单-双酶法提取的苏麻多肽的呈味及氨基酸分析

苏麻(Perilla frutescens Britt．var．frutescens)为唇形科紫苏属1年生草本植物，是一种优质的药食两用特色植物资源[1]。苏麻籽脱脂后的副产品——苏麻饼粕味道芳香、适口性好、杂质少，含有丰富且较全面的必须氨基酸，营养价值高，且与菜籽饼粕和棉籽饼粕相比不存在对人体健康不利的物质和有毒成分，具有很高的功效比、净蛋白比和真消化率。根据氨基酸平衡理论得出苏麻粕中有效蛋白水平较菜籽粕高,接近豆粕，是一种优质的植物蛋白资源[2]；其粗蛋白含量达28%～45%[3-4]，同时含有丰富的Mg、Fe、Zn、Mn、Cu等矿物元素，不含重金属Pb，可用作食用或饲用添加剂[5-6]。目前苏麻饼粕主要被用作饲料、肥料、燃料，有少量用于面包[7]、调味料[8]，粕中的功能和营养成分没有得到充分合理利用。近年有一些关于利用其提取苏麻蛋白、多糖[9]、迷迭香酸、黄酮[10]和植酸[2]等成分的报道。亦有少量利用单一酶水解苏麻蛋白质或通过微生物发酵[11]提取功能小肽的研究，主要验证了苏麻多肽具有抗氧化[13-15]、抗菌[16]和抗癌[17]等多种功能特性，是一种具有很大开发价值的植物多肽天然产物。但对苏麻饼粕多肽的呈味特征及氨基酸组成和含量分析的研究鲜见报道。

实验以3种不同酶解方法提取的苏麻饼粕多肽为研究对象，以SA402B型味觉分析系统对其进行呈味特性表征，并与市售鸡精和味精进行综合分析。以L-8800型氨基酸自动分析仪测定样品中氨基酸情况，并综合分析其氨基酸组成及含量、营养、功能与呈味特性之间的关联，旨在探究苏麻饼粕酶解多肽中呈味及氨基酸组成和含量情况，一方面为该苏麻多肽的研究和应用提供理论参考，另一方面也为进一步提升苏麻饼粕附加值，扩大其在食品或保健品领域的应用提供数据依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂苏麻饼粕粉(蛋白含量41.21%)，实验室自制；碱性蛋白酶(48 349 U/g)、胰蛋白酶(37 790 U/g)，Sigma公司；日本WAKO 17种氨基酸混合标样，日立氨基酸分析仪专用试剂； L-(+)-酒石酸(99%)，上海麦克林生化科技有限公司；鸡精和味精，市售；优级盐酸、5-磺基水杨酸、KCl等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AR224CN型电子分析天平，美国OHAUS仪器有限公司；HH系列数显恒温水浴锅，江苏科析仪器有限公司；101-2A型烘箱，天津市泰斯特仪器有限公司；L-8800 氨基酸自动分析仪，HITACHI(日立)公司；SA402B型味觉分析系统及其配套工作站，配备酸味(CAO)、苦味(COO)、咸味(CTO)、鲜味(AAE)和涩味(AEI)5个传感器，日本INSENT公司。

1.3 苏麻饼粕多肽的单-双酶提取

采用碱性和胰蛋白酶单酶提取，料液比均为3%质量比，酶底比分别为5%和7%，pH值分别为9.5和8.0，50 ℃酶解6 h。双酶提取，料液比5%(g∶mL)，55 ℃条件下，在pH 8.0条件下先加3.5%的胰蛋白酶酶解3 h，调节pH值为9.5,再利用3.5%碱性蛋白酶酶解3 h。冷冻干燥得3种苏麻多肽粉，对应编号为A，B和C，备用。

1.4 苏麻饼粕多肽呈味分析

1.4.1 样品预处理

称取3种苏麻多肽于蒸馏水中各配制100 mL质量浓度为0.02 g/mL的多肽溶液，同时配制相同质量浓度的鸡精和味精溶液作为对照，编号后待味觉分析系统检测。

1.4.2 味觉分析系统数据采集

取40 mL上述样液于2个专用测量杯中，采用味觉分析系统测定相关数据。为确保数据稳定可靠，测定前对系统进行探头活化、自检、校准和诊断等步骤，通过5个传感器对每种样品采集5次数据，取后3次计算均值。

电子舌检测条件：采用2步清洗法，清洗溶剂90 s，清洗溶剂120 s，清洗溶剂120 s，调节溶剂30 s，样品液30 s，清洗溶剂3 s，清洗溶剂3 s，CPA 溶液 30 s。

1.5 苏麻饼粕多肽中氨基酸组成及含量测定

1.5.1 样品预处理

参照GB/T 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》。称取100 mg多肽样品于水解管中，用15 mL 6 mol/L优级盐酸溶液充分润湿，混匀抽真空充氮3次后封管，置于(110±1)℃的恒温干燥箱中水解22 h，取出冷却至室温，摇匀过滤，将水解液转移、洗涤并定容到50 mL，取1 mL于15 mL容量瓶内，于60 ℃恒温水浴中蒸干，用1 mL pH 2.2的缓冲液溶解过滤即可上机分析。

1.5.2 样品的氨基酸测定

将上述待测样于L-8800型全自动氨基酸分析仪中检测。检测条件：分析周期60 min，分离柱温57 ℃、柱压7.3 MPa，反应柱温135 ℃、柱压0.8 MPa、进样0.05 mL、仪器配套洗脱液流速0.4 mL/min，检测波长为570 nm(脯氨酸为440 nm)。

1.5.3 饼粕多肽氨基酸分析

(1)氨基酸质量分数

必需氨基酸(essential amino acids，EAA)含量与氨基酸总量(total free amino acids，TAA)之比(E/T)和必需氨基酸与非必需氨基酸(nonessential amino acids，NEAA)之比(E/N)按公式(1)和(2)计算。

氨基酸评分(amino acid score，AAS)用于评价蛋白质的营养价值，能够反映食物蛋白质与人体蛋白质构成模式的接近程度[18]；是将被测食物蛋白质的必需氨基酸组成与国际上推荐的参考蛋白质氨基酸模式进行比较，AAS值越接近100%，表明与推荐模式氨基酸组成越相近，营养价值就越高，比值较低者为该蛋白质的限制氨基酸。按公式(3)计算。

式中：W1,1 g待测苏麻多肽中某种氨基酸含量,mg/g;W2,FAO/WHO评分模式同种氨基酸含量,mg/g。

(3)呈味氨基酸呈味特征及占比分析

呈味氨基酸(delicious amino acids，DAA)分鲜、甜、苦3类氨基酸，氨基酸的呈味与其侧链R基团的疏水性有密切关系。当氨基酸的疏水性较小时，主要呈甜味，疏水性较大时呈苦味，侧链R基团为酸性基团(如COOH、SO3H)时则呈鲜味，DAA含量对苏麻多肽的口感滋味有重要作用，按公式(4)计算。

1.6 数据统计与分析

实验均设置3组平行，数据采用Excel和SSPS 20.0软件进行数据处理和统计分析，以Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 单-双酶法制备的苏麻多肽呈味特性分析

滋味是影响品质的重要因子，是感官品质中最重要的特征[19]。味觉分析系统可模拟人的味觉系统将味觉指标数值化，对不同的味觉给出客观的相对评价，近年来在诸多领域应用广泛。鉴于实验提取的3种苏麻饼粕多肽滋味鲜美，口感独特，故选用味觉分析系统对其进行测定分析，并与市售鸡精和味精对比研究，所得味觉响应值如表1所示。

注：A-碱性蛋白酶提多肽；B-胰蛋白酶提多肽；C-双酶提多肽(下同)。同列小写字母不同代表差异显著(P<0.05)

由表1可知，味觉分析系统的酸、涩、咸和鲜味传感器对样品中某些成分含量敏感度高，有较好区分度。经不同酶提取的肽均具有一定的鲜味响应值，这与实际品尝得出的多肽鲜味突出结果一致，且与李荣等[20]的研究相符。可见由蛋白酶酶解制备的苏麻多肽中含有能提升风味且增强或产生鲜味的鲜味肽或氨基酸。味精和由碱性蛋白酶提取的多肽的鲜味值不存在显著性差异(P>0.05)，且鲜味值按大小顺序排列为碱性蛋白酶提多肽>鸡精>双酶提多肽>胰蛋白酶提多肽鲜味值；碱性蛋白酶提多肽酸味显著高于其他(P<0.05)，而咸味值最低，丰富度仅次于双酶提多肽；胰蛋白酶提多肽酸味和鲜味值较低，但其丰富度与鸡精和味精不存在显著性差异(P>0.05)；双酶提多肽丰富度和咸味显著高于其他(P<0.05)，苦味值和鲜味值较另外2种多肽低。不同蛋白酶提多肽呈味存在差异性，可能是因为酶的切割位点不同，产生了不同的呈味肽及氨基酸。

聚类分析法(cluster analysis，CA)是根据物以类聚原则，将相似程度较高的样本聚合，类内相似性大，以区分不同类之间的差异，实现对数据的分类[21]。主成分分析法(principal component analysis，PCA)是通过数据降维，将多个变量转为综合变量，使降维后的综合因子尽可能地反映原始变量的结构特征信息，并对其进行线性分类。PCA图上的距离表征不同样品间品质差异，距离越近表明品质特征越相似。将肽样和对照样的味觉分析所得7个响应值以欧氏距离做聚类分析，并对其进行PCA分析，结果如图1所示。

由聚类分析图1-a得出，3种多肽和鸡精、味精可分为两大类。胰蛋白酶提多肽的滋味与鸡精最相近，其次与味精比较相近，归为一类；另外是碱性和双酶提多肽为一类。根据主成分三维分析图1-b得出，PC1(38.5%)、PC2(27.0%)和PC3(17.7%)的贡献率达83.22%，能够反映样品的真实信息，且平行测定数据基本集中在同一区域，而不同样品分布于不同空间位置。其中胰蛋白酶提多肽与鸡精距离最近，其次是和味精距离较近，三者空间分布距离较近。而碱性蛋白酶和双酶提多肽则分布于距离较远的空间位置，说明3种苏麻饼粕多肽中与鸡精、味精滋味差异较小的是胰蛋白酶提多肽，这与聚类分析结果一致。这可能是因为经碱性蛋白酶和双酶提取的多肽酸味值和丰富度较大，可见样品滋味受多种味觉互相影响，而味觉值与其中所含物质种类和含量密切相关。

2.2 苏麻多肽的氨基酸组成和含量分析

氨基酸的组成与含量是苏麻饼粕多肽营养价值的重要指标。同时，饼粕蛋白肽的滋味除了与肽链长度有关外，还与氨基酸组成和排列有关[22-24]。氨基酸呈味具有能力强、阈值低等特点，其种类和含量对整体风味有较大影响[25]。因此氨基酸分析能够进一步了解氨基酸的组成与含量，更好地解释其呈味特征。实验对3种苏麻多肽样中氨基酸的组成和含量测定结果如表2所示。

表2 苏麻饼粕多肽的氨基酸组成与含量

注：“-”表示未检出；#为药效氨基酸； HAA:Met、Phe、Val、Leu、Ile、Pro、Ala； PCAA:Arg、Lys、His

氨基酸是组成蛋白质的基本单位，不同的氨基酸为人体的营养健康发挥着多种重要功能。由表2可知，苏麻饼粕多肽的氨基酸组成全面，且必需氨基酸含量丰富。除了未检测到的色氨酸外，经碱性、胰蛋白酶单酶和双酶提取的苏麻多肽中分别检测出17、15和16种氨基酸，其中氨基酸总量分别为153.95、74.88和93.00 mg/g，含量最多的氨基酸均为Glu，占氨基酸总量的(22.34±0.30)%，是氨基酸中最重要的鲜味剂。刘盼盼等[19]研究也表明，Glu与鲜味强度显著正相关，与苦味强度呈负相关，这与电子舌检测结果一致。而含硫氨基酸(Cys和Met)较少甚至没有，这与刘大川等[28]、谢超等[3]的蛋白质测定结果一致。尽管Ser、Thr和Tyr在酸水解处理中会有一定程度的破坏,测定值偏低，但苏麻饼粕多肽E/T和E/N分别达(32.86±0.75)%和(48.95±1.68)%。根据FAO/WHO提出的理想模式，蛋白质氨基酸组成E/T在40%左右而E/N在60%以上即可说明蛋白质质量较好，由此可见，苏麻饼粕多肽接近理想模式，完全可与其他蛋白质稍微配合即达理想要求。3种多肽中均含有丰富的Glu、HAA、PCAA和药效氨基酸，分别占总氨基酸的(22.34±0.30)%、(32.22±1.16)%、(17.20±0.72)%和(68.42±1.12)%。药效氨基酸种类多且含量丰富，有研究表明，HAA和Glu残基、PCAA和HAA分别在肽的抗血栓和抗炎活性方面起重要作用[29]，由此可以推断苏麻多肽可能具有较好的抗血栓和抗炎活性，这与姜文鑫等[16]、贺东亮[30]的研究结果一致，说明苏麻饼粕多肽除了营养价值外可能还具有一定的药用功能价值。

3种苏麻饼粕多肽中的氨基酸组成比例基本一致，而含量较多的是碱性蛋白酶提多肽，其中含有丰富的Glu、Arg、Asp和Leu等氨基酸。查阅文献[31]发现Glu、Arg和Gly等这类氨基酸摄入后可调节体内氨基酸的吸收，保证蛋白质的营养均衡[31]。Asp可转化为Lys、Thr、Ile和Met四种必需氨基酸，利于改善和增强心肌和肝脏功能；Glu有利于保护肝脏、改进和维持脑功能，具有非常高的营养价值及生理功能[32]。支链氨基酸中的Leu、Ile和Val等除了给人体提供营养、促进肌肉增长、减少脂肪外，还能防止肌肉分解、预防和减轻中枢疲劳等作用。可见由碱性蛋白酶制备的苏麻多肽中的氨基酸可为人体提供能量和营养。

不同蛋白酶酶解制备的苏麻多肽氨基酸在组成含量上存在一定差异，这可能是因为蛋白酶的专一性决定其催化作用位点不同，而作用部位因肽键种类而异。胰蛋白酶只能水解苏麻蛋白肽链内部肽键从而产生各种短肽，切开点是羧基侧为碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸)的肽键，而碱性蛋白酶的切开点是羧基侧为疏水性芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)的肽键，产生小分子的肽或氨基酸，它能在胰蛋白酶水解的肽段基础上继续降解，进一步生成多肽、寡肽、氨基酸。故双酶提多肽中氨基酸含量及组成与胰蛋白酶差异较大。

2.3 苏麻多肽的氨基酸评分

为进一步对苏麻多肽进行营养评价，将苏麻多肽中的必需氨基酸组成与高F值(支链氨基酸与芳香族氨基酸的比例)低聚紫苏肽[33]、紫苏分离蛋白[34]、目前公认的作为优质氨基酸来源的大豆分离蛋白[35]和FAO/WHO推荐成年人人体必需氨基酸模式[36]进行比较分析，各蛋白质必需氨基酸组成及最终AAS结果如表3所示。

由表3可知，利用碱性蛋白酶和双酶提取的苏麻多肽中必须氨基酸含量较紫苏分离蛋白中的氨基酸含量低，却比前人用双酶分步水解法从紫苏粕中提取的高F值低聚紫苏肽高；虽与大豆蛋白和FAO/WHO推荐模式相比较仍存在差距，但对比紫苏分离蛋白与大豆分离蛋白中必需氨基酸发现，紫苏分离蛋白非常接近大豆分离蛋白，可见其价值所在，这为进一步开发、利用苏麻饼粕功能肽提供依据。对比3种苏麻饼粕多肽、高F值低聚紫苏肽和紫苏分离蛋白的AAS，发现赖氨酸为苏麻多肽的第一限制必须氨基酸，这与大多数谷物食品中第一限制氨基酸为赖氨酸的事实相符。在利用苏麻多肽时可与其他食品调配，以达到针对性地补充和强化氨基酸成分的目的。

2.4 苏麻多肽的呈味氨基酸分析

不同的氨基酸具有不同的滋味，直接反映出食物味道及鲜美程度。对苏麻多肽中鲜/酸、甜、苦味氨基酸进行分析[27, 37]，得苦味氨基酸8种，鲜/酸味2种，甜味6种。苏麻多肽的滋味除受DAA绝对含量的影响外，还受各种氨基酸之间存在的多种关系的影响，因此各类DAA之间的相对平衡也很重要。

由表4可知，尽管3种苏麻多肽所含氨基酸总量存在差异，但其DAA基本一致。其中Asp和Glu是苏麻多肽中最主要的鲜味氨基酸，占TAA的(31.74±0.16)%，甜味氨基酸在苏麻多肽中氨基酸总量中占(28.01±0.91)%。当然除自身提供大部分令人愉悦的清香鲜甜味外，还存在(40.10±0.94)%的苦味氨基酸。从氨基酸水平来看，苏麻多肽样品的整体滋味以鲜甜为主，苦涩味为其补充。具有增强其原有风味的呈味肽对苏麻饼粕多肽滋味也会产生一定的影响。

3 结论

本研究采用SA402B型味觉分析系统和L-8800 氨基酸自动分析仪对3种通过单-双酶提取的苏麻饼粕多肽的呈味特征及其氨基酸组成和含量进行测定研究。得出如下结论，

1)3种苏麻饼粕多肽中鲜甜味氨基酸占氨基酸总量的60%，均表现出令人愉悦的清香鲜甜滋味特征；且基于电子舌测定数据的聚类和主成分分析表明胰蛋白酶提多肽的滋味特征与鸡精更相近。

2)由不同酶法提取的苏麻饼粕多肽中氨基酸总量存在差异，碱性蛋白酶提多肽含量显著较高(P<0.05)，但3种多肽氨基酸比例协调一致，组成全面且含量丰富，必需氨基酸占总氨基酸的(32.86±0.75)%，接近FAO/WHO提出的理想蛋白模式，接近人体氨基酸比例。

3)苏麻饼粕多肽中含有丰富的Glu、Arg、Leu、HAA、PCAA等营养、功能或药效氨基酸，这与苏麻多肽多种生物活性密切相关，其第一限制氨基酸为赖氨酸，食用时建议搭配赖氨酸含量高的食品为互补。

综上，苏麻饼粕蛋白是一种优质植物蛋白质资源，苏麻饼粕多肽滋味口感好，营养价值高，可能具有一定的药用价值，是一种具有较大开发价值的天然产物活性肽。

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