影响
Fig.4 Effect of compound ice coating on color difference
2.5.4 挥发性盐基氮(TVB-N)的变化
在鱼肉贮藏过程中，由于鱼体内部细菌和内源酶的作用，蛋白质在分解过程中会生成含氮物质，即TVB-N[28]。对金枪鱼TVB-N值的测量，能够反映出金枪鱼的腐败程度，新鲜鱼的TVB-N值在12 mg/100 g左右[29]。当海水鱼的TVB-N值>30.0 mg/100 g时，即可认为不新鲜[30]。由图5可以看出，复合镀冰衣处理后的金枪鱼TVB-N值上升明显较对照组缓慢，贮藏6个月后，对照组金枪鱼TVB-N值增加到22.37 mg/100 g，复合镀冰衣组TVB-N增加18.29 mg/100 g。这是由于复合镀冰衣中富含的乳酸钠对细菌具有抑制作用，减缓TVB-N增加。在贮藏初期，TVB-N的值上升较慢，是因为贮藏前期鱼体内源酶活性较低，微生物数量较少，随着内源酶活性增强和微生物数量逐渐增加，TVB-N值在贮藏后期迅速上升[19]。
图5 复合镀冰衣对TVB-N的影响
Fig.5 Effect of compound ice coating on TVB-N
3 结论
本实验在单因素试验的基础上，选取合适的浓度范围，采用Box-Behnken响应面分析法对金枪鱼冰衣液进行复配，对实验数据进行拟合，总模型方差显著(P<0.05)，与预测值均无显著性差异。迷迭香酸和乳酸钠具有明显的交互作用。根据得到的最佳配比(迷迭香酸质量分数0.2%，乳酸钠质量分数3.4%，竹叶抗氧化物质量分数0.12%)，并对结果进行了验证。实验表明，采用最佳配比复合镀冰衣后的金枪鱼具有更好的持水力、盐溶性蛋白和色差值，能够显著减少金枪鱼肉色褐变，减缓TVB-N增加。迷迭香酸、乳酸钠、竹叶抗氧化物之间具有很强的协同作用，采用最佳配比的复合镀冰衣能够保持金枪鱼的新鲜度，延长金枪鱼的货架期。
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